-尺 原創(chuàng)性聲明 本人鄭重聲明：所呈交的學(xué)位論文，是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下，獨(dú) 立進(jìn)行研究所取得的成果。除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，本論文不 包含任何其他個人或集體己經(jīng)發(fā)表或撰寫過的科研成果。對本文的研 究作出重要貢獻(xiàn)的個人和集體，均己在文中以明確方式標(biāo)明。本聲明 的法律責(zé)任由本人承擔(dān)。 論文作者簽名：拋日期：絲臣：巧 關(guān)于學(xué)位論文使用授權(quán)的聲明 本人完全了解山東大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，同意學(xué) 校保留或向國家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版，允許論 文被查閱和借閱；本人授權(quán)山東大學(xué)可以將本學(xué)位論文的全部或部分 內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或其他復(fù)制手段 保存論文和匯編本學(xué)位論文。 ( 保密論文在解密后應(yīng)遵守此規(guī)定) 論文作者簽名：擲導(dǎo)師簽名：2 墨墼日期：主型型 一 目錄 摘要i a b s t r a c t i l l 符號說明v 第l 章緒論1 第一節(jié)核酸熒光和共振光散射探針的研究進(jìn)展l 1 核酸熒光探針1 2 核酸共振光散射探針。3 第二節(jié)蛋白質(zhì)熒光探針的研究進(jìn)展5 1 近紅外熒光探針5 2 有機(jī)染料探針6 3 稀土離子和稀土離子絡(luò)合物熒光探針6 4 熒光衍生化試劑6 第i 節(jié)納米粒子在生物火分子分析中的應(yīng)用6 1 貴金屬納米粒子。7 2 發(fā)光量子點(diǎn)lo 3 有機(jī)高分子納米微球1 l 4 熒光納米球乳液。l l 5 上轉(zhuǎn)換納米粒子1 2 6 大分子納米粒子l2 7 納米生物復(fù)合探針13 第四節(jié)金霉素性質(zhì)及測定方法。1 4 第五節(jié)本論文的研究目的和研究內(nèi)容1 5 1 研究目的15 2 研究內(nèi)容15 第2 章金霉素納米金核酸共振光散射體系的研究及分析應(yīng)用1 6 1 實(shí)驗(yàn)部分1 6 2 結(jié)果與討論18 3 機(jī)理探討2 4 4 結(jié)論2 9 第3 章納米金異金霉素核酸體系的熒光猝火效應(yīng)及分析應(yīng)用3 0 第。節(jié)納米金異金霉素體系的研究及分析應(yīng)用3 1 1 實(shí)驗(yàn)部分3l 2 結(jié)果與討論3 2 3 機(jī)理探討3 6 4 結(jié)論3 9 第二節(jié)異金霉素核酸體系的熒光猝滅效應(yīng)及分析應(yīng)用4 0 1 實(shí)驗(yàn)部分4 0 2 結(jié)果與討論4 0 3 結(jié)論4 5 第三節(jié)納米金異金霉素核酸體系的熒光猝滅效應(yīng)及分析應(yīng)用4 6 1 實(shí)驗(yàn)部分4 6 2 結(jié)果與討論4 7 3 機(jī)理探討5 2 4 結(jié)論5 6 第4 章亞甲基蘭s d b s 蛋白質(zhì)體系的同步熒光增強(qiáng)效應(yīng)及分析應(yīng)用5 7 1 實(shí)驗(yàn)部分。5 8 2 結(jié)果與討論5 9 3 機(jī)理探討6 5 4 結(jié)j 滄7 0 參考文獻(xiàn)7 l 致謝8 8 碩士期間發(fā)表論文8 9 山東入學(xué)碩士學(xué)位論文 摘要 核酸與蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)。核酸是生物的基本遺傳物質(zhì)，參與著生命 活動的各個階段。蛋白質(zhì)是生物體含量最豐富的高分子物質(zhì)，肩負(fù)著各種生理功 能，是生物性狀的直接表達(dá)者。因此研究核酸和蛋白質(zhì)與小分子相互作用，建立 高靈敏度、低檢出限的核酸和蛋白質(zhì)的定量測定方法，不但對新型的藥物設(shè)計(jì)、 藥理和毒性的研究提供幫助，而且在臨床檢測等方面也具有重要意義，因此成為 當(dāng)前生物分析化學(xué)研究的前沿和熱點(diǎn)之一。 本論文以熒光和共振光散射技術(shù)為主要研究手段，結(jié)合多種分析技術(shù)尋找新 的核酸和蛋白質(zhì)探針，建立了靈敏的定量檢測新方法，并進(jìn)行了機(jī)理研究和探討。 本文共四部分。 論文第一部分綜述了熒光和共振光光譜探針以及納米粒子在核酸和蛋白質(zhì)生 物大分子分析中的研究進(jìn)展。 論文第二部分，研究了金霉素、納米金和核酸的相互作用。研究表明：核酸 的加入，可使得金霉素納米金的共振光散射強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，且體系共振光散射增 強(qiáng)程度與核酸的濃度在一定范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，據(jù)此建立了定量測定核 酸的新方法。f s d n a 和s m d n a 的線性范圍分別為：5 o 1 0 。8 1 5 1 0 巧gm l 。1 和 6 0 x 1 0 8 1 0 x l f f 5gm l ，檢出限分別為1 2 x 1 0 。9gm l - l 和1 5 x 1 0 9gm l 一，并成 功應(yīng)用于實(shí)際樣品中d n a 的定量測定。體系的相互作用機(jī)理研究表明： c t c a u n p s 與f s d n a 之間發(fā)生了長距組裝作用，導(dǎo)致了體系共振光散射強(qiáng)度的增 強(qiáng)。 論文第三部分，研究了異金霉素、納米金和核酸的熒光猝火作用。研究發(fā)現(xiàn)， 核酸的加入可以使異金霉素納米金體系的熒光發(fā)生猝滅，由此建立了一種測定核 酸的簡單、靈敏的熒光方法。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，核酸濃度與熒光強(qiáng)度猝滅程度 之間具有良好的線性關(guān)系，f s d n a 和c t d n a 線性范同分別為：i 0 1 0 2 0 x 1 0 擊g m l 和1 0 x 1 0 8 1 6 x 1 0 石gm l ，檢m 限分別為3 2 x 1 0 習(xí)gml 1 和4 0 x 1 0 母gm l 。 機(jī)理研究表明：異金霉素能吸附在納米金表而，產(chǎn)生表而熒光增強(qiáng)效應(yīng)，而異金 霉素一納米金與核酸之間主要以溝槽式結(jié)合，同時(shí)存在靜電作用。 山東人學(xué)碩+ 學(xué)位論文 論文第四部分，研究了_ ! i 1 e 甲基蘭s d b s 和蛋白質(zhì)的相互作用，建市了定量測 定蛋白質(zhì)的同步熒光方法。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，m b s d b s 蛋白質(zhì)體系同步熒光強(qiáng) 度的增強(qiáng)程度與蛋白質(zhì)的濃度在一定范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，b s a 和e a 的線性 范圍分別是：8 0 x 1 0 8 4 0 x 1 0 。5gm l - l 和1 0 x 1 0 。7 3 5 x1 0 5gm l ，檢出限分別達(dá) 到8 9 x 1 0 母gm l 。1 和1 0 x 1 0 gm l 一。該方法具有穩(wěn)定性好，操作簡單和靈敏度高 等特點(diǎn)。機(jī)理研究表明：m b 二聚體的解聚，m b s d b s b s a 復(fù)合物的形成以及 b s a s d b s 提供的疏水微環(huán)境是該體系同步熒光增強(qiáng)的主要原因。 本論文的主要特點(diǎn)： l 、利用核酸對金霉素納米金的共振光散射強(qiáng)度增強(qiáng)作用，建立了靈敏度高， 穩(wěn)定性好的定量測定核酸的共振光散射新方法，探討其相互作用機(jī)理。 2 、研究了核酸對異金霉素一納米金體系的熒光猝滅機(jī)理，建立了測定核酸的 新方法。 3 、利用同步熒光技術(shù)，研究了蛋白質(zhì)對m b s d b s 體系的熒光增強(qiáng)作用，建 立了測定生物背景干擾小的蛋白質(zhì)的近紅外同步熒光分析新方法，并應(yīng)用多種技 術(shù)探討了體系的作用機(jī)理。 。 關(guān)鍵詞：金霉素，異金霉素，納米金，亞甲基蘭，十二烷基苯磺酸鈉，核酸，蛋 白質(zhì)，熒光，共振光散射 i i 山東人學(xué)碩士學(xué)位論文 a b s t r a c t n u c l e i ca c i d sa n dp r o t e i n sa r eb a s i co fl i f e n u c l e i ca c i d sa r et h eg e n e t i cm a t e r i a l ， t h e yp l a ya ni m p o r t a n tr o l ei nt h ea c t i o no fe v e r ys t a g e ( g r o w t h ，u p g r o w t h ，a n ds oo n ) p r o t e i n sa r et h em o s ta b u n d a n ti no r g a n i s m ，a n dt h e ya l m o s ta t t a c ht h e m s e l v e st oa l ll i f e a c t i o n s oi ti so fs p e c i a lv a l u et os t u d yt h ei n t e r a c t i o no fs m a l lm o l e c u l e sa n d b i o m o l e c u l e s ，t h eq u a n t i t a t i v ea n a l y s i so fn u c l e i c a c i d sa n dp r o t e i n sw i t hh i g h s e n s i t i v i t ya n dl o wd e t e c t i o n l i m i ta r ei m p o r t a n ti nl i f es c i e n c e ，b i o c h e m i c a l m e d i c a m e n t ，f o o da n a l y s i sa n dc l i n i c a la n a l y s i s ，w h i c hi sh e l p f u lt od e s i g nt h en e wt y p e o f d r a ga n ds t u d yt h et o x i c i t yo fd r u g t h i sp r o j e c ti st h ef o r w a r dp o s i t i o na n dh o tp o i n t i nb i o c h e m i c a la n db i o p h y s i c a lr e s e a r c h e s b a s e do nt h ef l u o r e s c e n c ea n dr e s o n a n c el i g h ts c a t t e r i n g ( r l s ) a st h ep r i m a r y t e c h n i q u e ，t h i st h e s i sf o c u so nt h ed e v e l o p m e n to fn e wp r o b e sf o rn u c l e i ca c i d sa n d p r o t e i n sa n dt oe s t a b l i s hs e n s i t i v em e t h o d sf o rt h eq u a n t i t a t i v ed e t e r m i n a t i o no ft h e m ， w i t hm u l t i p l et e c h n i q u e st os t u d yt h ei n t e r a c t i o nm e c h a n i s m t h em a i nc o n c l u s i o n sa r e * 。 1 i s t e da sf o i l o w s ： i nt h ef i r s ts e c t i o n ，w es u m m a r i z et h er e c e n td e v e l o p m e n to ff l u o r e s c e n tp r o b e sf o r n u c l e i ca c i d ，p r o t e i na n dt h ea n a l y t i c a la p p l i c a t i o n s t h ep r o g r e s so fn a n o p a r t i c l e si nt h e a n a l y s i so f n u c l e i ca c i da n dp r o t e i ni sa l s oc o m m e n t e d i nt h es e c o n ds e c t i o n ，t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nc t c ，a u n p sa n dn u c l e i ca c i d sa r e s t u i e d f r o mt h er e s e a r c h ，w ef i n dt h a tw h e nd n ai sa d d e dt oc t c - a u n p s ，r e s o n a n c e j l i g h ts c a t t e r i n gi se n h a n c e d b a s e do nt h i s ，an e w r e s o n a n c el i g h ts c a t t e r i n gm e t h o df o r t h ed e t e r m i n a t i o no fn u c l e i ca c i d si sp r o p o s e d u n d e ro p t i m u mc o n d i t i o n s ，t h ee n h a n c e d r e s o n a n c el i g h ts c a t t e r i n gi n t e n s i t yi sp r o p o r t i o nt ot h ec o n c e n t r a t i o no fn u c l e i ca c i d si n t h e r a n g e o f5 0 x1 0 - s - 1 5 x10 - 5 g m l 1f o rf i s h s p e r md n a ( f s d n a ) a n d 6 0 x10 - s 1 0 xl0 5gm l f o rs m d n a ，t h e i rd e t e c t i o nl i m i t s ( s n = 3 ) a r e1 2 x10 9g m l ，1 5 x10 9gm l - 1 ，r e s p e c t i v e l y t h ei n t e r a c t i o nm e c h a n i s mi sc o n s i d e r e dt h a tt h e r e e x i s t sl o n gr a n g ea s s e m b l ye f f e c to ft h es y s t e m i nt h et h i r ds e c t i o n ，t h ef l u o r e s c e n c eq u e n c h i n ge f f e c to fi c t c - a u n p s - d n ai s s t u d i e d i ti sf o u n dt h a td n ac a nq u e n c ht h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo fi c t c - a u n p s u n d e ro p t i m u mc o n d i t i o n s ，t h e r ea r el i n e a rr e l a t i o n s h i p sb e t w e e nt h eq u e n c h i n ge x t e n t o ff l u o r e s c e n c ea n dt h ec o n c e n t r a t i o no fd n ai nt h er a n g eo f1 0 x10 s - 2 0 xl0 擊gm l 1 f o rf s d n a ，1 0 xio - s - 1 6 x10 石gm l f o rc t d n a t h ed e t e c t i o nl i m i t s ( s n = 3 ) o f n i 山東人學(xué)碩? 卜學(xué)位論文 盡d n aa n dc t d n aa r e3 2 x10 9gm l 1a n d4 0 x10 。9gm l ，r e s p e c t i v e l y t h e i n t e r a c t i o nm e c h a n i s m i n v e s t i g a t i o n i n d i c a t e st h a tt h e r ee x i s tt h e g r o o v ea n d e l e c t r o s t a t i ci n t e r a c t i o n i nt h ef o u r t hs e c t i o n ，i ti sf o u n dt h a t p r o t e i nc a ne n h a n c et h es y n c h r o n o u s f l u o r e s c e n c e i n t e n s i t y o fm b - s d b s u n d e ro p t i m u mc o n d i t i o n s ，t h ee n h a n c e d s y n c h r o n o u sf l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yi sp r o p o r t i o nt ot h ec o n c e n t r a t i o no fp r o t e i n si nt h e r a n g eo f8 0 x10 8 - 4 0 xl0 5gm l 1f o rb s a ，10 0 x10 - s - 3 5 x10 5gm l 。1f o re a t h e d e t e c t i o nl i m i t s ( s n = 3 ) o fb s aa n de aa r e8 9 x10 - 9gm l ，10 0 x1 0 。9gm l ， r e s p e c t i v e l y s a m p l e sa r es a t i s f a c t o r i l yd e t e r m i n e d t h ef l u o r e s c e n c ee n h a n c e m e n to f t h es y s t e mo r i g i n a t e sf r o mt h ed e a g g r e g a t i o no fs o m em bd i m e ra n dt h ef o r m a t i o no f a l lm b - - s d b s - b s ac o m p l e x ，a sw e l la st h eh y d r o p h o b i cm i c r o e n v i r o n m e n tp r o v i d e d b yb s a a n ds d b s t h ec h i e fc h a r a c t e r i s t i c so ft h i st h e s i sa r ea sf o l l o w s ： 1 i ti sf o u n dt h a tf s d n ac a ne n h a n c et h er e s o n a n c el i g h ts c a t t e r i n gi n t e n s i t yo f c t c a u n p ss y s t e ma n dp r o v i d eas t a b l e ，s e n s i t i v ea n dh i g h l ys t a b l ea g a i n s tf l u o r e s c e n t p h o t o b l e a c h i n gf l u o r i m e t r i c m e t h o df o r t h ed e t e r m i n a t i o no fn u c l e i c a c i d s ，t h e m e c h a n i s mo f t h es y s t e mw a sa l s od i s c u s s e di nd e t a i l 2 i ti sf o u n dt h a td n ac a no b v i o u s l yq u e n c ht h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo f i c t c - a u n p s ，t h i sm e t h o di ss i m p l e ，s t a b l ea n dq u i c k t h ef l u o r e s c e n c eq u e n c h m e n t m e c h a n i s mw a sa l s od i s c u s s e di nd e t a i l 3 i ti sf o u n dt h a tp r o t e i nc a ne n h a n c et h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo fm b s d b s s y s t e ma n dp r o v i d ean e wf l u o r i m e t r i cm e t h o dw i t hl e s si n f l u e n c eo fb i m o l e c u l a r b a c k g r o u n d f o rt h ed e t e r m i n a t i o no fp r o t e i n s t h e s y n c h o u r o u s f l u o r e s c e n c e e n h a n c e m e n tm e c h a n i s mw a sa l s od i s c u s s e di nd e t a i l k e yw o r d s ：c h l o r t e t r a c y c l i n e ；i s o c h l o r o t e t r a c y c l i n e ；a un a n o p a r t i c l e s ；m e t h y l e n e b l u e ；s o d i u md o d e c y l b e n z e n es u l f o n a t e ；n u c l e i ca c i d s ；p r o t e i n ； f l u o r e s c e n c e ；r e s o n a n c el i g h ts c a t t e r i n g i v 山東大學(xué)碩士學(xué)位論文 a u n p s ：金納米粒子 i c t c ：異金霉素 f s d n a ：鯡魚精子脫氧核糖核酸 e t d n a ：小牛胸腺脫氧核糖核 b s a ：牛血清蛋白 o p ：乳化劑 c t a b ：十六烷基三甲基溴化銨 s d b s ：十二烷基苯磺酸鈉 s l s ：十二烷基硫酸鈉 b r ：b r i t t o n r o b i n s o n c d ：圓二色光譜 符號說明 c t c ：金霉素 m b ：亞甲基藍(lán) s m d n a ：鮭魚精子脫氧核糖核酸 y r n a ：酵母核糖核酸 e a ：雞蛋清蛋白 s d s ：十二烷基磺酸鈉 c p b ：十六烷基溴化吡啶 t e m ：透射電子顯微鏡 t r i s ：三羥甲基胺基甲烷 h m t a ：六次甲基網(wǎng)氨 芎：電動電勢 v 山東人學(xué)碩士學(xué)位論文 第1 章緒論 蛋白質(zhì)和核酸是生命的晟基本物質(zhì)。根據(jù)化學(xué)組成不同，核酸可分為核糖核 酸( r n a ) 和脫氧核糖核酸( d n a ) 。d n a 是儲存、復(fù)制和傳遞遺傳信息的主要物質(zhì)基 礎(chǔ)，r n a 在蛋白質(zhì)合成過程中起著重要作用。核酸是基本的遺傳物質(zhì)，并且在蛋 白質(zhì)的生物合成上占重要位置，因而在生長、遺傳、變異等一系列重大生命現(xiàn)象 中起決定性的作用。近年來，隨著生物學(xué)向分子層次的發(fā)展以及臨床診斷中的證 明，人們發(fā)現(xiàn)許多重大疾病的發(fā)生( 如遺傳病、艾滋病、癌癥等) ，都與體內(nèi)的核酸 的變化緊密相關(guān)【l 】。組成蛋白質(zhì)的基本單位是氨基酸，氨基酸通過脫水縮合形成 肽鏈。蛋白質(zhì)是由一條或多條多肽鏈組成的生物大分子，每一條多肽鏈有二十至 數(shù)百個氨基酸不等，各種氨基酸按一定的順序排列。蛋白質(zhì)具有各種不同的生理 功能，維持著生物體的新陳代謝【2 5 】。 核酸和蛋白質(zhì)的定量檢測是生物化學(xué)和其它交叉學(xué)科中經(jīng)常涉及到的分析任 務(wù)，也是現(xiàn)代藥物分離提純和質(zhì)量檢測中的分析項(xiàng)目之一。在眾多的測定牛物大 分子的方法中，探針技術(shù)以其自身的諸多優(yōu)越性得到大家的重視，成為研究蛋白 質(zhì)和核酸結(jié)構(gòu)、功能、定性定量的重要手段，這對生物學(xué)在分子層而上的發(fā)展和 臨床應(yīng)用等有重要的意義【6 ，7 】。正因如此，生物人分子探針的研究已經(jīng)成為前沿 和熱門課題之一。 下面主要介紹核酸和蛋白質(zhì)熒光和共振光散射探針的研究現(xiàn)狀以及發(fā)展趨 勢。 第一節(jié)核酸熒光和共振光散射探針的研究進(jìn)展 核酸定量分析的方法有很多，如免疫分析法等。眾多方法中，由于熒光分析 法和共振光散射法具有方法簡單、靈敏度較高等特點(diǎn)，人們不斷發(fā)現(xiàn)和研究新的 熒光和共振光敖射探針。本節(jié)中對核酸的熒光探針和共振光散射探針進(jìn)行了綜述。 1 核酸熒光探針 核酸的內(nèi)源熒光很弱，因此直接用其天然熒光存在局限性【8 ，9 】，因此人們一 直在探索利用探針來研究核酸。熒光探針之所以在核酸檢測中應(yīng)用廣泛，主要是 由于熒光分析方法具有靈敏度高、可測定參數(shù)多( 如光譜、峰位、熒光偏振、熒 山東人學(xué)碩士學(xué)位論文 光壽命、熒光強(qiáng)度) 等優(yōu)點(diǎn)，常用的核酸熒光探針有：有機(jī)染料探針、金屬離子 探針、金屬配合物探針和光化學(xué)探針等。 1 1 有機(jī)染料探針 有機(jī)染料作為核酸熒光探針研究起步比較早，發(fā)展速度很快。有機(jī)染料與核 酸的結(jié)合區(qū)位于核酸的堿基、磷酸骨架以及戊糖環(huán)部分。核酸與小分子的結(jié)合位 點(diǎn)主要由平行堆積的堿基、聚合的陰離子磷酸骨架以及兩條核苷酸鏈形成的大溝、 小溝組成。作用方式主要有非共價(jià)鍵結(jié)合和共價(jià)鍵結(jié)合。非共價(jià)鍵結(jié)合義可分為 表面結(jié)合( o u t s i d eb i n d i n g ) 、溝槽結(jié)合( g r o o v eb i n d i n g ) 和嵌插結(jié)合( i n t e r c a l a t i o n b i n d i n g ) 3 種模式 1 0 1 2 。小分子與d n a 的共價(jià)鍵結(jié)合的序列特異性識別能力比非 共價(jià)鍵結(jié)合作用要強(qiáng)的多。 早期的有機(jī)染料主要分為：吖啶類 1 3 ，1 4 ，菲啶類【1 5 】，吩噻嗪類染料 1 6 】 花菁染料 1 7 1 ，二苯并咪唑染料 1 3 1 等。隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)早期的這 些染料很多具有劇毒性，容易發(fā)生誘變，因而尋找無毒或低毒染料探針研究成為 一 i 山東入學(xué)碩士學(xué)位論文 由于傳統(tǒng)的有機(jī)熒光染料容易受到生物樣品本底熒光和散射光的干擾，對生物的 損傷很大【2 4 】，因此雙光子激發(fā)性質(zhì)的有機(jī)小分子的合成和應(yīng)用備受火注。劉玲芝【2 5 】 等設(shè)計(jì)并合成了一種雙光子激發(fā)熒光染料t p c o o h ，通過生物素鏈親和素橋聯(lián)技術(shù)， 將其作為能量供體用于均相競爭法檢測d n a 。 1 2 金屬離子及其配合物熒光探針 根據(jù)發(fā)光類型町將金屬離子及其配合物熒光探針分為金屬離子發(fā)光和配體發(fā) 光的金屬配合物熒光探針。 日前，人們在核酸分析中常用的金屬離子熒光探針主要是稀土離子。這是由 于稀土離子不僅具有光譜窄、s t o c k s 位移大、激發(fā)態(tài)壽命長等優(yōu)點(diǎn)，而且與生物大 分子間的親和力大【2 6 - 2 8 。金屬離子與配體形成絡(luò)合物發(fā)射金屬離子的熒光須滿 足條件為：金屬離子的發(fā)光電子能級在配體t l 能級之下。此時(shí)，可能發(fā)生電子從 配體三重態(tài)向金屬離子激發(fā)態(tài)的非輻射躍遷，然后發(fā)生m * - - m + h u 的輻射躍遷， 發(fā)射金屬離子的敏化熒光1 2 9 3 l 】。 而當(dāng)金屬離子的發(fā)光電子能級在配體s l 能級之上時(shí)，金屬離子與配體形成的 絡(luò)合物則發(fā)射的是配體分子的熒光。主要有葸醌類化合物、黃酮類化合物、喹諾 酮類化合物、氨羧絡(luò)合物、八面體釕的配合物、金屬卟啉類化合物 3 2 3 6 。 核酸與金屬配合物相互作用的研究一直是人們關(guān)注的課題之一，其中配體大 部分是臨床藥物，這在生物、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有重要意義。 1 3 光化學(xué)熒光探針 光化學(xué)熒光分析是，。種建立在光化學(xué)反應(yīng)基礎(chǔ)上的熒光分析技術(shù)。當(dāng)某些物 質(zhì)吸收了紫外一可見輻射，引起諸如光加成、光分解、光氧化還原及光異構(gòu)等光 化學(xué)反應(yīng)。這些反應(yīng)導(dǎo)致物質(zhì)的結(jié)構(gòu)或性質(zhì)發(fā)生了變化，形成熒光發(fā)射功能團(tuán)， 使物質(zhì)能夠發(fā)射強(qiáng)的熒光。 李文友等人利用核酸對維生素k 3 和9 ，1 0 蒽醌2 磺酸鈉( a q s ) 等光化學(xué)熒光 探針熒光強(qiáng)度的變化的影響，實(shí)現(xiàn)了對d n a 和r n a 的測定【3 7 】，提高了核酸檢 測的靈敏度。 3 山東大學(xué)碩士學(xué)位論文 2 核酸共振光散射探針 共振光散射技術(shù)是一種在普通熒光分光光度計(jì)卜進(jìn)行測量的光散射技術(shù)。其 原理是：當(dāng)采用相等的激發(fā)和發(fā)射波長同時(shí)掃捕激發(fā)和發(fā)射單色器所得的同步光 譜( 持0 ) ，即為散射粒子的共振光散射光譜，后來又發(fā)展了二級共振光散射光譜 技術(shù)。上世紀(jì)8 0 年代k n o l l 等研究了以染料鍵合d n a 進(jìn)行光散射標(biāo)記 3 8 】，盡管如 此共振光散射技術(shù)真正得到人們關(guān)注和應(yīng)用是在1 9 9 3 年，p a s t e m a c k 等使用普通的 熒光分光光度計(jì)獲得了共振光散射光譜【3 9 】。 該技術(shù)被用來研究小分子物質(zhì)與核酸和蛋白質(zhì)之間的相互作用，并已成為檢 測蚩白質(zhì)和核酸的靈敏探測技術(shù)之一。目前用于核酸分析的共振光散射探針主要 有；有機(jī)染料，陽離子表面活性劑，金屬離子絡(luò)合物及金屬離子等。 2 1 有機(jī)染料探針 有機(jī)染料主要可以分為核酸水溶性卟啉化合物 4 0 】、三苯甲烷類陽離子染料 【4 1 ，4 2 、噻嗪類染料【4 3 】以及醌亞胺類染料【4 4 - 4 8 】。以一卜的共振光散射探針大多 含有大的共軛體系和高的摩爾吸光系數(shù)的生色團(tuán)，在溶液中多以陽離子的形態(tài)存 在，加入核酸后，它們與其以靜電引力和疏水作用力結(jié)合形成大的離子締合物， 同時(shí)發(fā)生生色團(tuán)的聚集作用，導(dǎo)致共振光散射強(qiáng)度的增強(qiáng)【4 9 】。近年來，隨著生命 科學(xué)的發(fā)展，人們更關(guān)注于藥物類染料與核酸相互作用的研究，并且發(fā)現(xiàn)藥物染 料與核酸也存在著共振光散射猝滅現(xiàn)象。呂文娟等【5 0 】提取大黃巾的有效成分大黃 酸，發(fā)現(xiàn)核酸對大黃酸4 8 1 n m 處共振光散射信號的猝滅現(xiàn)象，通過計(jì)算機(jī)模擬對大 黃酸分子與核酸分子結(jié)合前后分子平面性的變化進(jìn)行了考察，探討了分子平面性 變化與共振散射光猝滅之間的關(guān)系，建立了測定核酸的共振光散射新方法。 2 2 陽離子表面活性劑探針 表面活性劑由于其具有親水基和親油基的雙重性質(zhì)，也被應(yīng)用于核酸的共振 光散射測定。我們課題組報(bào)道了單獨(dú)利用陽離子表面活性劑c t a b 和c p b 作為共振 光散射探針來研究核酸的方法，并探討了其作用機(jī)理【5 l 】。劉紹璞等【5 2 】研究了 c t a b 、c p b 、1 1 p b 、c d b a c 和z e p h 等晤五種陽離子表面活性劑對核酸的測定，并 4 山東大學(xué)碩士學(xué)位論文 探討了反應(yīng)機(jī)理及影響共振光散射強(qiáng)度的岡素。陳展光等以兩性離子表而活性劑 十：烷基j ：甲基甜菜堿( b s - 1 2 ) 為共振光散射探針，進(jìn)行了核酸測定【5 3 】。 2 3 金屬離子配合物及金屬離子探針 賈貞等 5 4 研究t e u 3 + _ t t a p h e n 核酸體系中的共振光散射猝滅效應(yīng)，同時(shí)， 作對體系的相互作用機(jī)理進(jìn)行了研究。楊傳孝【5 5 】等研究發(fā)現(xiàn)在酸性介質(zhì)中，a l ” 與d n a 分子表面的磷酸根通過靜電作用相結(jié)合，形成較大的粒子，導(dǎo)致共振光散 射增強(qiáng)光譜，建立了共振光散射法測量痕量d n a 的新方法。陶玉龍等研究了f e ” 與d n a 的共振光散射光譜，研究了適宜的反應(yīng)條件。體系的最大散射峰位于3 2 0 0 n m 處，共振光散射的增強(qiáng)強(qiáng)度與d n a 的濃度旱線性關(guān)系，建立了一種定量測定 d n a 的簡便、快速的新方法 5 6 1 。此外，此類型探針還有：鑭的混配物【5 7 】，鐵( 1 1 ) 與鄰菲咯啉、聯(lián)吡啶的混配物【5 8 】等。 1 1 和r 。 第二節(jié)蛋白質(zhì)熒光探針的研究進(jìn)展 蛋白質(zhì)是生命活動的物質(zhì)基礎(chǔ)，對蛋白質(zhì)的檢測在生命科學(xué)中具有重要作用。嚳。 蛋白質(zhì)在3 4 0 一- 3 5 0 n m 有熒光發(fā)射，但其內(nèi)源熒光在靈敏度方面存在局限性，需要 通過外源熒光性質(zhì)的研究來達(dá)到靈敏的測定蛋白質(zhì)含量的要求。目前，常見的熒 光探針主要有：有機(jī)染料，熒光衍生化試劑，稀土離子及其螯合物熒光探針和近噦 紅外熒光探針等。 1 近紅外熒光探針 隨著熒光技術(shù)在生物樣品檢測中的不斷應(yīng)用，人們發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)的可見光區(qū)熒光 染料由于生物體及其組織在可見光的激發(fā)下自身也會發(fā)射熒光，靈敏度和準(zhǔn)確性 受到很大限制。近紅外熒光染料的發(fā)射在6 0 0 1 0 0 0 r i m ，而生物分子在此區(qū)域內(nèi)沒 有吸收，對熒光的干擾較小，因此近紅外熒光染料非常適合生物樣品的分析檢測。 常片j 的近紅外熒光染料有：菩染料、含有四吡咯基團(tuán)染料和噻嗪嗯嗪染f ，t 5 9 ，6 0 】 等。菁染料可通過活性反應(yīng)基團(tuán)與抗體或抗原蛋白質(zhì)結(jié)合【6 1 】，形成染料蛋白質(zhì) 結(jié)合物，從而進(jìn)行檢測。常用的是五甲川和七甲川菁染料。一些對溶劑敏感的部 花菁與蛋白共價(jià)結(jié)合，用于研究活細(xì)胞中蛋白構(gòu)犁的變化1 6 2 ，標(biāo)記巰基和氨基的 山東大學(xué)碩士學(xué)位論文 系列c y 5 近紅外菁染料在蛋白質(zhì)組學(xué)上也初露頭f f l l 6 3 ，6 4 1 。 含有四吡咯基團(tuán)染料探針主要用于研究生物蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、性能與功能 6 5 3 。 噻嗪類染料和嗯嗪類染料均含有可用來進(jìn)行標(biāo)記的氨基恭團(tuán)，合成較容易、 分子較小。目前常用的這類染料主要有耐爾藍(lán)( ) 【6 6 ，耐爾紅【6 7 ，6 8 1 、亞甲基 藍(lán)( ) 6 9 ，7 0 、噫嗪7 5 0 7 1 等。 二氟化硼一二吡咯甲烷( b o d i p y ) 熒光染料具有較高的摩爾吸光系數(shù)、較高的熒 光量子產(chǎn)率、熒光對溶劑的極性和p h 均小敏感、熒光光譜峰窄、熒光壽命長和光 穩(wěn)定性好等特點(diǎn)。近年來一些含有不同活性功能基團(tuán)的b o d i p y 也相繼被合成 7 2 - 7 4 。 此外，還有一些近紅外量子點(diǎn)和上轉(zhuǎn)換納米粒子熒光探針( 見本章第三節(jié)) 。 2 有機(jī)染料探針 有機(jī)染料與蛋白質(zhì)通過共價(jià)鍵或者非共價(jià)鍵結(jié)合，利用染料的熒光強(qiáng)度增強(qiáng) 或者猝滅程度在一定范圍內(nèi)與蛋白質(zhì)濃度成正比，實(shí)現(xiàn)對蛋白質(zhì)的定量測定 【7 5 9 0 1 。 3 稀土離子和稀土離子絡(luò)合物熒光探針 某些稀j t ：離子本身具有優(yōu)良的熒光特性，因此可以用來測定蛋白質(zhì)。我們課 題組在研究銪( i i i ) 和鋱( i i i ) 及其配合物作為蛋白質(zhì)熒光探針做了大量工作 9 1 9 3 。 4 熒光衍生化試劑 蛋白質(zhì)分子一般具有兩個可供衍生化的功能基團(tuán)：氨基和羧基。常用的衍生 化試劑有5 一氟喹啉一3 - 羧基乙醛、4 一州，n - - - e p 基胺基一磺?；? 7 氟一2 ，1 ，3 - 苯并 二唑等 9 4 - 9 6 1 。 第三節(jié)納米粒子在生物大分子分析中的應(yīng)用 自電子掃描隧道顯微鏡發(fā)明以來，人們開始在納米領(lǐng)域認(rèn)識和研究問題。納 米粒子通常是指粒徑大小在1 - 1 0 0n m 范圍內(nèi)的微粒子。其存在納米效應(yīng)，可以概 括為：小尺寸效應(yīng)、量j f 尺寸效應(yīng)和表面與界面效應(yīng)。由于存在這些獨(dú)特的效應(yīng)， 納米粒子在光、磁以及化學(xué)活性等方面與本體物質(zhì)產(chǎn)生顯著差異 9 7 - 9 9 。將納米 粒子應(yīng)用- 丁牛物分析，面臨的首要問題是牛物大分子與納米粒子的耦聯(lián)。牛物分 6 山東大學(xué)碩士學(xué)位論文 子與納米粒子通過以下方式耦聯(lián)：第一是直接法，納米粒子與蛋白質(zhì)和核酸本身 的官能團(tuán)或衍生的官能團(tuán)在表面進(jìn)行連接；第jl 是問接法，把納米粒子表_ 血改性 修飾，衍生出能夠方便連接蛋白質(zhì)和核酸的官能團(tuán) 1 0 0 1 0 2 。 目前，用于蛋白質(zhì)和核酸的納米顆粒主要有：貴金屬納米粒子，發(fā)光量子點(diǎn)， 有機(jī)高分子納米溶膠，微乳液熒光納米粒子，上轉(zhuǎn)換納米粒子，生物人分子納米 粒子，納米生物復(fù)合探針等。 1 貴金屬納米粒子 金屬納米粒子的原子和電子結(jié)構(gòu)不同于相同化學(xué)成分的金屬粒子，其具有優(yōu) 良的電學(xué)、磁學(xué)、光學(xué)、熱學(xué)、催化等性能。下面重點(diǎn)對貴金屬納米金和銀在蛋 白質(zhì)和核酸分析中的應(yīng)用進(jìn)行綜述。 1 1 金納米粒子 納米金是指直徑為1 1 0 0 n m 的金微小顆粒，具有一定金原子數(shù)的八面體結(jié)構(gòu)， 它與普通的金具有不同的特性，一般為分散在水中的水溶膠，故義稱膠體金。納 米金具有較好的免疫活性、催化活性、光電特性等等。其在生物分子的檢測中具 有較高的選擇性和靈敏度，應(yīng)用前景廣闊。 金納米粒子的制備方法較多 1 0 3 ，主要有：( 1 ) t u r k e v i c h - f r e n s 法 1 0 4 ，是 最傳統(tǒng)的制備納米金的方法，制備的金納米粒徑在1 0 - 1 0 0n m 范圍內(nèi)。該方法制備 程序簡單，納米金粒子分散性好，易于表面修飾【1 0 5 ； ( 2 ) b r u s t s c h i f f r i n 法，以 四正辛基溴化銨為相轉(zhuǎn)移劑，以烷基硫醇為穩(wěn)定劑，n a b h 4 為還原劑，制備粒徑為 1 - 8 n m 的納米金粒了 1 0 6 ，1 0 7 ；( 3 ) 聚合物保護(hù)法：通常采用n a b h 4 為還原劑， 配體采用聚合物，制備的納米金粒徑小于1 0n m 1 0 8 ，1 0 9 。 金納米粒子作為特殊標(biāo)記物進(jìn)行生化分析的研究始于2 0 世紀(jì)6 0 年代。1 9 6 2 年 開始用金納米標(biāo)記細(xì)胞進(jìn)行電子顯微鏡研究，1 9 7 1 年t a y l o r 將金納米微粒引入電鏡 免疫技術(shù)巾，從而金納米微粒開始用于免疫標(biāo)記技術(shù)。現(xiàn)階段應(yīng)用主要可分為： 光學(xué)探針，電化學(xué)探針，生物傳感器。 膠體金在可見區(qū)有特征等離子體共振吸收，且其吸收峰的等離子共振常隨著 尺寸的變化而發(fā)生頻移，溶液的顏色從橘紅色到紫紅色發(fā)生相慮變化，有利于肉 山東大學(xué)碩士學(xué)位論文 眼以及光學(xué)顯微鏡的觀察。c r u m b l i s s 發(fā)現(xiàn)金氧化還原酶可以附著存納米金表面， 且活性并沒有改變 1 1 0 ；人們發(fā)現(xiàn)不同的p h 值下，納米金粒子會誘導(dǎo)b s a 的構(gòu)象 發(fā)生變化，且在p h 值較高時(shí)，蛋白質(zhì)二級和三級的結(jié)構(gòu)變化更人 1 1 1 。美國西北 大學(xué)的m i r k i n l e t s t i n g e r d , 組和加州大學(xué)b e r k e l e y 的a l i v i s a t o s s c h u l t z d x 組。一直處于 金納米光探針免疫研究的前沿。m i r k i n l e t s t i n g e r d x 組將金納米粒子標(biāo)記到d n a 分 子1 - 以后，發(fā)現(xiàn)d n a 分子依然保持與其互補(bǔ)鏈進(jìn)行雜交的能力，過程是熱力學(xué)可 逆的且沒有被破壞 1 1 2 。d a i 等 1 1 3 結(jié)合動態(tài)光散射( d l s ) 技術(shù)，建立了簡單 且無需分離和信號放大步驟的一步測定d n a 的方法