密級： 論文編號： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 學(xué)位論文 表達(dá)綠熒光蛋白的重組馬立克氏病病毒 814 株的構(gòu)建 F 14 F 14 I 摘 要 雞馬立克氏病（ s 由馬立克氏病病毒（ s 起的雞的一種高度傳染性、淋巴組織增生 性疾病。 它作為載體構(gòu)建表達(dá)外源抗原的多價活疫苗來誘導(dǎo)免疫，可達(dá)到預(yù)防一種或多種禽病的目的。 （ 814株是我國分離到的自然弱毒株，長期作為疫苗使用，免疫原性良好。選擇其作為病毒載體構(gòu)建重組病毒，可用于 時也可利用其研究 本文利用 14疫苗株作為載體，以病毒基因組 別插入綠熒光蛋白（ 因表達(dá)盒、新城疫病 毒（ 合蛋白（ F）基因表達(dá)盒和禽流感病毒（ 凝素（ A）基因表達(dá)盒，分別構(gòu)建了包含 基因、 時獲得了一株表達(dá) 14株重組病毒。 根據(jù) 計(jì)兩對引物，并于各引物 5端引入酶切位點(diǎn)，以 14株基因組 板進(jìn)行 源臂 1的上游引物在 游引物在 近起始密碼子；同源臂 2的上游引物在 近終止密碼子，下游引物在 兩 次克隆入 建成重組 過與 實(shí)獲得的 14株同源臂序列與預(yù)期相符合。 根據(jù)商品化表達(dá)質(zhì)粒 其啟動子上游及 引物 5端 分別引入酶切位點(diǎn)，以質(zhì)粒載體 得 中包含 此基因表達(dá)盒克隆入載體質(zhì)粒 得包含 根據(jù)質(zhì)粒 含 基因表達(dá)盒）和 含 苷酸序列分別設(shè)計(jì)一對引物， 和 克隆入質(zhì)粒 得 轉(zhuǎn)移質(zhì)粒載體 采用磷酸鈣沉淀法，將 14株基因組總 經(jīng)綠色熒光標(biāo)記篩選，獲得表達(dá)綠色熒光蛋白的重組 14病毒。 14株 組病毒在 0代后， 明重組病毒能夠在體外穩(wěn)定遺傳。通過測定重組病毒和 親本 病毒的體外生長曲線，證明重組病毒的生 長特性與親本病毒無顯著差異。 本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了表達(dá)綠色熒光蛋白的重組 14株，為 我國 時還構(gòu)建了包含 基因的重組轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒，在此基礎(chǔ)上，可以通過反向篩選的方法獲得表達(dá) 蛋白的重組 814病毒。 A 白和 蛋白都是抗原性非常好的蛋白，用它們構(gòu)建重組 14株，可以很好的誘導(dǎo)機(jī)體的體液免疫，從而達(dá)到同時預(yù)防幾種禽病的目的。 關(guān)鍵詞 馬立克氏病病毒 綠熒光蛋白基因 重組病毒 s is a of s is a of it to of or (14 is a as in We it as to is to D DV (14 as be D be to DV D. ) A) 14 to of A DV 14 FP to of A 2 of to CR of at S1 at of at at a of CR in to DV of 14 is of A. on of a of a of FP CR at of of CR MV FP FP of DV FP of A to IV of NA of DV DV 14 NA DV 14 FP CR FP 14 0 FP be in of of in of so DV 14 FP is D DV We A a DV 14 A A in we of or s HA F V 目 錄 第一章 緒論 . 1 立克氏病病毒簡介 . 1 立克氏病病毒的形態(tài)學(xué)特征 . 1 立克氏病病毒的分類及血清型 . 2 立克氏病病毒基因組 . 3 立克氏病病毒基因組結(jié)構(gòu) . 3 立克氏病病毒致腫瘤相關(guān)基因 . 5 毒基因組中的復(fù)制非必需區(qū) . 6 立克氏病病毒的致病機(jī)理 . 7 立克氏病的疫苗研究 . 8 規(guī)疫苗 . 8 因工程疫苗 . 10 立克氏病血清型 病毒作為疫苗載體的研究 . 12 立克氏病血清型病毒作為活疫苗載體的可能性 . 12 動子的選擇 . 12 告基因的選擇 . 12 源基因插入位點(diǎn)的選擇 . 13 染方法的選擇 . 14 于構(gòu)建 重組病毒的其它禽病基因 . 15 研究的目的及意義 . 16 第二章 包含外源基因的馬立克氏病病毒 814株轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建及表達(dá)綠熒光蛋白的重組 814 株的建立 . 17 料與方法 . 17 毒株、細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)用試劑 . 17 粒、細(xì)菌載體及分子克隆方法 . 17 化試劑及試劑盒 . 17 主要儀器設(shè)備 . 17 胚成纖維細(xì)胞的制備 . 18 毒基因組總 取 . 18 物設(shè)計(jì)及合成 . 18 增 . 19 腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備 . 20 移載體質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 . 20 毒基因組與轉(zhuǎn)移質(zhì)粒載體的共轉(zhuǎn)染及重組病毒的篩選與純化 . 21 組病毒的鑒定 . 22 組病毒體外生長特性測定 . 23 果 . 23 染 因組總 提取 . 23 源臂及基因表達(dá)盒 增結(jié)果 . 24 組轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒的鑒定 . 25 組病毒的篩選及純化 . 32 組病毒的鑒定 . 32 組病毒體外生長特性 . 34 論 . 35 第三章 全文結(jié)論 . 37 參考文獻(xiàn) . 38 附 錄 . 47 致 謝 . 52 作者簡介 . 53 文縮略表 英文縮寫 英文全稱 中文名稱 菌人工染色體 bp 基對 胚成纖維細(xì)胞 細(xì)胞病毒 氧核糖核酸 氧核昔三磷酸 g 色熒光蛋白 hr 時 of 雞皰疹病毒 L 菌培養(yǎng)基 s 立克氏病 s 立克氏病病毒 mg 克 鐘 mL 升 mm 米 摩爾濃度 爾濃度 合酶鏈?zhǔn)戏磻?yīng) s 組馬立克氏病病毒 /轉(zhuǎn) 特定病原體 0 短獨(dú)特區(qū) 10 中 國 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) 院 碩 士 學(xué) 位 論 文 第 一 章 1 第一章 緒論 雞馬立克氏病（ s 由雞馬立克氏病病毒（ s 起雞的一種以淋巴組織增生和腫瘤形成為特征的惡性腫瘤性疾?。?1967； 1968），導(dǎo)致雞產(chǎn)蛋率下降、免疫抑制引起進(jìn)行性衰竭進(jìn)而死亡。該病毒主要感染雞的外周神經(jīng)、性腺、虹膜、各種臟器、肌肉和皮膚，發(fā)生單核細(xì)胞浸潤，進(jìn)而引起許多功能障礙，主要表現(xiàn)在： 1）在淋巴系統(tǒng)生成淋巴瘤和導(dǎo)致免疫抑制； 2）在神經(jīng)系統(tǒng)引起外周和中樞神經(jīng)的疾??；3）在心血管系統(tǒng)出現(xiàn)動脈粥樣硬化性損傷； 4）引起上皮損傷，形成羽毛囊結(jié)（ 001）。 養(yǎng)禽業(yè)造成了非常大的經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)估計(jì)， 0億 2004）。該病雖經(jīng) 疫苗控制，但隨著強(qiáng)毒力毒株的出現(xiàn)其流行及危害呈逐年上升的趨勢。 著病毒毒力增強(qiáng)，病毒宿主范圍的擴(kuò)大，本病也可以危害鵪鶉和火雞等。 997年報(bào)道了九十代初在法國南部火雞因 0%； 1996年 雞場相鄰的二個暴發(fā) 2%和 因此必須加強(qiáng)對該病的防治工作。 隨著 有的 D，迫切需要新型疫苗防制 2000年后，對 毒 特異性蛋白結(jié)構(gòu)與功能等方面的研究取得了突破性進(jìn)展。利用同源重組等方法構(gòu)建重組病毒技術(shù)的日漸成熟，以 時也為發(fā)展高免疫原性病毒作為傳遞免疫調(diào)節(jié)分子或保護(hù)性免疫原的病毒表達(dá)載體提供機(jī)遇。 腫瘤生物學(xué)研究方面具有重要意義。 1983； 1984），對人體無危害，是研究腫瘤形成的機(jī)理良好的模型（ 殷震等， 1997）。該病的深入研究，不僅是養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展的需要，而且還有助于研究病毒的致瘤機(jī)理及腫瘤的預(yù)防和控制，在比較醫(yī)學(xué)上也有較大意義。 立克氏病病毒簡介 立克氏病病毒 的形態(tài)學(xué)特征 種是裸病毒，一種是有囊膜病毒。前者具有嚴(yán)格的細(xì)胞結(jié)合性，后者是非細(xì)胞結(jié)合性的，可脫離細(xì)胞而存活。 四種成分組成，即核芯（ 核衣殼（ 被膜（ 囊膜（ 病毒 ， 核衣殼呈二十面體對稱，由 162個衣殼 粒 構(gòu)成 。殼粒呈柱狀，大小為6相鄰衣殼粒中心間距 末端固定于衣殼的內(nèi)側(cè)。在 電鏡下觀察 感染細(xì)胞 ， 可見 85偶爾也能見到150囊膜病毒粒子，它們主要結(jié)合于核膜或 核內(nèi)空泡膜。 中 國 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) 院 碩 士 學(xué) 位 論 文 第 一 章 2 立克氏病病毒的分類及血清型 根據(jù)免疫擴(kuò)散試驗(yàn)（ 免疫熒光試驗(yàn)（ 清型病毒（ 括所有致病的和致弱的 病毒株致病和致 瘤的潛在性差異很大；血清型病毒（ 天然不致病的 清型病毒（ 火雞皰疹病毒（ of 對雞沒有致病性。單克隆抗體技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)一步確定三個血清型病毒之間的血清學(xué)差異（ 1979； 1983；1991），這 3種血清型病毒之間也存在血清學(xué)交叉反應(yīng)（ 1975）。 據(jù) 種病原型，即幾乎無致病性或致瘤性的溫和型 （ s 強(qiáng)毒型（ s 超強(qiáng)毒型（ s 特超強(qiáng)毒型（ s 1983）。 2004年國際病毒分類委員會發(fā)表的第 8次分類報(bào)告中，將 皰疹病毒亞科，馬立克氏病病毒屬（表 1）。 表 1 皰疹病毒的 最新系統(tǒng)分類 of 疹病毒科（ 感 染 脊 椎 動 物 皰疹病毒亞科 單純皰疹病毒屬 （ 人皰疹病毒 1 型 （ ） 單純皰疹病毒 1 型 （ ） 巨足類皰疹病毒 （ 水痘病毒屬 （ 人皰疹病毒 3 型 （ ） 水痘 （ 牛皰疹病毒 （ 馬皰疹病毒 （ 偽狂犬病病毒 （ 馬立克病毒屬 （ 、型馬立克氏病毒 （ 火雞皰疹病毒 （ of 傳染性喉氣管炎病毒屬 （ 禽皰疹病毒 1 型 （ ） 皰疹病毒亞科 巨細(xì)胞病毒屬 （ 人皰疹病毒 5 型 （ ） 巨細(xì)胞病毒 1 型 （ ） 鼠巨細(xì)胞病毒屬 （ 鼠巨細(xì)胞病毒 1 型 （ ） 玫瑰疹病毒屬 （ 人皰疹病毒 6 型 （ ） 皰疹病毒亞科 淋巴潛隱病毒屬 （ 人皰疹病毒 4 型 （ ） 毒 （ 細(xì)長病毒屬 （ 松鼠猴皰疹病毒 2 型 （ ） 鼬皰疹病毒 （ ） 魚回魚皰疹病毒屬 （ 魚回魚皰疹病毒 1 型 （ ） 參考文獻(xiàn)：（ 徐耀先 ， 1999； 方忠意， 2005） 中 國 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) 院 碩 士 學(xué) 位 論 文 第 一 章 3 立克氏病病毒基因組 立克氏病病毒基因組結(jié)構(gòu) 含有一個獨(dú)特長區(qū)（ 一個獨(dú)特短區(qū)（ R）。其基因組 模式為： 特長區(qū)末端重復(fù)序列） 特長區(qū)內(nèi)部重復(fù)序列） 特短區(qū)內(nèi)部重復(fù)序列） 特短區(qū)末端重復(fù)序列）（圖 1 已建立的 1984； 992； 1987）顯示，3種血清型病毒基因組 子雜交結(jié)果表明，在非嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下， 在嚴(yán)謹(jǐn)條件下，其同源性下降至 5%。 圖 1 3 種血清型 因組的結(jié)構(gòu)模式圖 (制 ) of DV 已經(jīng)測定的部分毒株的全基因組序列來看， 60中 7874786460 2000； 2001；2004； 2007）。 根據(jù) 2001；2001； 2000； 2000； 2004； 2001），推測 00多個基因（ 2006）， 7個開放閱讀框架（ 國 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) 院 碩 士 學(xué) 位 論 文 第 一 章 4 2個，病毒基因組至少可以編碼 80種蛋白，其中大部分為三種血清型病毒所共有，并且在單純皰疹病毒（ 可以 找到類似物。在 1975； 2006； 004），而這些基因?qū)τ?9個基因間有差異（ 2007）。 瘤相關(guān)基因包括 132因和 蛋白基因包括 它基因即除上述兩類基因外的基因， 如 2、 4、 引自 2006 圖 2 因組結(jié)構(gòu)模式圖 he DV 國 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) 院 碩 士 學(xué) 位 論 文 第 一 章 5 立克氏病病毒致腫瘤相關(guān)基因 類，即直接相關(guān)基因 有輔助作用的基因?yàn)椴《揪幋a的端粒 間接相關(guān)基因如 13238蛋白復(fù)合體）基因、 毒脂肪酶（ 2006）。其中 32 1. 直接相關(guān)基因 因的啟動子區(qū)域含有類似于熱休克因子（ 列。 39個氨基酸殘基組成， 該結(jié)構(gòu)域與 1997； 2002； 2005； 2006）。 2006） 。此外， 些都提示該蛋白在 同致病型 ，它們相互間核苷酸和氨基酸序列的同源性均很高，在 間。韋平等發(fā)現(xiàn) 14株的起始序列有 3個連續(xù)堿基的缺失，可據(jù)此設(shè)計(jì)特異性引物通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ 法擴(kuò)增 據(jù)不同的擴(kuò)增結(jié)果來區(qū)別疫苗株和強(qiáng)毒株。 類是含 15個氨基酸殘基（ 結(jié)構(gòu)，有 2個重復(fù)，另一類是含 6個氨基酸殘基（ 結(jié)構(gòu)，有4個重復(fù)，它們?nèi)糠植荚?端富含脯氨酸的轉(zhuǎn)錄激活域內(nèi)。 有很高的表達(dá)活性， 隨著感染后時間的增加，具有從核質(zhì)向核仁和核膜轉(zhuǎn)移的趨向。 132個 組 132別對應(yīng)于基因組 于 于 該重復(fù)序列與病毒的致癌性密切相關(guān)。這一區(qū)域含有 3個外 顯子的基因簇，可形成 5種不同信息。 132致瘤性很強(qiáng)的 雞胚成纖維細(xì)胞（ 連續(xù)傳代培養(yǎng)后，隨著病毒毒力的減弱，重復(fù)數(shù)增多，最多可增至 30多個。但也有例外， 14株為弱毒株，其基因組 132個。 2007）將 拷貝 132親本病毒以相同方式接種，發(fā)現(xiàn)此缺失株病毒仍可以作為病原感染動物，而且具有與親本病毒 相似的癥狀；在細(xì)胞上傳代同樣可以致弱缺失株病毒，猜測病毒致病機(jī)理可能與 1322007）。 而提高腫瘤發(fā)生率。 ，位于 大小 為 772 此推中 國 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) 院 碩 士 學(xué) 位 論 文 第 一 章 6 測其可能與致腫瘤有關(guān)。 二聚體，導(dǎo)致活性喪失，使靶細(xì)胞無任何應(yīng)答，從而使 利于病毒在體內(nèi)的潛伏與感染。應(yīng)用桿狀病毒表達(dá)的 到免疫逃避的目的。感染與感染 能夠誘發(fā)腫瘤，但發(fā)生腫瘤的雞比感染 明 細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中是非必需的。而 細(xì)胞感染較弱，接種后 4周時大部分病毒從感染雞體內(nèi)被清除掉，說明 近發(fā)現(xiàn)的 能與 說明 淋巴細(xì)胞，進(jìn)一步促進(jìn) 3種血清型中是保守的（ 2000； 2000； 2001； 2001； 2001）。 的缺失導(dǎo)致感染病毒后的早期外周血液中病毒滴度的下降，繼而降低腫瘤發(fā)生率。 可以影響病毒在體內(nèi)的復(fù)制，但不是轉(zhuǎn)化 此 2005）將細(xì)菌人工染色體 現(xiàn)此缺失 僅缺失 3輔助作用基因 腫瘤的生成不僅要求細(xì)胞的本質(zhì)發(fā)生變化，細(xì)胞還要逃避衰老和程序性死亡。端粒末端轉(zhuǎn)移酶是一種與細(xì)胞存亡相關(guān)的酶，它包含兩個核心成分，一個蛋白亞基稱作反轉(zhuǎn)錄端粒末 端轉(zhuǎn)移酶（ 一個 它是 拷貝的 R（ 源性為 88。 少 腫瘤發(fā)生，腫瘤大小和擴(kuò)散方面都大為減弱。這強(qiáng)有 力的說明了 和端粒末端轉(zhuǎn)移酶的失調(diào)在淋巴瘤的生成和轉(zhuǎn)移灶形成中的作用。 而誘導(dǎo)獨(dú)特的檢查反應(yīng)，引起突變體 毒基因組中的復(fù)制非必需區(qū) 目前對 對強(qiáng)毒株和弱毒疫苗株之間基因序列的差異也有了深入的了解（ 2006； 2007）。在病毒基因組中約有 20%的非必需區(qū)（ 可插入約 10000片段。這些部位的缺失