密級： 論文編號： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩士學(xué)位論文 飼料中喹烯酮的檢測方法與雞糞中喹烯酮及其代謝物的鑒定研究 of in of in of in of in I 摘 要 自二十世紀(jì)四十年代以來，喹噁啉 1,4二氧類化合物作為一類有效的抗菌劑，被廣泛用于獸藥領(lǐng)域，主要的代表性藥物有喹乙醇（ 和卡巴氧 這類藥對畜禽有明顯的促進(jìn)生長和抗菌作用。近年來，由于研究表明喹乙醇和卡巴氧具有潛在的致癌危險性而被歐盟禁用于飼料中。喹烯酮（化學(xué)名： 32喹噁啉 4這類藥物的新成員，是由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所研制開發(fā)的我國具有自主知識產(chǎn)權(quán)的一類飼料添加型新獸藥。與前兩者相比，它具有高效、低毒和添加量少等優(yōu)點。這對于養(yǎng)殖業(yè)特別是畜禽出口乃至人體健康，都具有十分重要的意義。 本項研究內(nèi)容由兩個部分組成：飼料中喹烯酮的分析與雞糞中喹烯酮及其代謝物的 鑒定。 建立了一種簡單快速、專屬性強(qiáng)和靈敏度高的反相高效液相色譜法測定 飼料中喹烯酮 的含量 ，以便于合理使用喹烯酮。飼料用乙腈提取，色譜柱： 石 250， 5 ）；流動相：乙腈水（體積比： 45:55），流速為 測波長為 380溫 30。收集了上海、北京和四川的多個乳豬和乳雞飼料進(jìn)行干擾試驗研究。結(jié)果表明喹烯酮的質(zhì)量在 0.62= 40 mg/80mg/200mg/中低三 個不同添加濃度下樣品的回收率分別為 為了鑒定雞糞中喹烯酮及其代謝物，首先采用化學(xué)合成法合成制備了可能的代謝物。以喹烯酮作反應(yīng)原料，低亞硫酸鈉（保險粉）作為還原劑，通過薄層色譜法（ 蹤反應(yīng)過程，合成制備得到脫二氧喹烯酮；以喹烯酮為反應(yīng)原料，三氯化磷為還原劑，合成得到兩單氧喹烯酮的混合物，通過柱層析分離得到純化合物： 1單氧喹烯酮和 4單氧喹烯酮；以苯并呋咱為起始原料，與乙酰乙酸乙酯反應(yīng)后，經(jīng)保險粉還原，最終水解制備得到 3甲基喹噁啉 2羧酸。運(yùn)用紅外（ 紫外 (核磁氫譜（ 1電噴霧質(zhì)譜（ 合成得到的化合物進(jìn)行了結(jié)構(gòu)認(rèn)證。 采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對雞糞中喹烯酮及其代謝物進(jìn)行了鑒定。試驗用一月齡健康黃羽雞只，雌雄對半，以 40mg/劑量單次灌胃給藥，收集給藥后 0 24 小時內(nèi)的糞便，采用兩種樣品前處理方法，高效液相色譜聯(lián)用三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)分離鑒定雞糞中喹烯酮及其代謝物。運(yùn)用串聯(lián)質(zhì)譜全掃描、子離子掃描等多種數(shù)據(jù)采集模式并結(jié)合定向合成的代謝物來確證代謝物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。試驗結(jié)果表明，雞糞便中除了存在原形藥物喹烯酮、前期 報道過的代謝物脫二氧喹烯酮和 3甲基喹噁啉 2羧酸外，還存在兩個首次發(fā)現(xiàn)的新的代謝產(chǎn)物： 1單氧喹烯酮和 4單氧喹烯酮。此方法為進(jìn)一步深入研究喹烯酮的代謝奠定了堅實的基礎(chǔ)。 關(guān)鍵詞 喹烯酮，高效液相色譜法，飼料，代謝物，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法 940s, ,4as to of in ,4or in of As a of ,4 3is in It s 990s. in is as of in of of of in A to of in of a 45:55 v/v) as 80 A .6g of in In to in We of R, 1S) to in at a 0g/ in 4 of by of C/S to as 1 4in to S/MS 錄 第一章 文獻(xiàn)綜述與引言 . 1 言 . 1 烯酮的研究 . 1 喹烯酮的物理化學(xué)性質(zhì) . 1 喹烯酮的藥理學(xué)研究 . 2 喹烯酮的毒理學(xué)研究 . 3 喹烯酮的藥代動力學(xué)研究 . 4 喹烯酮及其代謝物的檢測方法 . 5 噴霧液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在代謝物鑒定研究中的應(yīng)用 . 6 電噴霧電離技術(shù)的發(fā)展 . 6 電噴霧電離的原理 . 6 電噴霧液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在代謝物鑒定研究中的應(yīng)用 . 7 論文研究內(nèi)容與意義 . 8 第二章 飼料中喹烯酮的檢測方法 . 10 言 . 10 驗部分 . 10 . 材料. 10 色譜條件 . 10 樣品前處理 . 11 法認(rèn)證與結(jié)果 . 11 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢測限 . 11 精密度 . 11 穩(wěn)定性試驗 . 12 回收率 . 12 專屬性 . 13 擬樣品測定 . 14 論 . 14 驗小結(jié) . 15 第三章 喹烯酮代謝物的合成與結(jié)構(gòu)確證 . 16 言 . 16 驗部分 . 17 材料 . 17 代謝物的合成 . 17 合成代謝物的分析 . 18 果與討論 . 19 化合物 確證 . 19 化合物 確證 . 21 化合物 結(jié)構(gòu)確證 . 27 電噴霧質(zhì)譜分析探討 . 30 代謝物合成監(jiān)測的探討 . 30 驗小結(jié) . 31 第四章 雞糞中喹烯酮代謝物的鑒定 . 32 言 . 32 驗部分 . 32 材料 . 32 給藥與采樣 . 33 樣品前處理 . 33 S 分析 . 33 果與討 論 . 34 雞糞便中代謝物的鑒定 . 34 質(zhì)譜解析探討 . 39 雞糞樣品前處理的選擇 . 39 色譜條件的選擇 . 39 質(zhì)譜裂解碎片探討 . 40 結(jié)腸造口術(shù)分別收集雞的尿液和糞 . 40 喹烯酮在雞體內(nèi)可能的代謝途徑的推測 . 40 驗小結(jié) . 41 第五章 全文結(jié)論 . 42 參考文獻(xiàn) . 43 致 謝 . 47 作 者 簡 歷 . 48 V 圖表清單 圖 1喹烯酮的化學(xué)結(jié)構(gòu)式 . 2 圖 1電噴霧的原理示意圖 . 7 圖 2喹烯酮的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖 . 11 圖 2空白飼料液相色譜圖 . 13 圖 2喹噁啉 4. 14 圖 2喹烯酮的紫外光譜圖 . 15 圖 3喹烯酮代謝物的合成路線 . 16 圖 3紅外光譜圖 . 19 圖 3紫外光譜圖 . 20 圖 3核磁共振動氫譜 . 20 圖 3電噴霧質(zhì)譜圖 . 21 圖 3紅外光譜圖 . 22 圖 3紅外光譜圖 . 22 圖 3紫外光譜圖 . 23 圖 3紫外光 譜圖 . 24 圖 3B 的核磁共振氫譜 . 25 圖 3核磁共振氫譜 . 25 圖 3B 的電噴霧質(zhì)譜圖 . 26 圖 3電噴霧質(zhì)譜圖 . 26 圖 3D 的紅外光譜圖 . 27 圖 3D 的紫外光譜圖 . 28 圖 3核磁共振氫譜 . 28 圖 3D 的電噴霧質(zhì)譜圖 . 29 圖 3反應(yīng)液的薄層色譜圖 . 30 圖 4S 全掃描的總離子流和提取離子流色譜圖 . 34 圖 4S 全掃描的總離子流和提取離子流色譜圖 . 35 圖 4M+H+ M/Z 307 的子離子質(zhì)譜圖 . 36 圖 4M+H+ M/Z 291 的子離子質(zhì)譜圖 . 37 圖 4M+H+ M/Z 291 的子離子質(zhì)譜圖 . 37 圖 4M+H+ M/Z 275 的子離子質(zhì)譜圖 . 38 圖 4M+H+ M/Z 189 的子離子質(zhì)譜圖 . 38 圖 4喹烯酮及其代謝物的碎片結(jié)構(gòu) . 40 圖 4喹烯酮在雞體內(nèi)可能的代謝物途徑 . 41 表 2密度試驗結(jié)果 . 12 表 2定性試驗結(jié)果 . 12 表 2烯酮飼料樣品的回收率測定（ N=3） . 13 表 2- 4 樣品測定結(jié)果 . 14 3化合物 紅外光譜分析結(jié)果 . 21 表 3化合物 紫外光譜分析結(jié)果 . 23 表 3合物 核磁共振氫譜分析結(jié)果 . 24 表 3化合物 核磁共振氫譜分析結(jié)果 . 29 表 3應(yīng)物與產(chǎn)物的 . 31 表 4流動相條件 . 33 表 4喹烯酮及其代謝物的保留時間和 M+H+質(zhì)荷比 . 35 英文縮略表 英文縮寫 英文全稱 中文名稱 噴霧 效液相色譜 外光譜 S 相色譜質(zhì)譜聯(lián)用 譜 S 聯(lián)質(zhì)譜 磁共振 離子流色譜 層色譜 外光譜 取離子流色譜 第一章 緒論 1 第一章 文獻(xiàn)綜述與引言 言 自二十世紀(jì)四十年代以來， 喹噁啉 1,4二氧類化合物作為一類有效的抗菌促生長劑，被廣泛用于獸藥領(lǐng)域（ et 2005; 981）。其中最有代表性的藥物有德國拜耳公司研制的喹乙醇（ 、 美國輝瑞公司研制的卡巴氧 on 1990; 1990)和由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧和獸藥研究所研究開發(fā)的痢菌凈（又名乙酰甲喹， 。這類藥對畜禽有明顯的促進(jìn)生長 (1969)和廣譜的抗菌作用 (978)，通過抑制細(xì)菌 成，對禽巴氏桿菌、大腸桿菌、雞白痢沙門氏菌以及痢疾桿菌都有很好的療效 (2000)。這類獸藥能在動物體內(nèi)參與 蛋白的同化作用，這種蛋白同化作用的結(jié)果，促使更多的氮貯存，從而使畜禽生長更多的瘦肉，在提高畜禽對飼料的消化能力，促進(jìn)生長發(fā)育，提高飼料的轉(zhuǎn)化率方面具有顯著作用。近幾年來，一些養(yǎng)殖戶片面追求經(jīng)濟(jì)利益，濫用喹乙醇等喹噁啉二氧化物類飼料添加劑：超劑量使用或飼喂時間過長，甚至將其當(dāng)營養(yǎng)添加劑來使用，從而引起畜禽蓄積性中毒（ 鄧云波 ， 2004）這不僅影響了我國的畜產(chǎn)品的出口，而且影響人民的身體健康，威脅人類的生命安全。隨著毒理學(xué)研究的深入，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)卡巴氧和喹乙醇對動物有潛在的致癌和致突變的危險（ 1981; 1980; 1975） 。因此歐盟于 1998 年發(fā)文禁止在飼料中添加喹乙醇和卡巴氧 (of 1998)。 鑒于此種情況，非常有必要開發(fā)一種安全性高的替代產(chǎn)品。 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所的科研人員經(jīng)過多年的努力，已成功開發(fā)出了具有自主知識產(chǎn)權(quán)的新獸藥 喹烯酮。它是喹噁啉 1,4二氧類化合物家族的新成員，它除了具有這類藥共有的抗菌和促生長作用的特點外，還 具有喹乙醇和卡巴氧無法比擬的高效、低毒和添加量少等優(yōu)點（鄒仕庚， 2005）。因此新藥喹烯酮的成功開發(fā)，對我國乃至全球的畜牧業(yè)發(fā)展都具有非常重要的意義。 烯酮的研究 喹烯酮的物理化學(xué)性質(zhì) 喹烯酮（ , 化學(xué)名為： 3- 甲基 桂?；?- 喹噁啉 4- 第一章 緒論 2 （ 3屬于喹噁啉 4品為黃色結(jié)晶性或無定形粉末。無嗅、無味。分子式： 子量： 品微溶于甲醇、乙醇；在氯仿、二氧六環(huán)、二甲亞砜中溶解。熔點為 熔融時，同時分解。對光敏感，應(yīng)避光保存。 圖 1喹烯酮的化學(xué)結(jié)構(gòu)式 of 喹烯酮的藥理學(xué)研究 喹烯酮的抗菌促生長作用依賴于其分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)，它的母核結(jié)構(gòu)為喹噁啉 4 2此生物活性也有很大差異，保留 了其抗菌促生長作用，毒性卻大大降低。喹烯酮的作用機(jī)制與喹乙醇和卡巴氧的大體相似，即喹烯酮可選擇性抑制腸道致病性大腸埃希氏菌，但不影響有益大腸埃希氏菌和其它革蘭氏陽性菌，故能有效地控制仔豬腹瀉和禽巴氏桿菌病等，喹烯酮抑制腸道內(nèi)的有害菌而保持其中的有益菌群，可增加飼料營養(yǎng)的消化吸收能力，有利于促進(jìn)機(jī)體生長。 徐忠贊等（ 1995）進(jìn)行了 10 批仔豬添加喹烯酮的增重效果試驗。結(jié)果表明，在 30 60 天的的飼喂期內(nèi)，與對照組相比， 50mg/烯酮組多增重 75mg/多增重 10 批試驗的平均增重比對照組高 試驗組的飼料效率比對照組提高 與喹乙醇組相比，在 3 批對比試驗中，喹烯酮組有 2 批增重高于喹乙醇，分別高出 有 1 批低于喹乙醇組 試驗期間，喹烯酮組仔豬腹瀉的發(fā)病率僅為對照組的 32% 49%。 王玉春等（ 1995）在飼料中分別添加 25mg/50mg/ 75mg/個不同劑量的喹烯酮和喹乙醇對肉仔雞進(jìn)行了飼養(yǎng)試驗，結(jié)果表明， 50mg/75mg/量組的喹烯酮和喹乙醇均能顯著促進(jìn)肉仔雞 生長，其中以 75mg/量組最佳。與空白對照組相比，喹乙醇的增重率為 用 75mg/量的喹烯酮作擴(kuò)大試驗，共進(jìn)行了 9 批， 第一章 緒論 3 與空白對照組相比，平均增重率為 117%，死亡率降低 飼料效率提高 12%。 喹烯酮的毒理學(xué)研究 烯酮的一般毒理學(xué)研究 王玉春等對喹烯酮進(jìn)行了全面系統(tǒng)的一般毒理學(xué)研究，包括急性毒性研究（王玉春等， 1992）、蓄積毒性研究（王玉春等， 1993）、亞急性毒性研究（王玉春等， 1994）和慢性毒性研究（ 1994）。 急性毒性的研究結(jié)果表明，大白鼠 8178996重 )，小白鼠的 重 )，均在實際無毒級范疇 (實際無毒大白鼠口服 :5000 15000 重）。 在蓄積毒性試驗中，王玉春等選用 1/20、 1/10 和 1/5 種劑量給小白鼠連續(xù)灌胃 20 天，繼續(xù)觀察 7 天，結(jié)果小白鼠全部存活，毛順而光澤，生長正常，均比對照組多增重 2g， 10 天后剖檢觀察無異常變化，表明喹烯酮在小白鼠體內(nèi)無明顯的蓄積作用。 在亞急性毒性實驗中，王玉春等分別在 飼料中添加 50mg/75mg/100mg/150mg/00mg/個濃度的喹烯酮飼喂大白鼠和小白鼠，經(jīng)過 90 天的飼喂，結(jié)果顯示大白鼠和小白鼠均未出現(xiàn)異常。 在進(jìn)行慢性毒性研究時，他們分別在飼料中添加 75mg/150mg/ 300mg/個不同濃度的喹烯酮飼喂昆明小白鼠，試驗期為 20 個月，得出的結(jié)論是：小白鼠死亡數(shù)明顯低于空白對照組，差異顯著（ p ,且色譜峰型對稱。 第四章 雞糞中喹烯酮代謝物的鑒定 40 質(zhì)譜裂解碎片探討 喹烯酮及其代謝物（除了 3喹噁啉 化學(xué)結(jié)構(gòu)上具有高度的類似性（見圖），從這些化合物的子離子質(zhì)譜圖也能證明這一點，對各化合物的準(zhǔn)分子離子 M+H+的子離子質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)其質(zhì)譜斷裂方式存在共性（圖 4 m/各化合物都有的碎片離子；除了脫二氧喹烯酮外，其他幾個化合物都共有碎片 m/此之外，喹烯酮和 1m/143 和 197。 圖 4喹烯酮及其代謝物的碎片結(jié)構(gòu) 4of 結(jié)腸造口術(shù)分別收集雞的尿液和糞 本論文在最初的論文設(shè)計時考慮過分別檢測雞的尿液和糞中的喹烯酮及其代謝物以進(jìn)行喹烯酮在雞的腎臟和肝臟的代謝與排泄研究。由于雞本身沒有膀胱，尿和糞都排入泄殖腔，難以采集到干凈的尿液和糞。因此我們根據(jù)文獻(xiàn)（郭小權(quán)等， 2004）對 4 6 周齡的黃羽雞進(jìn)行結(jié)腸造口術(shù)以分別收集雞的尿液和糞。手術(shù)進(jìn)行了兩次，三天的存活率都在 75%以上，但一周的存活率都為 0。由于此手術(shù)的存活率低很 難進(jìn)行給藥后的雞尿液和糞的分別收集。因此實驗放棄了此方案，最后采用現(xiàn)在的實驗方案。 喹烯酮在雞體內(nèi)可能的代謝途徑的推測 根據(jù)以上研究結(jié)果，我們對喹烯酮在雞體內(nèi)可能的代謝途徑作了推測，見圖 4果發(fā)現(xiàn)，其與其他喹噁啉 4 z 2 4 5m / z 1 4 3m / z 1 5 9m / z 1 3 1m / z 1 9 第四章 雞糞中喹烯酮代謝物的鑒定 41 2004)都是先還原脫去一個配位鍵的氧形成單氧化合物、接著還原再脫去另一個配位鍵的氧形成脫二氧化合物，最后經(jīng)過氧化水解生成代謝物喹噁酸類化合物。 圖 4喹烯酮在雞體內(nèi)可能的代謝物途徑 4of in 驗小結(jié) 本實驗通過液質(zhì)聯(lián)用法鑒定了雞糞中的喹烯酮及其代謝物，通過與合成代謝物對照證實，雞糞中除了含有原形藥物喹烯酮外，還存在四個代謝物： 14二氧喹烯酮和 3喹噁啉 中 14此基礎(chǔ)上推測出了喹烯酮在雞體內(nèi)可能的代謝物途徑。 O O HR e d u c t i o nh y d r o l y s i sR e d u c t i o 業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第五章 全文總結(jié) 42 第五章 全文 結(jié)論 采用液相色譜法建立測定飼料中喹烯酮含量的分析方法。方法簡單、實用，經(jīng)過方法認(rèn)證，各項指標(biāo)都符合要求。 通過化學(xué)合成制備了喹烯酮的四個代謝產(chǎn)物，經(jīng)紅外、紫外、核磁共振氫譜和電噴霧質(zhì)譜確定四個化合物分別為脫二氧喹烯酮、 14喹噁啉 采用液質(zhì)聯(lián)用鑒定雞糞中的喹烯酮代謝物，結(jié)果顯示，喹烯酮在雞體內(nèi)可代謝成多個代謝產(chǎn)物：脫二氧喹烯酮、 14喹噁啉 中 14雞體內(nèi)發(fā)現(xiàn)。 推測出喹烯酮在雞體內(nèi)可能的代謝物途徑：先還原脫去一個配位鍵的氧形成單氧化合物、接著還原再脫去另一個配位鍵的氧形成脫二氧化合物，最后經(jīng)過氧化水解生成代謝物 3喹噁啉 參考文獻(xiàn) 43 參考文獻(xiàn) 1. 古利， 噴霧質(zhì)譜應(yīng)用技術(shù)北京：化學(xué)工業(yè)出版社， 2005： 11. 鄧云波，段蘇華，陳啟友 . 喹乙醇的特性及其規(guī)范合理使用 J. 河南畜牧獸， 2004， 1：14. 郭小權(quán)，唐建霞，黃克和，侯加法 指標(biāo)和尿沉渣的研究 J2004， 35(1)： 6. 金錄勝 法測定喳烯酮及其制劑含量 J. 中國獸藥雜志， 2003， 37(5)： 25. 李慧義，羅淑榮 國外醫(yī)學(xué)藥學(xué)分冊， 1997， 24(5)： 257. 李劍勇，李金善，徐忠贊，杜小麗，苗小樓，趙榮材，柳軍席，薛飛群 . 喹烯酮在豬、雞體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究 J. 畜牧獸醫(yī)科技， 2002， 34(1)： 94. 李劍勇，李金善，徐忠贊，趙榮材，苗小樓，張繼瑜，魯潤華 J. 動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展， 2004， 25(4)： 117. 李劍勇，李金善，徐忠贊，趙榮材，苗小樓 . 高效液相色譜儀檢測豬組織器官喹烯酮?dú)埩舴椒ǖ慕?J. 中國獸醫(yī)科技， 2003， 33（ 8）： 48. 李劍勇，趙榮材，李金善，柳軍席，徐忠贊，杜小麗，苗小樓，薛飛群 . 喹烯酮在豬體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究 J. 中國獸醫(yī)科技， 2001， 31(8)： 310. 李劍勇，周緒正，李金善，趙榮材，苗小樓，張繼瑜，張萍 . 氚標(biāo)喹烯酮在雞體內(nèi)的代謝動力學(xué)研究 J. 毒理學(xué)雜志， 2005， 19(3)增刊： 273 11. 梁曉東 2002， 23(4)： 2342. 苗小樓，徐忠贊，薛飛群等 J. 中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志， 2000， 3： 41. 13. 苗小樓，徐忠贊 . 紫外分光光度法喹烯酮及其預(yù)混劑 J. 中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志， 2000， 19（ 3）：41 14. 宋振玉主編 法、應(yīng)用 人民衛(wèi)生出版社， 1990 15. 王艷春 . 用 檢測飼料添加喹烯酮中的有關(guān)物質(zhì) J. 中國獸藥雜志， 1999， 33（ 1）：256. 王玉春， 薛飛群，