密級(jí)： 論文編號(hào)： 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 博士學(xué)位論文 桿狀病毒泛素、多角體基因啟動(dòng)子分析 及表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用 as 士研究生：林 旭 璦 指 導(dǎo) 教 師：張 志 芳 研究員 沈 桂 芳 教 授 申請(qǐng)學(xué)位類別：農(nóng)學(xué)博士 專 業(yè)：特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物飼養(yǎng) 研 究 方 向：病毒分子生物學(xué) 培 養(yǎng) 單 位：研究生院 蠶業(yè)研究所 提交日期 2006年06月 as of 2006 獨(dú) 創(chuàng) 性 聲 明 本人聲明所呈交的論文是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過(guò)的研究成果，也不包含為獲得中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院或其它教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過(guò)的材料。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說(shuō)明并表示了謝意。 研究生簽名： 時(shí)間： 年 月 日 關(guān)于論文使用授權(quán)的聲明 本人完全了解中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院有權(quán)保留送交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。同意中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院可以用不同方式在不同媒體上發(fā)表、傳播學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容。 (保密的學(xué)位論文在解密后應(yīng)遵守此協(xié)議) 論文作者簽名： 時(shí)間： 年 月 日 導(dǎo)師簽名： 時(shí)間： 年 月 日 論文評(píng)閱人、答辯委員名單 論文題目 桿狀病毒泛素、多角體基因啟動(dòng)子分析及表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用 論文作者 林旭璦 指導(dǎo)教師 張志芳 沈桂芳培養(yǎng)單位 蠶業(yè)研究所 姓名 職稱職務(wù) 導(dǎo)師類別 單位 專業(yè) 陳建國(guó) 教授 博導(dǎo) 北京大學(xué)生命科學(xué)院 細(xì)胞生物學(xué)及遺傳學(xué) 徐衛(wèi)華 教授 博導(dǎo) 中國(guó)科技大學(xué)生命科學(xué)院 生化與分子生物學(xué) 評(píng) 閱 人 周 婷 研究員 碩導(dǎo) 中國(guó)農(nóng)科院蜜蜂研究所 動(dòng)物病理學(xué) 答辯 主席 吳祥甫 研究員 博導(dǎo) 中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院 病毒分子生物學(xué) 孫崇榮 教授 博導(dǎo) 復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)院 生物化學(xué) 華 剛 研究教授 博導(dǎo) 美國(guó)佐治亞大學(xué)生科院昆蟲系 昆蟲分子生物學(xué) 魯興萌 教授 博導(dǎo) 浙江大學(xué)動(dòng)科院 昆蟲病理學(xué) 時(shí)連根 教授 博導(dǎo) 浙江大學(xué)動(dòng)科院 分子生物學(xué) 張耀洲 教授 博導(dǎo) 浙江理工大學(xué) 病毒分子生物學(xué) 李奕仁 研究員 博導(dǎo) 中國(guó)農(nóng)科院蠶研所 特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物飼養(yǎng) 答 辯 委 員 答辯時(shí)間與地址 2006年06月17日，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所 記錄人員 任永利 I 摘 要 本文圍繞桿狀病毒泛素（因啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)及功能元件、桿狀病毒與桿狀病毒晚期基因泛素表達(dá)的病毒因子、耐高溫（1）桿狀病毒隆的啟動(dòng)子與3株及該序列中具有兩個(gè)桿狀病毒晚期基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)個(gè)病毒感染后約12 具有多個(gè)轉(zhuǎn)錄本。 382 124 187 有一個(gè)基序和具有啟動(dòng)子的活性。 對(duì)（2）桿狀病毒病毒感染的情況下，式連接的式作用則為9倍。382 對(duì)于極晚期式連接的告質(zhì)粒與用報(bào)告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染家蠶5齡第二天的幼蟲，（3）參與桿狀病毒晚期基因過(guò)構(gòu)建參與獨(dú)的立即早期基因報(bào)告基因的表達(dá)量較低。在（4）耐高溫得了能夠表達(dá)活性為10 ，19 。酶的最適反應(yīng)溫度為105 ，90保溫10 活性沒有大的影響，當(dāng)溫度升高到140 時(shí)，酶活才會(huì)急劇下降；二價(jià)離子及高鹽對(duì)表達(dá)的步純化的上清酶液中含有約80以上的重組蛋白。耐高溫該酶的大規(guī)模生產(chǎn)及應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。 關(guān)鍵詞 桿狀病毒，啟動(dòng)子，病毒因子，基因表達(dá) e of E1 on in as as of (1) of it 6 3 of of is a it at 2 or or of 595 382 bp TG 382 124 bp TG 383 187 bp in of of (2) on of in of 2- in or in 10- in in a of of 595 382 bp TG in of 83- in in 21in in r3 or in of (3) of in of n we a to is on of a NA et t A of in in of m in on of of in to in to of (4) of in n we to 0% in a of at .0 05 , on of to 0% of to 0 ml 9 of 85 U 錄 摘要. 目錄. 中英文縮略表. 第一章 研究目的、內(nèi)容和意義.究目的.1 究?jī)?nèi)容.2 . .桿狀病毒. 病毒因子對(duì)桿狀病毒泛素基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控作用. 耐高溫. 究意義.3 第一部分 桿狀病毒.二章 文獻(xiàn)綜述5 .泛素依賴的蛋白水解系統(tǒng).病毒泛素基因的研究.病毒編碼的啟動(dòng)子概況8 9 .10 12 13 .14 .三章 材料和方法蘇、傳代及病毒繁殖17 存. 復(fù)蘇 V . 病毒基因組模板 質(zhì)粒模板 普通18 通. 定點(diǎn)突變.19 制性內(nèi)切酶反應(yīng).璃奶法純化回收段19 .20 光素酶報(bào)告質(zhì)粒的構(gòu)建.腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備和質(zhì)粒轉(zhuǎn)化. 少量制備.20 量制備.21 粒轉(zhuǎn)化.21 粒 小量抽提.21 量抽提.22 毒基因組文庫(kù)的構(gòu)建. 基因組. 基因組. 連接，轉(zhuǎn)化及擴(kuò)增.23 粒.胞裂解和熒光素酶活性的測(cè)定、蛋白質(zhì)定量. 細(xì)胞裂解. .24 白濃度測(cè)定.胞總.機(jī)引物法標(biāo)記雜交探針26 .26 膜和沖片.26 第四章因啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)與功能分析27 28 . 方法.28 果. 桿狀病毒.30 31 32 論.五章 晚期啟動(dòng)子的激活作用料方法.39 告質(zhì)粒的構(gòu)建.39 . .39 蠶飼養(yǎng)和轉(zhuǎn)染.40 果. 功能質(zhì)粒的構(gòu)建.40 . . .42 論.六章 參與桿狀病毒泛素基因轉(zhuǎn)錄的病毒因子的研究48 料方法.49 毒和細(xì)胞 時(shí)表達(dá)分析49 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 果. .50 病毒因子的突變分析 論.二部分 耐高溫葡萄糖苷酶在家蠶桿狀病毒中的表達(dá)55 第七章 引言55 狀病毒表達(dá)系統(tǒng)研究. 轉(zhuǎn)移載體的發(fā)展.55 本病毒及重組介質(zhì)的改良 外源蛋白表達(dá)的影響因素 表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用溫. 59 第八章 耐高溫葡萄糖苷酶在家蠶桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)中的表達(dá)、特性 分析及純化. 料和方法. 耐高溫古細(xì)菌(因組. 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 超速離心法制備病毒因組. 因組線性化. 共轉(zhuǎn)染 重組病毒的篩選、純化和擴(kuò)增 . 家蠶接種和樣品的初步純化 64 泳.64 65 高溫. 果. . 同源重組及重組病毒的篩選67 組病毒在家蠶中的表達(dá)及初步純化 表達(dá)的外源蛋白的特性分析 論.九章 結(jié) 論74 9.1 74 75 與.高溫.考文獻(xiàn). 謝.者簡(jiǎn)歷. 錄. 文縮略表 英文縮寫 英文全稱 中文名稱 狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng) 蠶 蠶核型多角體病毒 BV 病毒 分鐘計(jì)數(shù) 牛血清 GV 粒體病毒 染后時(shí)間 染后時(shí)間 ie 即早期基因 期表達(dá)因子 光素酶基因 型多角體病毒 放閱讀框 OV 涵體病毒 酸鹽緩沖液 合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) NA 斑形成單位 HD 物同源異型域 角體基因 地夜蛾 5 非編碼序列 素羧基延伸蛋白 素蛋白酶體途徑 素 晚期表達(dá)因子 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第一章 研究目的、內(nèi)容與意義 1 第一章 研究目的、內(nèi)容與意義 、桿狀病毒是目前所知唯一編碼泛素蛋白的病毒，病毒通過(guò)泛素而改變其感染細(xì)胞的微環(huán)境，使病毒免受宿主免疫系統(tǒng)的攻擊。轉(zhuǎn)錄調(diào)控是基因表達(dá)的主要調(diào)控環(huán)節(jié)，而啟動(dòng)子及其側(cè)翼區(qū)的調(diào)控元件對(duì)基因的表達(dá)及表達(dá)量起關(guān)鍵作用。通過(guò)分析家蠶核型多角體病毒（苜蓿尺蠖核型多角體病毒（因啟動(dòng)子的特性，以期加深關(guān)于病毒對(duì)宿主侵染機(jī)制的認(rèn)識(shí)，為病毒在宿主體內(nèi)的復(fù)制及病毒粒子的組裝和釋放研究提供基礎(chǔ)； 狀病毒基因組的復(fù)制表達(dá)是一個(gè)級(jí)聯(lián)事件，晚期和極晚期基因的表達(dá)均需要早期基因表達(dá)產(chǎn)物的參與。一些病毒反式激活因子，如在病毒復(fù)制的級(jí)聯(lián)事件中起著重要作用的立刻早期基因產(chǎn)物影響其后表達(dá)基因的轉(zhuǎn)錄，并為病毒復(fù)制所必需。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究桿狀病毒立即早期基因蛋白晚期基因啟動(dòng)子的反式激活作用機(jī)理，為構(gòu)建新的高效表達(dá)載體尋找實(shí)驗(yàn)依據(jù)；桿狀病毒同源區(qū)（列是分散在桿狀病毒基因組中的重復(fù)序列，已有實(shí)驗(yàn)證明具有增強(qiáng)子的作用，本文將昆蟲細(xì)胞和家蠶體內(nèi)進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)分析，探討狀病毒立即早期基因蛋白這種作用是微弱的，比存在一種或幾種病毒調(diào)控蛋白的整個(gè)病毒基因組明在病毒基因組中還存在其它的病毒因子參與了晚期基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄，本文通過(guò)篩選參與桿狀病毒泛素基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的病毒因子，為從分子水平上闡明病毒泛素基因的表達(dá)調(diào)控提供材料； 糖是乳制品中存在的主要碳水化合物，乳糖進(jìn)入體內(nèi)后經(jīng)小腸乳糖酶作用分解成葡萄糖和半乳糖。乳糖在腸道經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸可提高食物中鈣、磷、鉀、鐵等礦物質(zhì)的吸收利用。本研究利用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)耐高溫對(duì)其酶學(xué)特性進(jìn)行研究，建立高溫酶的純化方法。該研究解決了目前乳糖酶生產(chǎn)過(guò)程中的單位產(chǎn)量低、酶后加工困難的難題，對(duì)乳糖酶?jìng)鹘y(tǒng)的生產(chǎn)方法和工藝進(jìn)行了革新，為乳糖酶廉價(jià)生產(chǎn)提供了一種可行的新方法。 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第一章 研究目的、內(nèi)容與意義 2 桿狀病毒過(guò)翼區(qū)，插入普通載體中并進(jìn)行測(cè)序； 過(guò)軟件分析兩個(gè)病毒株索啟動(dòng)子序列中可能含有的功能元件； 別含有缺失不同啟動(dòng)子調(diào)控區(qū)片段以及不同啟動(dòng)子元件發(fā)生突變的片段； 建各種修飾啟動(dòng)子控制下的轉(zhuǎn)染相應(yīng)的測(cè)定對(duì)桿狀病毒桿狀病毒根據(jù)文獻(xiàn)資料，以桿狀病毒表達(dá)載體隆多角體基因的啟動(dòng)子序列（包含載體的多克隆位點(diǎn)）； 獲得的建重組質(zhì)粒構(gòu)建的質(zhì)粒外表達(dá)分析，分析建重組質(zhì)粒進(jìn)行表達(dá)分析； 、定報(bào)告基因的表達(dá)量； 、定報(bào)告基因的表達(dá)量，并進(jìn)行中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第一章 研究目的、內(nèi)容與意義 3 建文庫(kù)選能夠顯著提高啟動(dòng)子活性的文庫(kù)質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序； 測(cè)序結(jié)果與定病毒因子； 克隆可能的病毒因子與次對(duì)其進(jìn)行確證。 據(jù)隆入通用載體測(cè)序； 目的片段亞克隆入桿狀病毒表達(dá)載體建重組表達(dá)質(zhì)粒、選、純化重組病毒； 重組病毒感染家蠶5齡幼蟲，收集血淋巴或發(fā)病蠶體； 表達(dá)的研究意義 對(duì)桿狀病毒基因啟動(dòng)子的研究為了解真核生物基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控提供了模型。泛素依賴的蛋白降解系統(tǒng)廣泛存在于真核生物，對(duì)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)蛋白周轉(zhuǎn)，參與細(xì)胞多種生命過(guò)程均有重要作用。泛素啟動(dòng)子在真核細(xì)胞中的強(qiáng)啟動(dòng)子作用不僅與其核心區(qū)域的多種轉(zhuǎn)錄因子有關(guān)，也與泛素在細(xì)胞中的正常功能有關(guān)。由于泛素啟動(dòng)子不受組織細(xì)胞的限制，因而能夠廣泛用于基因治療載體的構(gòu)建，對(duì)病毒基因啟動(dòng)子的研究對(duì)于開發(fā)新型基因工程桿狀病毒表達(dá)載體及殺蟲劑具有實(shí)踐上的重要意義。 病毒基因結(jié)構(gòu)、功能和表達(dá)調(diào)控的研究是分子生物學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。其核心內(nèi)容是揭示病毒基因組復(fù)制機(jī)理以及早期基因?qū)ν砥诨虻恼{(diào)控機(jī)制。桿狀病毒基因的表達(dá)是以極其復(fù)雜的級(jí)聯(lián)式調(diào)控方式進(jìn)行的，晚期和極晚期基因的表達(dá)需要早期基因表達(dá)產(chǎn)物的反式激活。對(duì)參與桿狀病毒晚期基因表達(dá)的病毒基因的鑒定，是研究參與晚期基因轉(zhuǎn)錄的這些病毒因子的認(rèn)知為建立體外研究病毒前的普遍觀點(diǎn)認(rèn)為增強(qiáng)子序列只有與啟動(dòng)子順式連接時(shí)才具有增強(qiáng)子的作用，并且對(duì)晚期和極晚期基因是不具有增強(qiáng)作用的，本研究認(rèn)為在 第一章 研究目的、內(nèi)容與意義 4 時(shí)，無(wú)論順式還是反式的進(jìn)深了對(duì)增強(qiáng)子作用方式的認(rèn)識(shí)。 于水解酶類，是纖維素分解酶系中的重要組成部分?？伤饨Y(jié)合于末端、非還原性的時(shí)釋放前世界上，尤其是亞洲和非洲國(guó)家約有70%的人口由于小腸中缺乏葡萄糖苷酶而患有乳糖不耐受癥，導(dǎo)致了不能有效的吸收奶制品中的營(yíng)養(yǎng)元素。高溫菌來(lái)源的要達(dá)到工業(yè)化應(yīng)用首要的問(wèn)題應(yīng)是大幅度提高酶的產(chǎn)量及比活。桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)自建立以來(lái)已成功表達(dá)了大量有用蛋白，相對(duì)于大腸桿菌及酵母表達(dá)系統(tǒng)，成功克服了這兩種系統(tǒng)的分泌瓶頸及產(chǎn)量問(wèn)題，因而本研究利用家蠶而為規(guī)?；a(chǎn)乳糖酶提供了一條高產(chǎn)、簡(jiǎn)便、廉價(jià)的新途徑。 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第二章 文獻(xiàn)綜述 5 第一部分 桿狀病毒二章 文獻(xiàn)綜述 004年，諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)授予了三位在蛋白質(zhì)降解方面作出卓越貢獻(xiàn)的科學(xué)家，以表彰他們發(fā)現(xiàn)了泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解途徑。1975年 et 1975 首次從牛胸腺中分離到一種小分子蛋白質(zhì)，后來(lái)發(fā)現(xiàn)其廣泛存在于各種真核生物中，且不同種屬來(lái)源的這種蛋白質(zhì)具有類似的結(jié)構(gòu)、功能和免疫學(xué)作用，故命名為泛素（1991。大多數(shù)種屬的泛素由76個(gè)氨基酸組成，其分子量為8.3 素參與細(xì)胞周期的調(diào)控、應(yīng)激反應(yīng)、核糖體的生物合成、細(xì)胞分化等基本的細(xì)胞過(guò)程。 真核細(xì)胞編碼的泛素基因主要分為兩種類型。一類為多聚泛素基因（該類基因在染色體中由多個(gè)泛素基因單體頭尾相連，形成多個(gè)泛素單體的重復(fù)序列。由這類基因表達(dá)而合成的泛素常形成多聚體，并由泛素類基因的表達(dá)受到環(huán)境脅迫、胞內(nèi)代謝狀況和細(xì)胞分裂周期等多種因素調(diào)節(jié)et 1992；另一類為泛素延伸基因（該類基因的表達(dá)產(chǎn)物比泛素大的多，它是