密級(jí)： 論文編號(hào)： 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 博士學(xué)位論文 芽孢桿菌克隆及表達(dá)研究 A 博士研究生 ： 李雅楠 指導(dǎo)教師 ： 姚 斌 研究員 申請(qǐng)學(xué)位類別 ： 理學(xué)博士 專業(yè)： 生物化學(xué)與分子生物學(xué) 研究方向 ： 酶的分子生物學(xué) 培養(yǎng)單位 ： 研究生院 飼料研究所 提交日期 2006 年 6 月 2006 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 博士學(xué)位論文評(píng)閱人、答辯委員會(huì)名單表 論文題目 芽孢桿菌文作者 李雅楠 專 業(yè) 生化與分子生物學(xué) 研究方向 酶的分子生物學(xué) 指導(dǎo)教師 姚斌 培養(yǎng)單位（研究所、中心） 飼料所 姓名 職稱 碩（博）導(dǎo)師 單 位 專 業(yè) 簽 名 王 璋 教授級(jí)高工 碩導(dǎo) 博導(dǎo) 中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院 酶工程 錢世均 教授 碩導(dǎo) 博導(dǎo) 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所 酶分子生物學(xué) 評(píng) 閱 人 程治軍 研究員 碩導(dǎo) 博導(dǎo) 中國(guó)農(nóng)科院作物研究所 生物化學(xué)和分子生物學(xué) 答辯 主席 范云六 研究員 院士 碩導(dǎo) 博導(dǎo) 中國(guó)農(nóng)科院生物技術(shù)研究所 分子生物學(xué) 吳乃虎 研究員 碩導(dǎo) 博導(dǎo) 中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所 分子生物學(xué) 錢世均 研究員 碩導(dǎo) 博導(dǎo) 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所 酶分子生物學(xué) 宋 未 教授 碩導(dǎo) 博導(dǎo) 首都師范大學(xué)生物學(xué)院 分子生物學(xué) 莫湘筠 教授級(jí)高工 碩導(dǎo) 博導(dǎo) 中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院 酶工程 張志芳 研究員 碩導(dǎo) 博導(dǎo) 中國(guó)農(nóng)科院生物技術(shù)研究所 分子生物學(xué) 答 辯 委 員 伍寧豐 研究員 碩導(dǎo) 博導(dǎo) 中國(guó)農(nóng)科院生物技術(shù)研究所 微生物學(xué) 會(huì)議記錄（秘書） 袁鐵錚 論文答辯時(shí)間地點(diǎn) 農(nóng)科院飼料所 獨(dú) 創(chuàng) 性 聲 明 本人聲明所呈交的論文是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下 進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院或其它教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示了謝意。 研究生簽名： 時(shí)間： 年 月 日 關(guān)于論文使用授權(quán)的聲明 本人完全了解中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院有權(quán)保留送交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。同意中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院可以用不同方式在不同媒體上發(fā)表、傳播學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容。 (保密的學(xué)位論文在解密后應(yīng)遵守此協(xié)議 ) 論文作者簽名： 時(shí)間： 年 月 日 導(dǎo)師簽名： 時(shí)間： 年 月 日 I 中文摘要 一類能水解含有 于半纖維素酶類，主要來源于微生物，植物和低等動(dòng)物中。 品，飼料，制藥和石油開采等很多方面有重要的應(yīng)用價(jià)值。微生物則是產(chǎn) 生物來源的 控制和成本低等優(yōu)點(diǎn)。 芽孢桿菌是 有較大的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。本研究通過對(duì)核苷酸序列的比較，設(shè)計(jì)了一對(duì)簡(jiǎn)并引物，利用 術(shù)，建立了一種快速的篩選芽孢桿菌新的 種方法不僅可以快速評(píng)估所獲得的基因片段的新穎性，而且通過反向方法可以克隆到基因的全長(zhǎng)序列。利用此方法，從 16 株產(chǎn) 別克隆了其 過序列比對(duì)分析，其中兩個(gè)基因片段同已發(fā)表的 通過反向 到了兩個(gè)基因的全長(zhǎng)序列，分別命名為 冊(cè)號(hào)為 兩個(gè)基因同已發(fā)表的甘露聚糖酶基因序列的最高相似性分別為 通過同源克隆獲得另外一個(gè) 冊(cè)號(hào)為 上實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了這種快速篩選新基因方法的有效性。 來源于環(huán)形芽孢桿菌 甘露聚糖酶編碼基因 大腸桿菌和畢氏酵母中都得到了表達(dá)。通過親和層析，純化了在大腸桿菌中表達(dá)的融合蛋白 分析其酶學(xué)性質(zhì)。最適 最適溫度分別為 58；有較好的 定性，在 圍內(nèi)酶活性維持在 75%以上； 比活為 。 另一個(gè)來源于環(huán)形芽孢桿菌的新的甘露聚糖酶編碼基因 樣在大腸桿菌和畢氏酵母中得到了表達(dá)。通過親和層析，純化了在大腸桿菌中表達(dá)的融合蛋白 最適溫度分別為 60； 間較穩(wěn)定 , 剩余酶活性在75%以上， 在 ， 仍有 酶活性， 這說明此酶具有很好的 定性。 活的 。 從枯草芽孢桿菌 養(yǎng)液中純化了 最適 最適溫度分別為 50。 60下處理 60 分鐘， 持了 90%的酶活性； 比活為 。 金屬離子 （除了 和 ， 2酶活性均無明顯影響； 編碼基因 別在大腸桿菌和畢氏酵母中得到表達(dá)，并純化了酵母表達(dá)的融合蛋白 最適 最適溫度為 42。同原酶相比， 定性均有所降低 本實(shí)驗(yàn)初步建立了一種新基因的快速篩選方法， 利用此方法篩選了三個(gè) 實(shí)驗(yàn)為對(duì)新的 關(guān)鍵詞 ： 胞桿菌，新基因篩選，克隆 is an in of it is a of is by in as by is to As an a in A of of A CR be by 6 14 to as by of as of is of of . . . pH of 8 5% of in 9.0 is .0 0.0 of in 1.0 , .8 of to 36 pH 0 0% of 0 h. (g+), 2no on . . . pH 2 in of A in a 錄 中文摘要 第一章 引言 酶的來源及誘導(dǎo) 酶來源菌的篩選 酶的作用方式及水解產(chǎn)物 酶的基本性質(zhì) 酶的分離純化和活力測(cè)定 酶的分類 酶的分子生物學(xué) 酶的應(yīng)用 究的目的和意義 二章 芽孢桿菌 驗(yàn)材料 菌株與質(zhì)粒 引物合成 試劑盒、工具酶和生化試劑 溶液 培養(yǎng)基 實(shí)驗(yàn)儀器 驗(yàn)方法 芽孢桿菌 ( 芽孢桿菌 (誘導(dǎo)產(chǎn)酶 板 段的回收和連接 感受態(tài)細(xì)胞的制備 電轉(zhuǎn)化 重組子篩選 0 序 1 芽孢桿菌 果與分析 產(chǎn) 測(cè)得芽孢桿菌 章小結(jié) 三章 環(huán)形芽孢桿菌 甘露聚糖酶基因的克隆，表達(dá)和 酶的性質(zhì)分析 驗(yàn)材料 菌株與質(zhì)粒 1 物合成 試劑盒、工具酶和生化試劑 主要儀器 培養(yǎng)基配制 有關(guān)試劑和溶液配制 驗(yàn)方法 基因克隆 原核表達(dá)載體 的構(gòu)建 大腸桿菌中的表達(dá) 及檢測(cè) 核表達(dá)載體 構(gòu)建 畢赤酵母中的表達(dá)及檢測(cè) 大腸桿菌表達(dá)的 化 酶學(xué)性質(zhì)分析 結(jié)果與分析 基因克隆 基因表達(dá) 純化 性質(zhì)分析 章小結(jié) 四章 環(huán)形芽孢桿菌 甘露聚糖酶基因的克隆，表達(dá)和 酶的性質(zhì)分析 驗(yàn)材料 菌株與質(zhì)粒 引物合成 試劑盒、工具酶和生化試劑 主要儀器 培養(yǎng)基配制 有關(guān)試劑和溶液配制 驗(yàn)方法 基因克隆 原核表達(dá)載體 的構(gòu)建 大腸桿菌中的表達(dá)及 檢測(cè) 真核表達(dá)載體 構(gòu)建 真核表達(dá)載體 表達(dá)及檢測(cè) 大腸桿菌表達(dá)的 化 酶學(xué)性質(zhì)分析 果與分析 基因克隆 基因表達(dá) 純化 性質(zhì)分析 章小結(jié) 五章 枯草芽孢桿菌 甘露聚糖酶基因的克隆，表達(dá) 和酶的性質(zhì)分析 料與方法 菌株與質(zhì)粒 引物合成 試劑盒、工具酶和生化試劑 主要儀器 培養(yǎng)基 有關(guān)試劑和溶液配制 驗(yàn)方法 基因克隆 原核表達(dá)載體 構(gòu)建 大腸桿菌中的表達(dá)及檢測(cè) 真核表達(dá)載體 構(gòu)建 畢赤酵母中的表達(dá)及檢測(cè) 純化 重組 純化 果與分析 基因克隆 因表達(dá) 蛋白純化 性質(zhì)分析 重組的 章小結(jié) 六章 討論 于 向 技術(shù)的應(yīng)用 隆的 大腸桿菌中純化表達(dá)的 酶學(xué)性質(zhì) 化的四個(gè) 七章 結(jié)論 考文獻(xiàn) 謝 者簡(jiǎn)歷 國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第一章 引言 1 第一章 引 言 一類能水解甘露聚糖的半纖維素酶，存在于微生物 , 動(dòng)植物中。 植物半纖維素占植物干重的 35%，僅次于纖維素，是自然界中重要的可再生有機(jī)資源。半纖維素是由糖殘基通過均一聚合或非均一聚合而形成的一類碳水化合物總稱。與纖維素（ 葡聚糖主鏈） 相比， 半纖維素結(jié)構(gòu)與組成十分復(fù)雜 (et 1958; et 1958; et 1972 )。半纖維素分子鏈較短，并常帶有支鏈，糖殘基成分復(fù)雜，可以是五員環(huán)，也可以是六員環(huán) (包括木搪、甘露糖、半乳糖等 )。甘露聚糖是植物半纖維素的主要成份，是以 1,4 露聚糖可被分解為甘露糖。甘露聚糖的結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，如主鏈上某些殘基被葡萄糖取代或半乳糖通過 要有半乳甘露聚糖（ ，葡萄甘露聚糖（ ，半乳葡萄甘露聚糖（ 。 因此消化甘露聚糖主要是依靠 外還需要幾種酶的協(xié)同作用，包括： ， 外 ，甘露糖苷酶（ ，葡萄糖苷酶（ 脫乙酰酯化酶（ 支鏈酶（ 1997） 。 隨著對(duì) 酶在飼料、造紙、保健食品及生物技術(shù)研究等方面均得到了廣泛的應(yīng)用。 的來源及誘導(dǎo) 的來源 (1) 動(dòng)物來源 動(dòng)物 海洋軟體動(dòng)物 海洋軟體動(dòng)物短濱螺（ ， ，亮大蝸牛 (等，主要是從其腸道分泌液物中分離純化而來（ Xu et 2002; et 1995） 。 (2) 植物來源 植物 魔芋球莖（史益敏等， 1990； 杜先鋒等， 2000）和種子中，如南歐紫荊 (陶樂平， 1995)、番茄 (et 1997； et 1997)、萵苣 (et 1997)、黃檜 (et 2000)、芝麻 (et 2001)等，與種子的萌發(fā)密切相關(guān)。 史益敏等人 (史益敏等， 1990) 研究發(fā)現(xiàn)：在魔芋球莖發(fā)育的過程中始終具有 10 月底收獲后，球莖即進(jìn)入休眠期，這個(gè)階段酶活性保持相對(duì)穩(wěn)定，每毫克蛋白活性約在 4酶單位之間。球莖播種后，頂芽萌動(dòng)，迅速形成地上復(fù)葉，這時(shí)球莖中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第一章 引言 2 中 且隨著母球莖的快速消耗和解體，子球莖同時(shí)開始形成并膨大，但子球莖中酶活較低。 (3) 微生物來源 細(xì)菌中的芽孢桿菌， 如枯草芽孢桿菌 李文玉等， 2000； 余紅英等， 2003；羅強(qiáng)等 2003； et 2000； et 1998)、嗜堿芽孢桿菌 楊清香等， 1999；田新玉等， 1993)、地衣芽孢桿菌 張峻等， 2001；楊文博等， 1995)、短小芽孢桿菌 et 1990） 、嗜熱脂肪芽孢桿菌et 1999） 、 卵形擬桿菌 1987)；熱纖梭菌 1981)；纖維單胞菌屬 et 1999)。 真菌中的齊整小核菌 et 1998)， 曲霉如黑曲霉 劍芳等， 2002; 田亞平等 , 1998） ， 木霉中的里氏木霉 和平等， 2003） 、綠色木霉 et 1978)，青霉如 et 1987） ，放線菌中的諾卡氏菌形放線菌 襟等， 2000）等。 微生物來源的 本低、來源穩(wěn)定、提取方便等明顯優(yōu)點(diǎn)，已在實(shí)際生產(chǎn)和基礎(chǔ)研究中得到廣泛應(yīng)用 (1983)。 的誘導(dǎo) 大量研究表明， 于大部分產(chǎn) 培養(yǎng)基中添加少量的甘露聚糖就能提高產(chǎn)酶水平。楊文博（楊文博等， 1995）等對(duì)地衣芽孢桿菌產(chǎn)酶條件研究表明：以 1%的角豆膠或 1%的魔芋粉為碳源，可使細(xì)菌分泌酶活力達(dá)到 福綿等（崔福綿等， 1999）研究表明：在液體培養(yǎng)基中添加 4%的魔芋粉可使枯草芽孢桿菌分泌的酶活力達(dá)到 96U/萍萍等研究表明：以 4%的魔芋精粉為碳源，可使枯草芽孢桿菌 酶活達(dá)到 2800U/酶活水平為現(xiàn)已報(bào)道的同類酶中的最高水平（柴萍萍，中國(guó)農(nóng)大學(xué)位論文） 。 (et 2003)從 平對(duì)厭氧產(chǎn)孢子梭菌 細(xì)菌生長(zhǎng)過程呈持續(xù)低量表達(dá)。當(dāng)培養(yǎng)基中含有甘露聚糖時(shí)，會(huì)誘導(dǎo)酶的高水平表達(dá)。此外纖維素和木聚糖也會(huì)使 研究還表明在微生物生長(zhǎng)的開始階段主要是 在隨后的生長(zhǎng)階段則是纖維素酶基因表達(dá)增多。 此外，其它一些半纖維素類物質(zhì)或苯酚類化合