.,1,第四章細胞培養(yǎng)的基本技術(shù),解放軍總醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所免疫學研究室黃建華,.,2,細胞培養(yǎng)技術(shù)平臺,基因治療基因診斷試管嬰兒組織工程藥物篩選致病機理,.,3,主要內(nèi)容,基本操作技術(shù)和要求原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)和細胞系的維持細胞凍存與復蘇細胞培養(yǎng)污染的檢測和排除,.,4,細胞是生命活動的基本單位,1665年英國學者RobertHooke，用自制的顯微鏡觀察軟木的薄片，第一次發(fā)現(xiàn)植物的細胞結(jié)構(gòu)，并首次借用拉丁文Cella（小室）詞.1983-39德國植物學家施萊登和動物學家施旺確立了“細胞學說”的基本原則。（）細胞是有機體，動植物都是由細胞發(fā)育來的；（）每個細胞都作為一個相對的獨立單位，有自己的“生命”。（）新的細胞可以通過老的細胞繁殖產(chǎn)生。進化論，遺傳學和細胞學說定為現(xiàn)代生物學的三大基石，而細胞學說又是后二者的基石。,.,5,組織（細胞）培養(yǎng),從生物體內(nèi)取出細胞（組織），模擬體內(nèi)生理環(huán)境，在無菌、適當溫度和一定營養(yǎng)條件下，使之生存、生長并維持其結(jié)構(gòu)和功能的方法。細胞（組織），包括器官培養(yǎng)終歸是離體培養(yǎng)，缺少生物整體的嚴密聯(lián)系，不能代表整個機體。在進行醫(yī)學生物實驗過程及對結(jié)果的評估是都必須考慮這些。,.,6,1基本操作技術(shù)和要求,由于體外培養(yǎng)的細胞沒有抗感染能力，因此防污染是決定培養(yǎng)成功的首要條件。一切操作需要保證無菌和有條不紊。,.,7,1.1培養(yǎng)室內(nèi)的無菌技術(shù),培養(yǎng)前的準備：按實驗計劃和程序準備物品，作到心中有數(shù)培養(yǎng)室和超凈臺：定期全面徹底消毒培養(yǎng)用品的無菌處理：高壓滅菌、過濾、酒精消毒實驗中無菌培養(yǎng)操作：均在火焰近處進行，實驗用品需火焰滅菌，冷卻后接觸培養(yǎng)細胞，以防燒死細胞。,.,8,1.2培養(yǎng)細胞的取材,基本要求：取材組織用培養(yǎng)液浸泡，4度運送，24h內(nèi)盡快培養(yǎng)。取材無菌操作，避免對組織的機械損傷，盡量去除脂肪、神經(jīng)、結(jié)締、壞死組織，污染組織可用青鏈霉素和制霉菌素漂洗。原代取材同時保留組織學和電鏡標本，對供體來源、部位及一般情況做記錄。,.,9,1.2.3皮膚和粘膜的取材,皮膚和粘膜是上皮細胞培養(yǎng)的重要來源。取材方法似斷層皮片手術(shù)，面積2-3mm2.盡可能去除皮下和粘膜下組織。因分布在體表，故細菌、霉菌很多，需嚴格消毒，可用較高濃度抗菌素漂洗。,.,10,1.2.4內(nèi)臟和實體瘤的取材,內(nèi)臟除消化道和泌尿管道外基本是無菌的，明確取材部位，去除結(jié)締組織。腫瘤組織取材避免壞死液化和結(jié)締組織，標本應(yīng)按污染組織處理。,.,11,1.2.5血細胞的取材,血細胞培養(yǎng)可用于造血干細胞移植、免疫活性細胞的治療和染色體分析等。取血抗凝劑量過大易導致溶血，肝素常用濃度為20U/ml,針管用較高濃度肝素500U/ml濕潤。,.,12,1.3組織材料的分離,欲從組織中獲得大量生長良好的細胞，須將組織分散開，使細胞解離出來。常用方法有機械法和化學法。,.,13,1.3.1細胞懸液的分離方法,離心法：血液和體液等細胞懸液500-1000rpm轉(zhuǎn)速5-10分鐘。離心速度過大、時間過長，會造成細胞損傷和死亡。密度梯度離心法：用離心法將細胞分到不同密度的梯度介質(zhì)中，再分別吸出各層細胞。適于分離密度不等的的細胞。常用介質(zhì)有Ficoll400,Percoll,泛影葡胺等。,.,14,1.3.2.1機械分散法,適于較柔軟的組織，如腦、肝、脾、淋巴結(jié)、胸腺、胚胎組織和腫瘤組織等。剪切組織為1mm3碎塊后，置于組織勻漿研磨，或用吸管反復吹打分散組織細胞組織液放在注射器內(nèi)通過針頭壓出。注射器針芯擠壓后，用PBS液洗滌，分別通過不銹鋼篩網(wǎng)80,150,400目孔徑篩網(wǎng)。記數(shù)活細胞數(shù)，制成細胞懸液接種。,.,15,1.3.2.3消化分離法,消化法是結(jié)合生化和化學手段把已剪切成較小體積的組織進一步分化，獲得細胞懸液直接進行培養(yǎng),.,16,1.3.2.3.1胰蛋白酶法,主要作用是對細胞間蛋白質(zhì)水解，使細胞離散。活性以消化酪蛋白的能力測定，常用1：250消化效果與pH值、溫度、酶濃度和組織塊大小與硬度有關(guān)，對細胞分離作用與細胞的類型與性質(zhì)關(guān)系密切鈣鎂離子和血清抑制活性常用劑量為0.25%（0.1-0.5%），pH值8（8-9）溫度37。4度配制應(yīng)用液。,.,17,1.3.2.3.2膠原酶法,只對細胞間質(zhì)膠原組織起消化作用，使上皮細胞與膠原成份分離產(chǎn)品有I-VVII-IX等型，分別適用于分離肝細胞、胰島、脂肪細胞腎及纖維組織鈣鎂離子和血清不影響活性,pH.6.5-7常用劑量為200單位/ml或0.1g/ml0.3g/ml,.,18,1.3.2.3.3EDTA法,EDTA（二乙烯四乙酸二鈉）作用較緩和。主要作用：能從組織生長環(huán)境中吸取維持組織完整的鈣鎂離子。單獨使用不能使細胞完全分散，常用1:1的EDTA（0.02%）和胰蛋白酶0.25%混合液,.,19,2原代培養(yǎng),也稱初代培養(yǎng),是從供體取得組織細胞后在體外進行的首次培養(yǎng)。細胞保持原有的基本性質(zhì)，仍具二倍體遺傳物性。最接近和反映體內(nèi)生長特性。適合作藥物測試，細胞分化研究。原代培養(yǎng)細胞部分生物學特征尚不穩(wěn)定，供體和細胞間有很大差異。,.,20,2.1組織塊培養(yǎng)法,將組織剪成小塊后，接種于培養(yǎng)瓶，24小時貼壁后，細胞就從組織周圍長出。培養(yǎng)瓶底預先涂以膠原薄層，以利上皮細胞的生長。如需做組織染色或電鏡檢查，可將組織可放入小蓋玻片上后再放進培養(yǎng)瓶培養(yǎng)。換液需輕巧，以免組織塊漂起，細胞死亡,.,21,2.2消化培養(yǎng)法,采用前述的組織消化分散法。將妨礙細胞生長的細胞間質(zhì)去除，使細胞分散，形成懸液，按不同濃度接種培養(yǎng)瓶培養(yǎng)。,.,22,3傳代培養(yǎng)和細胞系的維持,培養(yǎng)細胞增殖長滿瓶壁時，既達到所謂的飽和密度。此時正常細胞則不再生長；惡性細胞重疊生長，易于從瓶壁上成片脫落,，為此傳代勢在必行。,.,23,培養(yǎng)細胞的生長過程,1）原代（初代）培養(yǎng)期：從機體取下組織培養(yǎng)到第一次傳代，此代細胞保持異質(zhì)性，細胞種類較多，接近原組織細胞種類。維持時間，因細胞種類不同，一般1-4周。2）傳代期培養(yǎng)：初代培養(yǎng)的細胞生長到一定程度，即可連接傳代，使其連續(xù)生長。一般正常二倍體細胞，不加附加條件，可傳代30-50代，此時可發(fā)生染色體丟失、突變、細胞增殖變慢、停止分裂，進入衰退期，我們稱之有限細胞系。這一轉(zhuǎn)折點有人稱之危象臨界點（crisis）有些細胞的少數(shù)后代，或通過人工條件轉(zhuǎn)化的細胞可通過這一期，獲得持久的增殖傳代能力，我們稱細胞系，或無限細胞系，即一般通稱的細胞系。,.,24,（3）衰退期：傳代細胞到達一定代數(shù)，即發(fā)生增殖緩慢，逐漸停止，進而發(fā)生衰退、死亡，多數(shù)傳代細胞（或叫有限細胞系），不能通過所謂的“crisis（危象臨界點），導致最終死亡，這一現(xiàn)象可能說明生物學衰老的細胞學基礎(chǔ)。人胚胎成纖維細胞可以進行60代增殖，而80歲老人的肺成纖維細胞僅傳代了16代后便死亡。表皮細胞壽命4-10天；紅細胞3周-3個月，白細胞5-7天，神經(jīng)細胞數(shù)年或更多。,.,25,密度抑制（Densityinhibition）或接觸抑制（Ccontactinhibition）,1958年Abercrombie等學者提出的一種現(xiàn)象，培養(yǎng)細胞再生長過程中多發(fā)生分裂增殖，細胞移動而相互靠近，這時某些細胞可移向其他方向，保證細胞不會重疊，一但接觸，這種活動即可停止。所謂接觸抑制實際使細胞匯合形成單層時，細胞變得擁擠，與培養(yǎng)液接觸的表面區(qū)域也相應(yīng)減少，營養(yǎng)成分消耗，其分裂也將停止。,.,26,細胞生長曲線,細胞數(shù)量,生長天數(shù),緩慢生長期,對數(shù)生長期,平衡期,.,27,（1）遲緩期（或延遲期）當細胞接種到培養(yǎng)瓶后，細胞逐漸貼附于瓶底，并恢復貼壁形狀，代謝開始旺盛，出現(xiàn)細胞分裂及增殖，但生長緩慢。（2）對數(shù)生長期：此期幾乎所有的細胞都在進行分裂，細胞數(shù)目迅速增長。期細胞倍增時間（TD）等于細胞周期時間（TC）長度。這一期常用細胞倍增時間及細胞分裂指數(shù)來判定。（3）平衡期（平坦期）這期細胞數(shù)目雖然在增加，但其增加速度在減慢，直至細胞數(shù)量不再增加，處于平衡狀態(tài)。,.,28,3.1原代細胞培養(yǎng)的傳代,細胞由培養(yǎng)瓶內(nèi)分離再培養(yǎng)稱之為傳代,進行一次分離再培養(yǎng)稱之為傳一代。原代培養(yǎng)的首次傳代是建系的關(guān)鍵時期，細胞需覆蓋大部分瓶底后再傳代。首次傳代時細胞接種數(shù)量要多一些，使細胞能盡快適應(yīng)新環(huán)境而利于細胞生存和增殖。,.,29,3.2細胞傳代方法,貼壁生長的細胞用消化法傳代；部分貼壁生長的細胞用直接吹打即可傳代；懸浮生長的細胞采用離心分離后傳代，,.,30,3.2.1貼壁細胞傳代步驟,吸除瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液；加入1ml消化液；37C或室溫25C消化25分鐘顯微鏡下進行觀察，發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮、細胞間隙增大后；直接加少許含血清的培養(yǎng)液，終止消化；細胞脫離瓶壁后形成細胞懸液計數(shù)，分別接種在新的培養(yǎng)瓶內(nèi)。,.,31,3.2.2懸浮細胞的傳代,直接傳代即讓懸浮細胞慢慢沉淀在瓶底后，將上清洗掉1/21/3，然后用吸管吹打形成細胞懸液后，再傳代。離心法：離心8001000rpm，5min，除上清，加新的培養(yǎng)液，然后傳代接種。部分貼壁生長細胞直接吹打傳代或需消化后傳代,.,32,3.3細胞系的維持,是通過換液、傳代和細胞凍存實現(xiàn)的：建立檔案：記錄組織來源，生物學特性，培養(yǎng)液要求、傳代、換液時間和規(guī)律，細胞的遺傳學標志，生長形態(tài)，常規(guī)病理染色的標本等。,.,33,3.3細胞系的維持,防細胞之間的交叉污染，傳代時所用器械要編號或做好標記每一種細胞系都應(yīng)有充足的凍存儲備，以防絕種；另外二倍體細胞等有限細胞系如果暫時不用最好凍存以免傳代太多，造成細胞衰老或發(fā)生改變,.,34,4.3.4培養(yǎng)細胞的純化,自然純化自然純化即利用某一種類細胞的增殖優(yōu)勢，而排除其它細胞生長，靠自然的增殖潛力最后留下生長優(yōu)勢細胞，去除其它細胞，達到細胞純化的目的。,.,35,4.3.4.2人工純化,利用人為手段造成對某一細胞生長有利的環(huán)境條件，抑制其它細胞的生長，從而達到純化細胞的目的。,.,36,3.4.2.1酶消化法,酶消化法：由于上皮細胞和成纖維細胞對胰蛋白酶的耐受性不同,，成纖維細胞先脫壁，而上皮細胞要消化相當長的時間才脫壁，利用這種差異采用多次差別消化方法將上皮細胞和成纖維細胞分開。,.,37,3.4.2.2機械劃除法,機械劃除法：上皮細胞和成纖維細胞多數(shù)都同時出現(xiàn)，混雜生長常常分區(qū)呈片，采用機械的方法去除不需要的細胞區(qū)域，而保留需要的細胞。,.,38,3.4.2.3反復貼壁法,成纖維細胞和上皮細胞相比，其貼壁過程快，大部分細胞常能在短時間內(nèi)大約1030min完成附著過程（但不一定完全伸展）；而上皮細胞大部分細胞在短時間內(nèi)不能附著或附著不穩(wěn)定，稍加振蕩即浮起，這樣可以利用此差別來純化細胞,.,39,3.4.2.4克隆法,將細胞分成單個細胞，使之分別生長成克隆，然后對每一克隆進行測試，選擇出所需要的克隆。,.,40,3.4.2.5培養(yǎng)基限定方法,某些細胞在生長過程中必須存在或必須去除某種物質(zhì)，否則將無法生長。而其它細胞與之相反，可以利用這種技術(shù)來純化細胞。如雜交瘤技術(shù)常用的HAT培養(yǎng)液，就用來篩選雜交瘤細胞而抑制其它細胞。,.,41,4.1細胞的凍存,凍存細胞要緩慢冷凍。減少細胞內(nèi)冰晶的形成是減少細胞損傷的關(guān)鍵。冷凍保護劑的使用，可使細胞免受冰晶形成和滲透壓改變而致的損傷。常用二甲基亞砜和甘油。凍存細胞最好每三個月復蘇一次，檢測細胞原特性是否改變。,.,42,細胞凍存步驟,取生長對數(shù)期的細胞消化成細胞懸離心細胞記數(shù)2.5x106/ml凍存液加含10%DMSO凍存液熔封置4度數(shù)小時，負20度過夜或-70C放置2-3h移入液氮罐中記錄,.,43,細胞復蘇步驟,取出安瓶立即放入37C水中消毒安瓶開封后將細胞移入離心管中加培養(yǎng)液離心記數(shù)接種培養(yǎng)瓶培養(yǎng),.,44,4.3培養(yǎng)細胞的運輸,冷凍儲存運輸，即利用特殊容器內(nèi)盛液氮或干冰凍存充液法：（1）選擇生長狀態(tài)良好的細胞。一般以生長1/31/2瓶底壁為宜，換新液，保留微量空氣，擰緊瓶蓋（2）用棉花等做防震防壓處理,.,45,5細胞培養(yǎng)污染的檢測和排除,培養(yǎng)細胞的污染概念包括所有混入培養(yǎng)環(huán)境中對細胞生存生存有害的成份和造成細胞不純的異物（真菌、細菌、病毒和支原體）、化學物質(zhì)及細胞,.,46,微生物污染的途徑,空氣：一般培養(yǎng)室環(huán)境中每立方米含菌數(shù)不應(yīng)超過15個器材：CO2溫箱操作血清組織樣本,.,47,微生物污染的檢測,真菌污染細菌污染支原體污染：可做如下檢測（1）相差顯微鏡檢測（2）熒光染色法（3）電鏡檢查（4）DNA分子雜交或支原體培養(yǎng)等方法,.,48,微生物污染的防治,防止的關(guān)鍵在于嚴格無菌操作，把好每一個關(guān)口，盡可能禁止其它污染的物品進入培養(yǎng)操作環(huán)節(jié)：,.,49,微生物污染的防治,抗生素：一般用常用量的510倍作沖擊療法。用藥2448h后，再換常規(guī)培養(yǎng)液。加溫處理：根據(jù)支原體對熱敏感的特點，將受支原體污染的細胞放置在41C作用510h，最長不超過18h，以殺滅支原體。動物體內(nèi)接種：將支原體污染的細胞接種在同種動物的皮下或腹腔，借動物體內(nèi)的免疫系統(tǒng)消滅支原體。待一定時間后取出細胞，做原代培養(yǎng)再進行繁殖。,.,50,細胞交叉污染,有效防止細胞交叉污染：所有器具要嚴格區(qū)分不要觸及培養(yǎng)液瓶瓶口細胞系都要在早期留有充足的凍存儲備，可以復蘇早期凍存細胞使用。,.,51,流式細胞儀分離法,流式細胞儀可根據(jù)細胞核酸含量、某些物質(zhì)含量或細胞結(jié)構(gòu)大小等參數(shù)來將細胞分離成不同的群體。,.,52,培養(yǎng)細胞生長狀態(tài)的觀察,貼附生長型為能附著于底物表面生長的細胞，懸浮生長型懸浮狀態(tài)即可生長，如血、骨髓脾細胞。,.,53,培養(yǎng)細胞的生長特性,貼附：附著于底物如其它細胞、膠元、玻璃或塑料，促細胞附著物質(zhì)如基膜素、纖維連接素、膠元、血清擴展因子可能參加細胞的粘附過程。接觸抑制：當兩個細胞相互接觸時，細胞不再移動，細胞膜皺褶樣活動停止。密度依賴性：細胞稀少時生長迅速，融合成片后，分裂停止。,.,54,常規(guī)觀察,需每天觀察細胞生長過程中出現(xiàn)的變化：1.培養(yǎng)液的顏色與透明度2.細胞形態(tài)變化3.細胞生長狀態(tài)4.微生物污染,.,55,細胞形態(tài)變化的觀察,相差顯微鏡：利用光通過不同物質(zhì)時的折射和物體厚度差別，產(chǎn)生衍射而引起光程改變，產(chǎn)生相位差的特性，用于觀察培養(yǎng)細胞的附著、貼壁、伸展、移動、有絲分裂等形態(tài)活動。狀態(tài)好的細胞透明度大，折光性強，輪廓清楚，分裂期細胞多見。狀態(tài)差的細胞，失去原來的特點，胞質(zhì)出現(xiàn)空泡、顆粒，細胞變形，出現(xiàn)死亡。,.,56,細胞計數(shù),它是了解細胞生長狀態(tài)的量化指標。制備細胞懸液，密度不低于10000細胞/ml，用10 x物鏡觀察計數(shù)板四角大方格的細胞數(shù)計數(shù)：細胞數(shù)/ml原液（4大格細胞數(shù)之合/4）X10000注意：細胞分散均勻制成單個細胞懸液。,.,57,活細胞的染料排除檢測法,細胞損傷或死亡時，細胞膜通透性發(fā)生變化，某些染料可穿透變性的細胞膜，與解體的DNA結(jié)合，使其著色，而活細胞能排出進入細胞內(nèi)的染料，或阻止這類染料進入細胞內(nèi)，因而不易著色。借此可以鑒別死活細胞。,.,58,細胞活力測定的MTT比色法,原理：活細胞的線粒體脫氫酶能將染料MTT（二甲基噻唑