1、1 口的：規(guī)范大腸桿菌檢查操作，保證檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確。2范圍：木程序適用于藥品大腸桿菌的檢杳。3責(zé)任者：qc員、qc復(fù)核人員、qc主任。4程序：4. 1試藥與試液除特別注明外，試驗(yàn)中所用的試劑均為分析純?cè)噭疄榧兓?. 1. 1 0. 9%無(wú)菌氯化鈉溶液取氯化鈉nacl9. 0g,加水使溶解成1000ml, 121°c滅菌20分鐘。4. 1. 2無(wú)菌磷酸鹽緩沖溶液(ph72)取磷酸氫二鈉na2hp04 121120 25. 8g 和磷酸二氫鈉naii2p04 11204. 4g,加水 使溶解至1000ml, 121°c滅菌20分鐘。4. 1.3 a 蔡酚乙醇試液取u 蔡酚

2、6. 0g,加無(wú)水乙醇溶解使成100ml o4. 1.4 40 %氫氧化鉀試液取氫氧化鉀40g,加水溶解使成100ml o4. 1.5靛基質(zhì)試液取對(duì)二甲氨基苯甲醛c9hlln0lg,加入95%乙醇c2h5oh95ml,充分振搖,使 完全溶解后，取濃鹽酸hcl20ml徐徐滴入，邊加邊振搖，以免驟熱導(dǎo)致溶液色 澤變深，置冰箱保存，備用。4. 1.6甲基紅試液取甲基紅c15h15n302j0. lg,加95%乙醇c2h50h300m 1與水適量，使溶解,再 加水至500ml,即得。4. 1.7 v-p 試液取a-蔡酚c10h70hj6. 0g,加無(wú)水乙醇c2ii50ii使溶解成100mlo另取氫氧化

3、鉀40. 0g,加水使溶解成100mlo分別將試藥與各溶劑混合即得。4. 1.8革蘭染色液4.1.8.1沙黃染液取沙黃0. 25g,加95%的乙醇c2h50h10ml,使完全溶解后,加水至100ml«standard operating procedure部門(mén)：題目：大腸桿菌檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作程序共10頁(yè)第2頁(yè)編號(hào)：s/s0p/qc-046-0起草：部門(mén)審核：質(zhì)量部審核：批準(zhǔn)：實(shí)施日期:4. 1.8.2結(jié)晶紫染液取結(jié)晶紫c25h30cln31.0g,加95%的乙醇c2h50h20ml,使溶解,加1%的草酸 鍍?nèi)芤?0ml,混勻。靜置48小時(shí)使用，置密閉棕色瓶中儲(chǔ)存。4. 1.8.3碘試液

4、取碘化鉀ki2.0g,加水35ml使溶解,加入碘片i21.0g,使全部溶解后,加 水稀釋至300ml,置密閉棕色瓶中儲(chǔ)存。4. 1.8.4 95% 乙醇。4.1.9浪麝香草酚藍(lán)指示液4.2培養(yǎng)基的種類4.2. 1營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基4.2.2營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基4.2.3膽鹽乳糖培養(yǎng)基（bl）4.2.4 4-甲基傘形酮葡糖甘酸培養(yǎng)基（mug）4.2.5乳糖培養(yǎng)基4. 2. 6 5%乳糖培養(yǎng)基4.2.7蛋白豚水培養(yǎng)基4.2.8磷酸鹽葡萄糖豚水培養(yǎng)基4.2.9枸橡酸鹽培養(yǎng)基4. 2. 10曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基（emb）43對(duì)照用菌液取大腸桿菌cmcc （b） 44102的營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物少許，接種至5ml營(yíng)

5、養(yǎng) 肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，36±1°c培養(yǎng)1824小時(shí)后，用0. 9%無(wú)菌氯化鈉溶液稀釋至1:106, 使對(duì)照菌液加入量含菌50100個(gè)（一般用量為0. lml）,其菌數(shù)在做陽(yáng)性對(duì)照的 同時(shí)用營(yíng)養(yǎng)瓊脂注皿或平板涂布，經(jīng)培養(yǎng)后計(jì)數(shù)確定。4. 4儀器與設(shè)備4. 4. 1菌檢室。4. 4.2凈化工作臺(tái)，恒溫培養(yǎng)箱（36±1°c）,微波爐，恒溫水浴（45±1°0 ,高 壓蒸汽滅菌器，電冰箱，勻漿儀，離心機(jī)（5004000轉(zhuǎn)/分鐘），顯微鏡（1500standard operating procedure部門(mén)：題目：大腸桿菌檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作程序共10頁(yè)第

6、3頁(yè)編號(hào)：s/s0p/qc-046-0起草：部門(mén)審核：質(zhì)量部審核：批準(zhǔn)：實(shí)施日期:倍），紫外燈（366nm）o4. 4. 3薄膜過(guò)濾裝置：微孔濾膜直徑約50mm,孔徑0. 45±0. 02pm。8.4錐形瓶（250300ml,內(nèi)裝玻璃珠若干），研缽（陶瓷制，直徑1012cm）、 培養(yǎng)皿（9cm）,量筒（100ml）,試管（18x180mm）及塞，吸管（lml分度0.01, 10ml分度0. 1）,注射器（20ml或30ml）,注射針頭,載玻片，蓋玻片、玻璃消 毒缸（帶蓋）。4.4.4玻璃器血用前應(yīng)洗滌干凈，無(wú)殘留抗菌物質(zhì)。吸管口上端距0.5cni處塞入 約2cm的適宜疏松棉花，置吸管

7、桶內(nèi)或牛皮紙袋屮。錐形瓶、量筒、試管均應(yīng)加 棉塞或硅膠塞，若用振蕩器制備混懸液時(shí)，訶需用玻璃紙包裹瓶塞，以免振蕩時(shí) 供試液污染瓶塞，再用牛皮紙包扎。玻璃器皿，均于160°c干熱滅菌2小時(shí)或高 壓蒸汽121°c滅菌30分鐘,烘干備用。4. 4.5大、小橡皮乳頭（放于干凈帶蓋的容器屮，并應(yīng)定期用7075%乙醇溶液 浸泡）。4. 4.6無(wú)菌衣、帽、口罩、手套。洗凈后配套，用牛皮紙包嚴(yán)，滅菌，備用。 4.4.7接種環(huán)（口鐵金或銀銘合金，環(huán)徑45mm、氏度610cm）,乙醇燈，乙醇 棉球或碘伏棉球，滅菌剪刀或滅菌手術(shù)刀和滅菌躡子，滅菌鋼錐，滅菌稱樣紙， 不銹鋼藥匙，試管架，火柴，記號(hào)

8、筆，口瓷盤(pán)，洗手盆，陶瓦蓋（12cm）等。所冇進(jìn)入無(wú)菌室的物品必須經(jīng)過(guò)消毒或滅菌，應(yīng)嚴(yán)格按照菌檢室物品進(jìn)出 標(biāo)準(zhǔn)操作程序（sop qc-003-00）進(jìn)行操作。4.5準(zhǔn)備4. 5. 1供試品的檢驗(yàn)量4. 5. 1. 1所冇劑型的檢驗(yàn)量均需取2個(gè)以上包裝單位。4. 5. 1. 2固體制劑檢驗(yàn)量為10go4. 5. 1. 3液體制劑檢驗(yàn)量為10ml o4. 5.1.4特殊貴重或微量包裝的藥品，檢驗(yàn)量可酌減。除另有規(guī)定外，口服固 體制劑不低于3g,液體制劑采用原液者不得少于6ml,采用供試液者不得少于 3ml,夕卜用藥品不得少于5g。4. 5.2供試液的制備standard operating pr

9、ocedure部門(mén)：題目：大腸桿菌檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作程序共10頁(yè)第4頁(yè)編號(hào)：s/s0p/qc-046-0起草：部門(mén)審核：質(zhì)量部審核：批準(zhǔn)：實(shí)施日期:4. 5. 2. 1液體供試品。取供試品10ml,置滅菌錐形瓶中，加入90ml稀釋劑， 搖勻，作為1:10供試液。4. 5. 2. 2固體供試品。稱取供試品10g,置于勻漿杯或適當(dāng)滅菌容器中，加入 0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液100ml,用勻漿儀，振蕩器或乳缽研磨等方法分散混勻。4. 5. 2. 3含抑菌成分供試品。供試品按常規(guī)檢查法，加入規(guī)定量的對(duì)照菌。不 能檢岀時(shí)，該供試液須按以下方法之一或兩種以上方法聯(lián)合處理后，依法檢查。 同時(shí)做陽(yáng)性和陰性對(duì)照。4.

10、5. 2. 3. 1稀釋法。取規(guī)定量的供試液種入較大體積的培養(yǎng)基中，使該供試液 稀釋至不具抑菌作用的濃度。4. 5. 2. 3. 2離心沉淀集菌法。取規(guī)定量的供試液于無(wú)菌刻度離心管屮,3000轉(zhuǎn) /分鐘離心30分鐘，移去上清液，留底部集菌液約2沁，并稀釋該供試液至原規(guī) 定量。如冇不溶性藥渣，可先以500傳/分鐘離心5分鐘，取全部上層液，再按 上述方法集菌處理。4. 5. 2. 3. 3薄膜過(guò)濾法。取規(guī)定量的供試液于稀釋劑100ml屮，搖勻，以無(wú)菌 操作加入裝有直徑約50mm.孔徑不大于0. 45±0. 02 u m微孔濾膜的薄膜過(guò)濾器 內(nèi)，過(guò)濾，用稀釋劑沖洗濾膜，每次不少于100ml

11、,將培養(yǎng)基加入濾器或取岀濾 膜，加入增菌培養(yǎng)基中。4. 5. 2. 3. 4沉降法。取規(guī)定量供試液，自然沉降5分鐘，取上層液于100ml增 菌液中，本法適用于難溶于水的抗菌制劑。檢驗(yàn)程序standard operating procedure報(bào)告報(bào)告4.7液,增菌培養(yǎng)取膽鹽乳糖培養(yǎng)基(bl) 3瓶，每瓶各100mlo其中1瓶加入對(duì)照菌50100個(gè)作陽(yáng)性對(duì)照，笫3瓶加入與供試液等量的稀瓶分別加入規(guī)定量的供試部門(mén)：題目：大腸桿菌檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作程序共10頁(yè)第5頁(yè)編號(hào)：s/s0p/qc-046-0起草：部門(mén)審核：質(zhì)量部審核：批準(zhǔn)：實(shí)施日期:4.6釋劑作陰性對(duì)照。37°c培養(yǎng)1824小時(shí)(必要

12、時(shí)可延至48小時(shí))。陰性對(duì)照應(yīng)無(wú) 菌生長(zhǎng)。搖勻上述bl增菌培養(yǎng)液，以滅菌吸管取供試品膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)液、供試standard operating procedure部門(mén)：題目：大腸桿菌檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作程序共10頁(yè)第6頁(yè)編號(hào)：s/s0p/qc-046-0起草：部門(mén)審核：質(zhì)量部審核：批準(zhǔn)：實(shí)施日期:品陽(yáng)性對(duì)照培養(yǎng)液、陰性對(duì)照培養(yǎng)液各0.2ml,分別加入4-甲基傘形酮葡糖甘酸 培養(yǎng)基（mug）管，37°c培養(yǎng)4、24小時(shí)后，將各管置366nm紫外燈下觀察有無(wú) 藍(lán)口色熒光，然后靛基質(zhì)試液45滴于上述mug管內(nèi)，觀察液面顏色。mug陽(yáng)性 （有熒光）、靛基質(zhì)陽(yáng)性（玫瑰紅色），報(bào)告檢出大腸桿菌；mu

13、g陰性（無(wú)熒光）、 靛基質(zhì)陰性（無(wú)色），報(bào)告未檢出大腸桿菌。4. 8分離培養(yǎng)如mug陽(yáng)性、靛基質(zhì)陰性或mug陰性、靛基質(zhì)陽(yáng)性時(shí)，將上述供試品blo 增菌培養(yǎng)液輕輕搖動(dòng)，以接種環(huán)沾取12環(huán)培養(yǎng)液劃線于emb平板上，培養(yǎng) 1824小時(shí)，觀察eib平板有無(wú)可疑大腸桿菌菌落生長(zhǎng)。當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照的平板呈典 型菌落生長(zhǎng)時(shí)，供試品分離平板無(wú)菌落生長(zhǎng)，或有菌落但不同于表1所列特征， 可判為供試品lg或51未檢出大腸桿菌。表1大腸桿菌菌落形態(tài)特征培養(yǎng)基菌落彤態(tài)曙紅亞屮藍(lán)瓊脂（emb）典型菌落呈紫黑色，1員1形，稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，濕潤(rùn), 有金屬光澤。非典型菌落呈淺紫色、粉紅色，或菌落中心紫色或 無(wú)明顯暗色中

14、心，無(wú)金屬光澤。麥康凱瓊脂典型菌落呈鮮桃紅色，圓形，扁平，邊緣整齊，表面光滑，濕潤(rùn)。 非典型菌落呈微紅色，或菌落屮心呈紅色。當(dāng)陽(yáng)性菌對(duì)照平板未生長(zhǎng)或生長(zhǎng)菌落經(jīng)檢查不是大腸桿菌，應(yīng)研究原因，重 新試驗(yàn)或重新制備供試液，以消除供試品抑菌成分的影響。冇疑似菌落生長(zhǎng)者, 挑取可疑菌落做革蘭染色、鏡檢、imvic試驗(yàn)。4. 9純培養(yǎng)如生長(zhǎng)菌落與表1所列特征相符或疑似者，以接種針輕輕接觸單個(gè)疑似菌落 的表而屮心，沾取培養(yǎng)物，應(yīng)挑選23個(gè)以上疑似菌落，分別接種營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜而, 培養(yǎng)1824小時(shí),作以下檢查。如平板上無(wú)單個(gè)可疑菌落，但有可疑菌團(tuán)（紫黑色，或冇金屈光澤），應(yīng)沾 取可疑菌團(tuán)培養(yǎng)物少許，或重新取增菌培

15、養(yǎng)液劃線接種于emb瓊脂平板，培養(yǎng)standard operating procedure部門(mén)：題目：大腸桿菌檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作程序共10頁(yè)第7頁(yè)編號(hào)：s/s0p/qc-046-0起草：部門(mén)審核：質(zhì)量部審核：批準(zhǔn)：實(shí)施日期:1824小時(shí)，再挑選單個(gè)疑似菌落，純培養(yǎng)，作以下檢查。4.10革蘭染色、鏡檢4. 10. 1以接種環(huán)沾取無(wú)菌水于潔凈載玻片上，取上述疑似菌落的營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面 新鮮培養(yǎng)物少許，制成均勻涂片，口然或微溫干燥，再通過(guò)火焰23次（載玻片 不燙手）固定。4. 10. 2滴加結(jié)晶紫染液，染色1分鐘，水洗。4. 10. 3滴加碘液，媒染1分鐘，水洗，以濾紙吸干余水。4. 10. 4滴加95%乙

16、醇，脫色2030秒鐘,水洗。4. 10. 5滴加沙黃染液，復(fù)染1分鐘,待干后，鏡檢。4. 10. 6染色結(jié)果革蘭陽(yáng)性菌呈藍(lán)紫色；革蘭陰性菌呈紅色。大腸桿菌為革蘭陰性短桿菌，或 球桿菌狀，亦冇桿菌狀。4. 10. 7注意事項(xiàng)4. 10. 7. 1玻片必須潔凈，涂片菌量宜少，菌不可濃。否則，菌細(xì)胞成堆或連成 片。染色反應(yīng)難于判斷，菌細(xì)胞形態(tài)難于觀察。4. 10. 7. 2培養(yǎng)物的菌齡以1624小時(shí)為宜。培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)的革蘭陽(yáng)性菌易染成 紅色。4.10. 7. 3脫色是關(guān)鍵，脫色時(shí)間不足菌細(xì)胞易染成陽(yáng)性，脫色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)易染成 陰性。4. 11生化試驗(yàn)4.11.1乳糖發(fā)酵試驗(yàn) 取上述斜面培養(yǎng)物，接種于乳糖

17、發(fā)酵管，培養(yǎng)2448 小時(shí)，觀察產(chǎn)酸（指示劑為酸性品紅者為紅色;指示劑為混麝香草酚藍(lán)者為黃色）, 產(chǎn)氣（小倒管內(nèi)有氣泡，氣泡無(wú)論大?。楸苊膺t緩發(fā)酵乳糖產(chǎn)生假陰性，亦可接種5%乳糖發(fā)酵管。絕大多數(shù)遲緩 發(fā)酵乳糖的細(xì)菌，可于24小時(shí)出現(xiàn)陽(yáng)性?；蜻m當(dāng)延氏培養(yǎng)時(shí)間。4. 11.2靛基質(zhì)試驗(yàn)（1）取上述斜面培養(yǎng)物，接種于蛋口淼水培養(yǎng)基，培養(yǎng)2448小時(shí)，沿管壁加入 靛基質(zhì)試液數(shù)滴，輕輕搖動(dòng)試管，液而呈玫瑰紅色為陽(yáng)性，呈試劑本色為陰性。standard operating procedure部門(mén)：題目：大腸桿菌檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作程序共10頁(yè)第8頁(yè)編號(hào)：s/s0p/qc-046-0起草：部門(mén)審核：質(zhì)量部審核

18、：批準(zhǔn)：實(shí)施日期:98%的大腸桿菌靛基質(zhì)試驗(yàn)為陽(yáng)性。一般24小時(shí)即可出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果，以無(wú)菌操作 先從管屮取岀1或2ml培養(yǎng)液進(jìn)行檢查，如靛基質(zhì)是陰性，余下的蛋白陳水培養(yǎng) 物再培養(yǎng)24小時(shí)，作靛基質(zhì)試驗(yàn)。4. 11.3甲基紅試驗(yàn)（m）取上述斜面培養(yǎng)物，接種于磷酸鹽葡萄糖腺水培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48±2小時(shí)， 于培養(yǎng)液屮加入甲基紅指示液23滴（約每ml培養(yǎng)液加指示液1滴），輕微搖動(dòng), 立即觀察，呈鮮紅色或桔紅色為陽(yáng)性，呈黃色為陰性。4. 11. 4乙酰卬基卬醇生成試驗(yàn)（v-p）取上述斜面培養(yǎng)物，接種于磷酸鹽葡萄糖腺水培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48±2小時(shí)， 于2ml培養(yǎng)液屮加入a-荼酚乙醇試液ln

19、il,混勻，再加40%氫氧化鉀試液0. 4ml, 充分振搖，在4小時(shí)（通常在30分鐘）內(nèi)出現(xiàn)紅色應(yīng)判為陽(yáng)性，無(wú)紅色反應(yīng)為 陰性。4. 11.5枸椽酸鹽利用試驗(yàn)（c）取上述斜而培養(yǎng)物，接種于枸椽酸鹽培養(yǎng)基斜而上，培養(yǎng)24天，培養(yǎng)基斜 面有菌苔生長(zhǎng)，培養(yǎng)基由綠色變?yōu)樗{(lán)色時(shí)為陽(yáng)性，培養(yǎng)基顏色無(wú)改變、無(wú)菌苔生 長(zhǎng)為陰性。4. 12結(jié)果判斷4. 12. 1當(dāng)陰性對(duì)照試驗(yàn)呈陰性，陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)mug呈陽(yáng)性，供試品mug陽(yáng)性、 靛基質(zhì)陽(yáng)性，報(bào)告lg或lml供試品檢出大腸桿菌o mug陰性、靛基質(zhì)陰性,報(bào) 告lg或lml供試品未檢岀大腸桿菌。4.12.2 mug陽(yáng)性、靛基質(zhì)陰性、imvic試驗(yàn)為- + - -、

20、革蘭陰性桿菌，報(bào) 告lg或lml供試品檢岀大腸桿菌；mug陰性、靛基質(zhì)陽(yáng)性、imvic試驗(yàn)為+ - -、革蘭陰性桿菌，報(bào)告lg或lml供試品檢出大腸桿菌。4. 12. 3供試品培養(yǎng)物檢查不符合9. 6. 2二項(xiàng)屮的任一項(xiàng)，報(bào)告lg或lml供試 品未檢出大腸桿菌。4. 12. 4當(dāng)陰性對(duì)照有菌生長(zhǎng)或陽(yáng)性對(duì)照未生長(zhǎng)或生長(zhǎng)菌落不是大腸桿菌，不能 作出檢驗(yàn)報(bào)告。4. 13注意事項(xiàng)standard operating procedure 0腸 題大o i1i共第頁(yè)頁(yè)d_ 號(hào)so 縊s/ 草 起i 準(zhǔn) 批n4. 13. 1 mug法不必從混合菌中分離單個(gè)菌落。除大腸埃希菌外，|、的有部分志賀 菌屬、沙門(mén)菌

21、屬的菌株；以及少數(shù)革蘭陽(yáng)性球菌、桿菌和芽陀菌，其mug為陽(yáng)性。 因此，在mug培養(yǎng)基成分中增加丁去氧膽酸鈉，可排除革蘭陽(yáng)性菌的干擾。至于 志賀菌、沙門(mén)菌在膽鹽乳糖培養(yǎng)基屮較難生長(zhǎng)，即使有生長(zhǎng)，本法能檢出。既然 藥品中不得檢出大腸桿菌，更不允許檢出志賀菌、沙門(mén)菌。4. 13. 2配制mug培養(yǎng)基時(shí)，務(wù)必校正ph值，滅菌后ph不得過(guò)7. 4,否則ph 值偏高，mug分解，本身則顯熒光；分裝mug培養(yǎng)基的試管應(yīng)挑選，試管、蛋口 豚不得顯熒光。4. 13. 3培養(yǎng)時(shí)間供試品培養(yǎng)液接種于mug培養(yǎng)基屮的培養(yǎng)時(shí)間，一般在4小時(shí)、24小時(shí)觀 察是否產(chǎn)生熒光，如熒光很微弱，不能準(zhǔn)確判斷時(shí)，可延長(zhǎng)培養(yǎng)至48小時(shí)再觀 察結(jié)果。由丁大腸埃希菌各菌株間的gud的活性不完全相同，對(duì)底物和底物的濃 度反應(yīng)的差異；培養(yǎng)基中選擇因子的影響；培養(yǎng)時(shí)間、溫度；ph的改變；大量 競(jìng)爭(zhēng)菌和樣品本身物質(zhì)成分的干擾等，對(duì)結(jié)果的判斷亦有影響。4. 13.4結(jié)果觀察取供試品的mug試驗(yàn)