1、電鰩乙酰膽堿受體誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因小鼠重癥肌無(wú)力的機(jī)制                                    作者：金桂花李紅花 ，孟繁平 ，李英信 ，李芳芳 ，孫昌元 金權(quán)鑫【關(guān)鍵詞】  ,重癥肌無(wú)力;受體,膽堿能;小鼠,轉(zhuǎn)基因&

2、#160;      摘要 目的 探討電鰩乙酰膽堿受體誘導(dǎo)人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫性重癥肌無(wú)力的機(jī)制. 方法 將電鰩電器官分離并純化的乙酰膽堿受體作為免疫原，免疫人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠，以放射免疫方法測(cè)定小鼠血清中抗乙酰膽堿受體抗體滴度，以免疫熒光技術(shù)觀察小鼠骨骼肌中抗乙酰膽堿受體抗體的結(jié)合性. 結(jié)果 小鼠血清中的抗乙酰膽堿受體抗體滴度為155539pmol，小鼠肌肉中具有人抗乙酰膽堿受體抗體. 結(jié)論 電鰩乙酰膽堿受體刺激人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生的人抗乙酰膽堿受體抗體，可與肌肉組織中的乙酰膽堿受體結(jié)合，導(dǎo)致肌肉收縮無(wú)力，可誘導(dǎo)重癥

3、肌無(wú)力. 關(guān)鍵詞  重癥肌無(wú)力;受體，膽堿能;小鼠，轉(zhuǎn)基因    ABSTRACT:OBJECTIVE To investigate the pathogenesis of experimental autoimmune myasthenia gravis（EAMG），induced with Torpedo acetylcholine receptor（AChR），in mice transgenic for human immunoglobulin（Ig）loci.METHODS Mice transgenic for human Ig loci w

4、ere immunized with Torpedo AChR，isolated and purified from electronic organs of Torpedo.The titers of anti-mouse AChR antibody in the sera of mice were determined by radioimmunoassay.The binding of human anti-AChR antibodies to the AChR in the muscle of mice was measured by immunofluorescence techni

5、que.RESULTS The titers of anti-mouse AChR antibodies in the sera ranged from155to539pmol.The human anti-AChR antibodies were found to bind to the muscle section.CONCLUSION The human anti-AChR antibodies，secreted from the mice transgenic for human Ig loci，induced with Torpedo AChR，are able to bind to

6、 AChR in the mouse muscles，which leads to the damages  of AChR，resulting in the animal EAMG.    Key words:myasthenia gravis;receptors，cholinergic;mice，transgenic    抗乙酰膽堿受體抗體與神經(jīng)肌肉接頭處的乙酰膽堿受體結(jié)合，可激活補(bǔ)體而使突觸后膜乙酰膽堿受體遭到破壞，導(dǎo)致肌肉收縮無(wú)力，出現(xiàn)重癥肌無(wú)力癥狀.引起重癥肌無(wú)力的病因目前尚不清楚，但若給動(dòng)物免疫乙酰膽堿受體或注

7、射抗乙酰膽堿受體抗體，可引發(fā)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性重癥肌無(wú)力 1，2 .在以乙酰膽堿受體作為免疫原建立重癥肌無(wú)力動(dòng)物模型中，常用由電鰩電器官制備的乙酰膽堿受體，是因?yàn)殡婗幍囊阴Ｄ憠A受體含量及與哺乳類動(dòng)物骨骼肌乙酰膽堿受體的同源性均較高 3 .電鰩乙酰膽堿受體刺激動(dòng)物產(chǎn)生的抗電鰩乙酰膽堿受體抗體可與動(dòng)物本身骨骼肌的乙酰膽堿受體進(jìn)行交叉反應(yīng).本實(shí)驗(yàn)室曾報(bào)道了以電鰩乙酰膽堿受體免疫人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠建立重癥肌無(wú)力動(dòng)物模型 4 ，其中發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物出現(xiàn)重癥肌無(wú)力的關(guān)鍵癥狀，即肌肉收縮無(wú)力，血清中亦檢測(cè)到了抗電鰩乙酰膽堿受體抗體.本文探討了電鰩乙酰膽堿受體誘導(dǎo)人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫性重癥肌無(wú)力

8、的機(jī)制.    1 材料與方法    1.1 材料  含人免疫球蛋白，1，胚系基因的轉(zhuǎn)基因小鼠由荷蘭馬斯特里赫特大學(xué)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)學(xué)系神經(jīng)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室根據(jù)文獻(xiàn)5，6介紹的方法建立.電鰩乙酰膽堿受體由本實(shí)驗(yàn)室從電鰩電器官（Pacific Biomarine，California，USA）中分離，并經(jīng)眼鏡蛇毒素親和層析純化獲得 7 ; 125 I-銀環(huán)蛇毒素為英國(guó)Amersham Pharmacia Biotech公司產(chǎn)品;小鼠乙酰膽堿受體粗提液由本實(shí)驗(yàn)室從小鼠骨骼肌中提取;羊抗人免疫球蛋白血清為本實(shí)驗(yàn)室自制;羊抗人免疫球蛋白G購(gòu)自

9、美國(guó)Cappel，ICN Pharma-ceuticals公司，用時(shí)以1100稀釋;異硫氰酸熒光素標(biāo)記的兔抗羊免疫球蛋白抗體購(gòu)自德國(guó)Cappel，ICN Biochemicals公司，用時(shí)以150稀釋.    1.2 動(dòng)物的免疫  15g純化的電鰩乙酰膽堿受體中加入完全弗氏佐劑，注射于9只小鼠尾根部皮下，3，5周后分別以15g純化的電鰩乙酰膽堿受體加入不完全弗氏佐劑行加強(qiáng)免疫;對(duì)照組3只小鼠只注射完全弗氏佐劑或不完全弗氏佐劑.    1.3 抗乙酰膽堿受體抗體的測(cè)定  應(yīng)用放射免疫方法測(cè)定小鼠血清中抗乙酰膽堿受體抗

10、體的滴度. 將2nmol25 I-銀環(huán)蛇毒素混合入200L小鼠乙 酰膽堿受體粗提液內(nèi)，在4條件下標(biāo)記4h，加入5L動(dòng)物血清，4過(guò)夜，以過(guò)量的羊抗人免疫球蛋白血清沉淀小鼠乙酰膽堿受體-抗體復(fù)合物，用磷酸鹽緩沖液洗滌后，在計(jì)數(shù)儀上測(cè)定放射比活性.抗體滴度用每升-銀環(huán)蛇毒素結(jié)合摩爾數(shù)表示.                          &#

11、160;      1.4 骨骼肌抗乙酰膽堿受體抗體結(jié)合性測(cè)定  應(yīng)用免疫熒光技術(shù)觀察小鼠骨骼肌中抗乙酰膽堿受體抗體的結(jié)合性.將小鼠骨骼肌冰凍切片并以丙酮固定后，用20g/L牛血清白蛋白封閉15min，加入羊抗人免疫球蛋白G，作用45min，洗滌，加入異硫氰酸熒光素標(biāo)記的兔抗羊免疫球蛋白抗體，繼續(xù)作用45min，觀察結(jié)果.    2 結(jié)果    2.1 小鼠血清抗乙酰膽堿受體抗體滴度  在行第2次加強(qiáng)免疫注射電鰩乙酰膽堿受體3d后，心臟穿刺采血，檢查血清中抗體滴度.

12、9只實(shí)驗(yàn)小鼠的抗乙酰膽堿受體抗體滴度為155539pmol（Fig1）.    2.2 骨骼肌抗乙酰膽堿受體抗體的結(jié)合  免疫熒光觀察結(jié)果表明，小鼠肌肉冰凍切片中可見(jiàn)抗乙酰膽堿受體抗體（Fig2略）.    3 討論    建立了表達(dá)人免疫球蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠，這使制作 這種新的重癥肌無(wú)力動(dòng)物模型成為可能.人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠無(wú)論接受何種乙酰膽堿受體的免疫刺激，均將產(chǎn)生人免疫球蛋白，得到的重癥肌無(wú)力動(dòng)物模型在免疫學(xué)方面更接近人重癥肌無(wú)力.本研究結(jié)果表明，人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠在接受電鰩乙酰膽堿受

13、體刺激后，小鼠血清中抗乙酰膽堿受體抗體滴度在155539pmol范圍內(nèi)，僅為抗電鰩乙酰膽堿受體（免疫原）抗體滴度（6296nmol） 4 的0.2%，與Berman等 9 研究結(jié)果相一致.免疫熒光觀察證實(shí)，小鼠肌肉中存在人抗乙酰膽堿受體抗體.上述結(jié)果表明，電鰩乙酰膽堿受體作為免疫原，可刺激人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生人抗乙酰膽堿受體抗體，它可與肌肉組織中乙酰膽堿受體結(jié)合，導(dǎo)致乙酰膽堿受體功能失調(diào)，最終誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性重癥肌無(wú)力.人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫性重癥肌無(wú)力動(dòng)物模型的建立及其機(jī)制的闡明，為研究制作理想的重癥肌無(wú)力動(dòng)物模型奠定基礎(chǔ)，亦為獲得人源性抗乙酰膽堿受體單克隆抗體及基因

14、工程抗體提供了新的途徑.    參 考 文 獻(xiàn)    1 Meng F，Stassen M，Schillberg S，et al.Constructionand characterization of a single chain antibody fragment derived from thymus of a patient with myasthenia gravis J.Autoimmunity，2002，35:125.    2 De Baets M，Stassen M.The role of

15、 antibodies in myas- thenia gravisJ.J Neurol Sci，2002，202:5.    3 Lennon VA，Lindstrom JM，Seybold ME.Experimental autoimmune myasthenia:a model of myasthenia gravis in rats and guinea pigsJ.J Exp Med，1975，141:1365.4 李紅花，金桂花，孟繁平，等.重癥肌無(wú)力轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立J. 延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)學(xué)報(bào) ，2006，29（2）:79.  &#

16、160; 5 Lonberg N，Taylor LD，Harding FA，et al.Antigen-  specific human antibodies from mice compressing four distinct genetic modificationsJ.Nature，1994，368:856.    6 Fishwild DM，O'Donnell SL，Bengoechea T，et al. High-avidity IgGmonoclonal antibodies from a novel strain of minilocus transgenic miceJ.Nat Biotechnol， 1996，14:845.    7 楊康鵑，孟繁平，de Baets M.電鰩乙酰膽堿受體的分離 和純化J. 延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)學(xué)報(bào) ，2004，27（1）:5.  &