1、自發(fā)性高血壓大鼠視網(wǎng)膜微血管稀少與細(xì)胞凋亡                     作者：黃曉燕，陳碧新，高瞻，張明英，王賽斌，楊德業(yè)【摘要】  目的?：研究自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)視網(wǎng)膜毛細(xì)血管細(xì)胞凋亡的發(fā)生情況，探討細(xì)胞凋亡與高血壓視網(wǎng)膜微血管病變之間的關(guān)系，為研究高血壓視網(wǎng)膜病變發(fā)病機(jī)制提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。方法：10只雄性自發(fā)性高血壓大鼠(SHR組)和10只雄性正常血壓(WKY)大鼠

2、(WKY組)分別在13周齡和18周齡取眼球做視網(wǎng)膜消化鋪片，采用核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)dUTP缺口翻譯法(TUNEL法)檢測(cè)視網(wǎng)膜微血管細(xì)胞凋亡變化情況，HE染色及圖像分析，動(dòng)態(tài)觀察視網(wǎng)膜微血管形態(tài)的改變及測(cè)定視網(wǎng)膜毛細(xì)血管面積及密度的改變。結(jié)果：TUNEL法標(biāo)記顯示SHR各周齡大鼠視網(wǎng)膜微血管均出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞，且18周齡大鼠陽(yáng)性細(xì)胞與13周齡大鼠比較明顯增多;WKY組大鼠視網(wǎng)膜微血管未見(jiàn)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞。血管鋪片HE染色顯示SHR組部分毛細(xì)血管閉塞，內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞丟失，出現(xiàn)無(wú)細(xì)胞毛細(xì)血管，毛細(xì)血管密度較WKY組顯著降低。結(jié)論：在高血壓發(fā)展過(guò)程中，視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞均可發(fā)生凋亡

3、，同時(shí)伴有微血管稀疏，細(xì)胞凋亡可能在高血壓視網(wǎng)膜病變的過(guò)程中扮演重要的角色。 【關(guān)鍵詞】  高血壓視網(wǎng)膜病;細(xì)胞凋亡;微血管稀少Abstract: ? Objective: To observe the apoptosis of retinal capillary cells in spontaneously hypertensive rats and study the relationship between apoptosis and hypertensive retinopathy， in order to provide morphological evidence of

4、hypertensive retinopathy. Methods: Experiments were performed on retinas from 13-week-old，18-week-old male SHR?(n?=10)?as experimental group(SHR13 W，SHR18 W)and sex-and age-matched Wistar-Kyoto rats?(WKY)(n?=10)?as control group. Specimens were obtained using terminal deoxynucleotidyl transferase-me

5、diated dUTP nick end labeling?(TUNEL)?methods to detect the apoptosis of retinal capillary cells， using hematoxylin and eosin?(HE)?staining to observe the changes of retinal microvascular in morphology and determinate the retinal capillary area density. Results: Apoptotic cells labelled by TUNEL wer

6、e emerged in SHR groups，including 13-week-old and 18-week-old. Apoptotic cells in 18-week-old SHR were significantly more than in 13-week-old SHR. No cell apoptosis was noted in each of WKY group. The level of apoptosis gradually increased as the weeks of age increasing in SHR， HE showed that some o

7、f capillary was occlusion， endothelial cells and pericytes lost，a large area of cell-free capillary was emerged. Compared with control group，the retinal capillaries area density of SHR was significantly lower than that of the WKY groups. Conclusion: Apoptssis of the endothelial cells and pericytes o

8、f the retinal capillary all can occur in the development process of hypertension，at the same time microvascular rarefaction can accompany. Apoptosis may play an important role in the development of hypertensive retinopathy.Key words: ? hypertensive retinopathy;apoptosis;capillary;microvascular raref

9、action在我國(guó)高血壓病人群中，高血壓性視網(wǎng)膜病變的陽(yáng)性率為70%左右，其所致眼底血管的改變基本上與高血壓3個(gè)時(shí)期的變化相一致，在一定程度上能反映體內(nèi)動(dòng)脈的情況，對(duì)判斷高血壓病的嚴(yán)重程度和預(yù)后有一定的價(jià)值1。有關(guān)高血壓性視網(wǎng)膜病變的發(fā)病機(jī)制尚未明了，其微血管結(jié)構(gòu)改變大多是通過(guò)檢眼鏡或眼底熒光素血管造影觀察到的，如江時(shí)森等2通過(guò)墨汁灌注法觀察到自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHR)視網(wǎng)膜微動(dòng)脈存在微血管稀少現(xiàn)象，但在這一病理過(guò)程中，視網(wǎng)膜微血管病變是否與細(xì)胞凋亡有關(guān)鮮見(jiàn)報(bào)道。近年來(lái)，隨著視網(wǎng)膜微血管消化鋪片技術(shù)的應(yīng)用，使直接觀察視網(wǎng)膜微血管的

10、形態(tài)學(xué)變化成為了可能。本研究應(yīng)用視網(wǎng)膜消化鋪片，HE染色直接觀察視網(wǎng)膜微血管的形態(tài)學(xué)特征，并對(duì)微血管進(jìn)行定量分析，同時(shí)采用TUNEL法特異性標(biāo)記來(lái)觀察13周齡和18周齡SHR視網(wǎng)膜毛細(xì)血管細(xì)胞凋亡情況，旨在探討細(xì)胞凋亡與高血壓視網(wǎng)膜微血管病變的關(guān)系。1?材料和方法1.1?動(dòng)物模型和試劑?雄性SHR和正常血壓大鼠(Wistar-Kyoto，WKY)各10只(其中13，18周齡各5只)，由上海中科院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。大鼠飼養(yǎng)在溫州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心的標(biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng)房，飲自來(lái)水，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，生活在晝夜節(jié)律為12 h、保持一定溫度和濕度的空間。原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于美國(guó)Roche公司。顯色劑為DAB，購(gòu)

11、于福州邁新生物技術(shù)有限公司。1.2?血壓測(cè)定及眼底拍照?用0.35%戊巴比妥麻醉大鼠后，在安靜狀態(tài)下用計(jì)算機(jī)化多導(dǎo)生理記錄儀間接測(cè)定鼠尾動(dòng)脈收縮壓，同時(shí)在裂隙燈下觀察各組大鼠眼底動(dòng)脈情況，拍照。1.3?視網(wǎng)膜血管消化鋪片的制備?過(guò)量麻醉處死大鼠，用新鮮配制的4%多聚甲醛心臟灌流固定后摘除眼球，將眼球置于4%多聚甲醛中4 24 h。在顯微鏡下自角膜緣后0.5 mm處剪開眼球，去除眼前節(jié)和玻璃體，剝離視網(wǎng)膜，將其放入3%胰蛋白酶溶液內(nèi)，37 孵育23 h，消化神經(jīng)組織，然后在蒸餾水中輕輕吹打，僅留一薄層透明的視網(wǎng)膜血管網(wǎng)，將其貼于潔凈的載玻片上，自然干燥，待染色。1.4?視網(wǎng)膜血管形態(tài)學(xué)改變觀察?

12、將制備好的消化鋪片進(jìn)行HE染色，光鏡下觀察視網(wǎng)膜血管形態(tài)學(xué)改變，各組大鼠選5張切片，每張切片計(jì)數(shù)5個(gè)高倍視野(×400)，應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件分析圖像，測(cè)定視網(wǎng)膜毛細(xì)血管面積密度，毛細(xì)血管面積密度(%)=毛細(xì)血管總面積/視網(wǎng)膜總面積。1.5?TUNEL標(biāo)記法?將視網(wǎng)膜消化鋪片按照ROCHE公司提供的TUNEL試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行原位缺口末端標(biāo)記檢測(cè)。樣本先用0.01 mol PBS緩沖液浸洗2次各5 min后再按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。陰性對(duì)照：用50L指示液代替TUNEL反應(yīng)液;陽(yáng)性對(duì)照：實(shí)驗(yàn)前用Dnase-1消化組織(室溫30 min)以打斷所有細(xì)胞DNA鏈，余步

13、驟同前;各步驟后均用0.01 mmol PBS緩沖液浸洗樣本5 min×3次。普通光鏡下觀察細(xì)胞凋亡，陽(yáng)性染色隨凋亡程度的不同呈淺棕至深棕褐色，定位于胞核，根據(jù)下列標(biāo)準(zhǔn)3確定著色陽(yáng)性細(xì)胞為凋亡細(xì)胞：?jiǎn)蝹€(gè)散在分布;具有凋亡的核形態(tài)(核固縮或染色質(zhì)濃聚附邊或核碎裂);周圍無(wú)炎癥反應(yīng)。對(duì)于缺乏凋亡核形態(tài)的陽(yáng)性細(xì)胞，除非染色強(qiáng)度與背景有鮮明對(duì)比，且呈單個(gè)分布，否則不認(rèn)為是凋亡細(xì)胞4。非凋亡細(xì)胞呈紫藍(lán)色，為陰性。1.5?統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法?兩組間比較采用t檢驗(yàn)。2 結(jié)果2.1?各組大鼠鼠尾動(dòng)脈收縮壓變化?13周齡與18周齡SHR收縮壓分別為(148.8±9.9)mmHg、(154.4&#

14、177;17.9)mmHg，WKY分別為(75.9±3.2)mmHg、(75.7±5.9)mmHg，相同周齡SHR組血壓與WKY組比較差異均有顯著性 (P?<0.01)，兩組組內(nèi)不同周齡比較，差異均無(wú)顯著性(P?>0.05)。2.2?眼底檢查?可見(jiàn)眼底動(dòng)靜脈由視乳頭分出后呈放射狀，與人眼底不同，無(wú)動(dòng)靜脈交叉，無(wú)黃斑結(jié)構(gòu)。對(duì)照組眼底未見(jiàn)異常(見(jiàn)圖1)，SHR組13周齡和18周齡均可見(jiàn)視網(wǎng)膜動(dòng)脈變細(xì)，管徑不規(guī)則，管壁反光增強(qiáng)，靜脈迂曲擴(kuò)張，視網(wǎng)膜水腫，反光增強(qiáng)，未見(jiàn)到片狀出血點(diǎn)(見(jiàn)圖2)。根據(jù)Reith- Wagener的4級(jí)分類法，相當(dāng)于高血壓眼底第I、第II級(jí)的

15、改變。2.3?視網(wǎng)膜血管形態(tài)學(xué)改變?光鏡下，WKY組毛細(xì)血管網(wǎng)管徑粗細(xì)均勻一致，內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞均勻分布，內(nèi)皮細(xì)胞核呈橢圓形，位于毛細(xì)血管中央或稍偏位，較周細(xì)胞略大，與血管平行;周細(xì)胞核呈短橢圓形、圓形或三角形，位于毛細(xì)血管壁的側(cè)面，稍突出于血管壁(見(jiàn)圖3)。SHR組血管管徑粗細(xì)不均，周細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞分布不均勻，部分毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)已破壞，13周齡 SHR部分毛細(xì)血管閉塞呈細(xì)線狀(見(jiàn)圖4)，18周齡SHR除了部分毛細(xì)血管表現(xiàn)為血管管腔閉塞外，其間無(wú)內(nèi)皮細(xì)胞及周細(xì)胞影，血管腔完全閉鎖，即無(wú)細(xì)胞毛細(xì)血管形成(見(jiàn)圖5)。13周齡與18周齡SHR毛細(xì)血管面積密度分別為(0.3720±0.0239)、(0.2840±0.0336)，WKY分別為(0.5240±0.0422)、(0.4940±0.0207)，SHR組毛細(xì)血管面積密度顯著低于