1、酵母菌的分離純化實驗?zāi)康? .了解培養(yǎng)基的配置與滅菌技術(shù)；2 .無菌操作技術(shù)；3 .工業(yè)微生物的分離與純化技術(shù)；4 .工業(yè)微生物的檢測及保藏?；驹?、 培養(yǎng)基是人工配置的用于培養(yǎng)、分離、鑒定和保存各種微生物的營養(yǎng)基質(zhì)。也適合微生物在生命活動中積累各種代謝產(chǎn)物。由于微生物種類不同，營養(yǎng)類型各異以及實驗?zāi)康牟煌?，因此培養(yǎng)基的種類也很多。不同微生物對營養(yǎng)的要求不同，在配置時根據(jù)微生物對PH的要求選擇合適的PH。由于本次實驗主要是分離純化酵母菌，所以配置的培養(yǎng)基是適合酵母菌生長麥芽汁平板培養(yǎng)基，同時添加抗生素抑制霉菌及其它菌的生長。2、 接種和培養(yǎng)過程中必須保證不被其它微生物所污染，關(guān)鍵在于嚴格進

2、行正確的無菌操作，但是絕對無菌是不可能的，只能人工創(chuàng)造相對無菌的環(huán)境。所以本次實驗無菌操作是在超凈工作臺的酒精燈火焰旁進行。3、 把特定微生物從混雜的微生物群體中分離出來而獲得某一種或某一株微生物的過程叫微生物的分離與純化。首先根據(jù)其生長特性設(shè)計只利于此菌生長的條件，再根據(jù)各種稀釋法使他們在固體培養(yǎng)基上單獨長成菌落。分離純化的方法通常有：稀釋混合倒平板法、稀釋涂布平板法和平板劃線。此次實驗采用梯度稀釋涂布平板法。4、 微生物檢測項目最常用的是細胞數(shù)的檢測，方法比較多，主要有顯微鏡直接計數(shù)法、平板菌落計數(shù)法（CFU、光電比濁計數(shù)法等。本次實驗設(shè)計酵母菌的數(shù)量檢測，選用顯微鏡直接計數(shù)法和平板菌落計

3、數(shù)法。實驗器材儀器設(shè)備恒溫水浴鍋、電熱干燥箱、蒸汽滅菌鍋、超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫搖床、水浴鍋、電爐、銅鍋、酒精燈、接種環(huán)、電子天平、研缽、光學(xué)顯微鏡、血細胞計數(shù)器玻璃器皿燒杯、錐形瓶、大小試管、培養(yǎng)皿、漏斗、三角涂棒、吸管、試管架、玻璃涂棒、蓋玻片試劑與材料蘋果、大麥芽、瓊脂、蒸儲水、碘液、抗生素、染色液其它紗布、濾紙實驗內(nèi)容及操作步驟（一）、樣品的選擇酵母菌一般在果園的土壤中或者水果的表面含量較多，因此選擇蘋果為樣品。（二）、樣品的處理制備蘋果懸液1. 首先將1g蘋果在研缽中磨細，放入裝有10ml生理鹽水和玻璃珠的100ml三角瓶中去。2. 激烈震蕩約10min,使菌體分散并懸浮與液體

4、中。3. 用無菌吸管吸取1ml蘋果懸液注入盛有9ml生理鹽水的試管中，吸取三次并混勻。4. 再去一只無菌吸取管，從此試管中吸取1ml,注入另一盛有9ml生理鹽水的試管中，取三次并混勻。5. 同法類推制成10-3、10-4、IO-5、IO-6、10-7的各種稀釋度的蘋果懸液。（三）、培養(yǎng)基的制備與滅菌1、培養(yǎng)基的選擇：選擇麥芽汁為培養(yǎng)基培養(yǎng)酵母菌2、麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基的制備取新鮮麥芽汁200mL在65c水浴中糖化34小時，糖化程度可用碘滴定之。加水約400mL,調(diào)勻至生泡沫時為止，然后倒在糖化液中攪拌煮沸后再過濾。將糖化液用4-6層紗布過濾，濾液如混濁不清，可用雞蛋白澄清，方法是將一個雞蛋白加水約

5、20mL,調(diào)勻至生泡沫時為止，然后倒在糖化液中攪拌煮沸后再過濾。將濾液稀釋到5-6波美度，pH約6.4,加入2%瓊脂即成。121c滅菌30min。培養(yǎng)皿采用干熱滅菌（蒸汽滅菌鍋）生理鹽水稱取氯化鈉0.43g,加入50ml水，裝入100ml小錐形瓶中，滅菌備用。3、分裝已過濾滅菌的培養(yǎng)基應(yīng)進行分裝。因要制作平板和斜面培養(yǎng)基，所以需將培養(yǎng)基分裝于培養(yǎng)皿和試管中。分裝時，一手捏松彈簧夾，使培養(yǎng)基流出，另一只手握住幾支試管或培養(yǎng)皿，依次接取培養(yǎng)基。分裝時，注意不要使培養(yǎng)基粘附管口或培養(yǎng)皿口，以免浸濕棉塞引起雜菌污染。裝入試管的培養(yǎng)基量，視試管和培養(yǎng)皿的大小及需要而定。一般制作斜面培養(yǎng)基時，每只15X1

6、50毫米的試管，約裝34毫升（1/41/3試管高度），如制作深層培養(yǎng)基，每只20X220毫米的試管約裝1215毫升。4、加棉塞分裝完畢后，需要用棉塞堵住管口或瓶口。堵棉塞的主要目的是過濾空氣，避免污染。棉塞應(yīng)采用普通新鮮、干燥的棉花制作，不要用脫脂棉，以免因脫脂棉吸水使棉塞無法使用。制作棉塞時，要根據(jù)棉塞大小將棉花鋪展成適當(dāng)厚度，揪取手掌心大小一塊，鋪在左手拇指與食指圈成的圓孔中，用右手食指插入棉花中部，同時左手食指與姆指稍稍緊握，就會形成1個長棒形的棉塞。棉塞作成后，應(yīng)迅速塞入管口或瓶口中，棉塞應(yīng)緊貼內(nèi)壁不留縫隙，以防空氣中微生物沿皺折侵入。棉塞不要過緊過松，塞好后，以手提棉塞、管、瓶不下落

7、為合適。棉塞的2/3應(yīng)在管內(nèi)或瓶內(nèi)，上端露出少許棉花便于拔取。塞好棉塞的試管和錐形瓶應(yīng)蓋上厚紙用繩捆札，準備滅菌。5、制作斜面培養(yǎng)基和平板培養(yǎng)基培養(yǎng)基滅菌后，制作斜面培養(yǎng)基和平板培養(yǎng)基，須趁培養(yǎng)基未凝固時進行。（1）制作斜面培養(yǎng)基。在實驗臺上放1支長0.51米左右的木條，厚度為1厘米左右。將試管頭部枕在木條上，使管內(nèi)培養(yǎng)基自然傾斜，凝固后即成斜面培養(yǎng)基。（2）制作平板培養(yǎng)基。將剛剛滅過菌的盛有培養(yǎng)基的錐形瓶和培養(yǎng)皿放在實驗臺上，點燃酒精燈，右手托起錐形瓶瓶底，左手拔下棉塞，將瓶口在酒精燈上稍加灼燒，左手打開培養(yǎng)皿蓋，右手迅速將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，每皿約倒入10毫升，以鋪滿皿底為度。鋪放培養(yǎng)基后

8、放置15分鐘左右，待培養(yǎng)基凝固后，再5個培養(yǎng)皿一疊，倒置過來，平放在恒溫箱里，24小時后檢查，如培養(yǎng)基末長雜菌，即可用來培養(yǎng)微生物。（四）、樣品的分離純化1、倒制平板將麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基加熱熔化，冷卻至55-60°Co加入抗生素1ml并混勻。在超凈工作臺的酒精燈火焰旁倒制平板。2、涂布平板將上述培養(yǎng)基的5個培養(yǎng)基的四個平板分別標上10-3、10-4、10-5、10-6、10-7五種稀釋度。取5只無菌吸管，分別從四種蘋果懸液的稀釋液中各取0.1ml。對號放于已標記好稀釋度的平板中，用無菌玻璃涂棒在培養(yǎng)基表面輕輕涂布均勻。重復(fù)以上4步驟。3、倒置培養(yǎng)將培養(yǎng)基平板倒置，與30-320C溫箱中

9、培養(yǎng)2天。4、觀察挑菌觀察培養(yǎng)后長出的酵母菌的單個菌落，分別挑取并接種于斜面培養(yǎng)基上，再培養(yǎng)。待菌苔長好后，檢查是否有雜菌，若有則需再一次進行分離純化，直到獲得純菌株培養(yǎng)物。5、最大然數(shù)法計數(shù)原每毫升樣品中酵母數(shù)量漏釋彳音數(shù)*最大然數(shù)（五）、酵母菌的制片、染色及形態(tài)觀察以及計數(shù)酵母菌的個體形態(tài)一般可采用水浸片進行活體觀察。1、觀察菌落和菌苔并記錄菌落形態(tài)特征制作酵母菌水浸片顯微標本片1、在干凈的載玻片上滴上一滴蒸儲水，用接種環(huán)進行無菌操作，挑取培養(yǎng)物少許，置載玻片的水滴中，與水混合做成懸液并涂成直徑約1厘米的薄層，為避免因菌數(shù)過多聚成集團，不利觀察個體形態(tài)，可在載玻片之一側(cè)再加一滴水，從已涂布的菌液中再取一環(huán)于此水滴中進行稀釋，涂布成薄層，若材料為液體培養(yǎng)物或固體培養(yǎng)物中洗下制備的菌液，則直接涂布于載玻片上即可。2、酵母菌美藍水浸片的制作：染色加蓋玻片觀察鑒別3、酵母菌碘液水