1、RACE勺簡(jiǎn)介目前，全長(zhǎng)基因的獲得是生物工程及分子生物學(xué)研究的一個(gè)重點(diǎn)。盡管已經(jīng)有多種方法可以獲得基因的全長(zhǎng)序列，但在很多生物研究中，由于所研究的目的基因豐度較低，從而使得由低豐度mRNz過轉(zhuǎn)錄獲得全長(zhǎng)cDN4艮困難。近年來發(fā)展成熟的cDNM端快速擴(kuò)增(RACE歧術(shù)為從低豐度轉(zhuǎn)錄快速獲得全長(zhǎng)cDNA提供了一個(gè)便捷的途徑。cDNA末端快速擴(kuò)增(rapidamplificationofcDNAends,RACE)技術(shù)是一種基于mRN辰轉(zhuǎn)錄和PCR技術(shù)建立起來的、以部分的已知區(qū)域序列為起點(diǎn)，擴(kuò)增基因轉(zhuǎn)錄本的未知區(qū)域，從而獲得mRNA(cDNA)整序列的方法。簡(jiǎn)單的說就是一種從低豐度轉(zhuǎn)錄本中快速增長(zhǎng)c

2、DNA5和cDNA3末端，進(jìn)而獲得獲得全長(zhǎng)cDNA單而有效的方法，該方法具有快捷、方便、高效等優(yōu)點(diǎn)，可同時(shí)獲得多個(gè)轉(zhuǎn)錄本。因此近年來RACES術(shù)已逐漸取代了經(jīng)典的cDN應(yīng)庫篩選技術(shù)，成為克隆全長(zhǎng)cDNAff列的常用手段。第二RACE的原理RACE是采用PCR技術(shù)由已知的部分cDNA順序來擴(kuò)增出完整cDNA5和3末端，是一種簡(jiǎn)便而有效的方法，乂被稱為錨定PCR(anchoredPCR)和單邊PCR(one2sidePCR)。3RACE勺原理一) 加入oligo(dT)17和反轉(zhuǎn)錄酶對(duì)mRN/tt行反轉(zhuǎn)錄得到(-)cDNA;二) 以oligo(dT)l7和一個(gè)35bp的接頭(dT17-adapto

3、r)為引物，其中在引物的接頭中有一在基因組DNA中罕見的限制酶的酶切位點(diǎn)。這樣就在未知cDNM端接上了一段特殊的接頭序列。再用一個(gè)基因特異性引物(3amp)與少量第一鏈(-)cDNA退火并延伸，產(chǎn)生互補(bǔ)的第二鏈(+)cDNA。三) 利用3amp和接頭引物進(jìn)行PCRffi環(huán)即可擴(kuò)增得到cDNA鏈。擴(kuò)增的特異性取決于3amp的堿基只與目的cDN子互補(bǔ).而用接頭引物來取代dT17一adaptor則可阻止長(zhǎng)(dT)堿基引起的錯(cuò)配。3AACE-PCRmlvmal埠*!辱prtmvrO4nAtur;annualarhorprimxPQHwrihOimJrtniGiniorpfirmrs圖13RACE的原理

4、圖5RACE勺原理5RAC由3RACE略有不同。首先，引物多設(shè)計(jì)了一個(gè)用丁逆轉(zhuǎn)錄的基因特異引物GSP-RT其次，在酶促反應(yīng)中增加了逆轉(zhuǎn)錄和加尾步驟，即先用GSP-R碰轉(zhuǎn)錄mRN猷得第一鏈（-）cDNA后，用脫氧核糖核酸末端轉(zhuǎn)移酶和dATP在cDNA5端加poly（A）尾，再用錨定引物合成第二鏈（+）cDNA,接下來與3RACES程相同。用接頭引物和位丁延伸引物上游的基因特異性引物（5amp）進(jìn)行PCRT增。EitmndpmwMFtvmlAQwrrrURHAfcCWlf*RT函2KRACE的點(diǎn)理圖AfidliiM，rtmhmliPwfjcpWL，(MaaMAXMn匚qfWi3fWMDhlA*nd

5、GTPZTdTPCfiwWOCUMrDWuwiggAtadgMiAmtarPfvwsdiMWg的flapw*1?prtmarrf*CflprwMrfLrtrtgAUW1.4*UAF.ud全長(zhǎng)cDNA勺獲得通過RACE法獲得的雙鏈cDNAM用限制性內(nèi)切酶酶切和southem印跡分析并克隆。通常的克隆方法是同時(shí)使用一個(gè)切點(diǎn)位丁接頭序列上的限制性內(nèi)切酶和一個(gè)切點(diǎn)位丁擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)的內(nèi)切酶。由丁大多數(shù)非特異性擴(kuò)增的cDNAT物不能被后一個(gè)限制性內(nèi)切SW切，因而也就不會(huì)被克隆.從而增加了克隆的選擇效率。還可以用在基因特異性引物的5端摻人一個(gè)限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)的方法來克隆。最后，從兩個(gè)有相互重疊序列的3和

6、5RAC產(chǎn)物中獲得全長(zhǎng)cDNA或者通過分析RAC砂物的3和5端序列，合成相應(yīng)引物來擴(kuò)增mRNA勺反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，從而獲得全長(zhǎng)cDNA第三RACE的應(yīng)用RAC哉術(shù)主要是應(yīng)用丁對(duì)全長(zhǎng)cDNAff列的獲得，但對(duì)該技術(shù)進(jìn)行一定的修改后，也可在其它方面顯示出極高的應(yīng)用價(jià)值。首先，RAC哉術(shù)可用丁cDN敘庫的構(gòu)建及篩選。Belyavaasky等(1989)用10個(gè)骨髓瘤細(xì)胞分離的總RNA通過TdT加同聚尾、(dT)16引物反轉(zhuǎn)錄，接著用(dC)13和錨定引物擴(kuò)增的方法建立了一個(gè)106克隆的cDNA文庫。同時(shí)，用該方法構(gòu)建文庫的優(yōu)點(diǎn)是它們都只需要很少量的實(shí)驗(yàn)材料。建喜等(2001)利用RAC哉術(shù)從已經(jīng)構(gòu)建的cD

7、NA文庫中成功克隆了家兔精子膜蛋白基因。其次，應(yīng)用RAC毗隆已知片段的旁側(cè)內(nèi)部序歹U(neighboringinternalsequence)。Fritz等(1991)以及Struck等(1994)分別用該法獲得了3端和5端的旁側(cè)序列。Zhang(1996)應(yīng)用LA-PCR方法獲得了特異基因的5末端非編碼和編碼序列，省去了構(gòu)建及篩選基因組文庫的麻煩。王東等(2003)利用RT-PCR和RACEK術(shù)從玉米中獲得一個(gè)長(zhǎng)度為2469bpF2KP蛋白基因的cDNA隆。此外，RACE&術(shù)還可用于克隆同源基因的同源片斷，為尋找同基因提供了一種方法。除此之外,Whitcomb等設(shè)計(jì)的隨機(jī)引物/錨定PC涎對(duì)克

8、隆質(zhì)粒載體上的靶序列進(jìn)行定點(diǎn)刪除，采用(N)10錨隨機(jī)引物和變性的質(zhì)粒DN/ffl行雜交，然后通過T7聚合酶來延伸，這樣單鏈DNAB可被一隨機(jī)引物和一基因特異性引物擴(kuò)增，一端可達(dá)到缺失刪除，缺失的片段可達(dá)2K&Balavoine應(yīng)用連接介導(dǎo)PCRR一種扁蟲中克隆得到8個(gè)分別屆于Hox,msh,NK-1和NK-2的含同源盒的片段，說明RAC可用于克隆同源基因的同源片段，為尋找同源基因提供了一種手段。RACEK術(shù)與生物信息學(xué)，例如ESTW相結(jié)合，具有快速,高效克隆新基因的特點(diǎn)，為快速釣取基因家族候選新成員提供新思路,如果一個(gè)基因是多基因家族的一個(gè)成員，用基因特異引物(GSP)可能同時(shí)擴(kuò)增幾個(gè)高度同

9、源的Cdna.李紅等利用一條cDNA乍為探針，通過BLAST以GenBank中整合出了7條更長(zhǎng)的EST,通過設(shè)計(jì)引物，利用RACET增,得到了7條新基因.相比單純尋找新基因的全長(zhǎng)，此種方法的結(jié)合充分利用了信息巨大的基因資源庫，得到了更多的信息，獲得新基因速度更快*效果更高，屆一種頗具規(guī)模化的方法，很有應(yīng)用前景?？傊S著RACES術(shù)的不斷改進(jìn)和完善，優(yōu)化PCFT增的條件以提高擴(kuò)增的效率和忠實(shí)性，RACEEfc術(shù)必將在基因克隆以及基因家族和基因表達(dá)變化等研究中發(fā)揮極大的作用。第四RACE的優(yōu)點(diǎn)與局限性RAC豉術(shù)相對(duì)于其他方法克隆全長(zhǎng)cDNM說具有價(jià)廉、簡(jiǎn)單和快速等特點(diǎn)。用RAC歐得cDN砒隆只需

10、幾天的時(shí)間，而且對(duì)豐度很低的起始反應(yīng)物質(zhì)，照樣能迅速反饋是否有目的產(chǎn)物生成。因此，可根據(jù)不同的RNAH備來修訂反轉(zhuǎn)錄條件，以滿足全長(zhǎng)cDNA勺獲得。同時(shí)，通過RACES術(shù)獲得5端調(diào)控序列和多聚腺苜化信號(hào)序列的信息,有助于選擇引物以用于轉(zhuǎn)錄模型非常復(fù)雜的基因中擴(kuò)增cDNA勺業(yè)群。另外，RACES術(shù)能產(chǎn)生大量獨(dú)立克隆，這些克隆可用來證實(shí)核苜酸序列，并使得被選擇性剪接或開始用于很少使用的啟動(dòng)子的特殊轉(zhuǎn)錄物的分離成為可能。RAC哉術(shù)從理論上來說是很簡(jiǎn)單的，但是實(shí)際操作中會(huì)面臨許多技術(shù)上的難題。許多研究人員發(fā)現(xiàn)，利用RACES獲得全長(zhǎng)基因并非如想像中那般成功，甚至經(jīng)常會(huì)發(fā)生錯(cuò)誤的擴(kuò)增和克隆結(jié)果，多數(shù)情況

11、下,5端的編碼區(qū)經(jīng)常會(huì)由于反轉(zhuǎn)錄過程的不徹底而丟掉，特別是由于有大的轉(zhuǎn)錄物或者存在復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu)的時(shí)候,而且連接反應(yīng)通常是特異性差效率很低，這樣PCR功進(jìn)行就不能保證.尤其在長(zhǎng)片段擴(kuò)增時(shí)，PCR就顯得不那么有效.例如幾個(gè)Kb片段的產(chǎn)物就需要優(yōu)化改變擴(kuò)增條件，而且擴(kuò)增結(jié)果經(jīng)常出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增條帶，使得選擇目的條帶變得十分困難，而對(duì)于豐度較低，長(zhǎng)度較長(zhǎng)的基因RACE法困難更大，這是困擾研究人員的一大難題。由于RACET增中經(jīng)常出現(xiàn)由于引物的不匹配而導(dǎo)致的非特異性擴(kuò)增，有時(shí)需要進(jìn)行幾輪巢式擴(kuò)增來達(dá)到獲得特異性擴(kuò)增的目的，然而多輪擴(kuò)增乂容易提高PCRK應(yīng)的錯(cuò)誤發(fā)生率，由于這些原因，利用RACES術(shù)通常不易獲得所希望的結(jié)果。盡管RACES術(shù)在應(yīng)用中取得了很大的成功.但在實(shí)際操作過程仍有不少局限性。一般來說導(dǎo)致失敗的原因主