1、recombinant DNA technique 基因工程基因工程 genetic engineeringgenetic engineering 遺傳工程遺傳工程 genetic engineeringgenetic engineering 基因操作基因操作 gene manipulationgene manipulation DNA DNA 重組技術(shù)重組技術(shù) recombinant DNA recombinant DNA techniquetechnique 基因克隆基因克隆 gene cloninggene cloning 分子克隆分子克隆 molecular cloningmolecu

2、lar cloning 基因工程：外源基因工程：外源DNA，通過具有，通過具有復(fù)制能力的載體分子形成重組復(fù)制能力的載體分子形成重組DNA分分子，導(dǎo)入受體細(xì)胞，進(jìn)行持久穩(wěn)定的子，導(dǎo)入受體細(xì)胞，進(jìn)行持久穩(wěn)定的復(fù)制和表達(dá)，使受體細(xì)胞產(chǎn)生外源復(fù)制和表達(dá)，使受體細(xì)胞產(chǎn)生外源DNA或蛋白質(zhì)?；虻鞍踪|(zhì)?；蚬こ痰睦碚撘罁?jù)：基因工程的理論依據(jù)： 遺傳物質(zhì)遺傳物質(zhì)DNA DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型雙螺旋結(jié)構(gòu)模型 操縱子學(xué)說操縱子學(xué)說 基因的表達(dá)與突變（中心法則）基因的表達(dá)與突變（中心法則） 基因工程的工具酶的發(fā)現(xiàn)基因工程的工具酶的發(fā)現(xiàn)基因工程的基本程序：基因工程的基本程序： 分分 切切 接接 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn) 篩篩基因工程技術(shù)的

3、特點(diǎn)：基因工程技術(shù)的特點(diǎn)： 1. 可在體外人工的可在體外人工的, 有目的的有目的的, 根據(jù)根據(jù)需要進(jìn)行基因的重組、表達(dá)、測序、需要進(jìn)行基因的重組、表達(dá)、測序、誘變、修復(fù)；誘變、修復(fù)； 2. 方法簡便、快速、準(zhǔn)確、特異，方法簡便、快速、準(zhǔn)確、特異，能保證研究與開發(fā)的需要。能保證研究與開發(fā)的需要?；蚬こ痰幕境绦蚧蚬こ痰幕境绦?1972年年 ，美國的，美國的Berg和和Jackson等人將猿猴病等人將猿猴病毒基因組毒基因組SV40DNA、 噬菌體基因以及大腸桿菌噬菌體基因以及大腸桿菌半乳糖操縱子在體外重組獲得成功。半乳糖操縱子在體外重組獲得成功。 1973年年 ，美國斯坦福大學(xué)的，美國斯坦福

4、大學(xué)的Cohen和和Boyer等等人在體外構(gòu)建出含人在體外構(gòu)建出含 有四環(huán)素和鏈霉素兩個抗性基有四環(huán)素和鏈霉素兩個抗性基因的重組質(zhì)粒分子，將之導(dǎo)入大腸桿菌后，重組因的重組質(zhì)粒分子，將之導(dǎo)入大腸桿菌后，重組質(zhì)粒得以穩(wěn)定復(fù)制，并賦予受體細(xì)胞抗性，由此質(zhì)粒得以穩(wěn)定復(fù)制，并賦予受體細(xì)胞抗性，由此宣告了宣告了基因工程的誕生基因工程的誕生?；蚬こ檀笫掠浕蚬こ檀笫掠?1978 Genentech公司公司 人胰島素人胰島素 世界上世界上第一種基因工程蛋白藥物第一種基因工程蛋白藥物 1982 第一個基因工程藥物第一個基因工程藥物-重組人胰島重組人胰島素在英、美獲準(zhǔn)使用素在英、美獲準(zhǔn)使用 1985 第一批轉(zhuǎn)基

5、因家畜（兔、豬和羊），第一批轉(zhuǎn)基因家畜（兔、豬和羊），中國中國 轉(zhuǎn)基因魚轉(zhuǎn)基因魚 中科院水生生物研究所培育的轉(zhuǎn)基因鯉魚，表現(xiàn)出快速中科院水生生物研究所培育的轉(zhuǎn)基因鯉魚，表現(xiàn)出快速生長效應(yīng)。生長效應(yīng)。 19931993 基因工程西紅柿在美國上市基因工程西紅柿在美國上市 1997 1997 多莉羊多莉羊 英國愛丁堡羅斯林研究所英國愛丁堡羅斯林研究所 1999.91999.9 中國獲準(zhǔn)加入人類基因組計(jì)劃中國獲準(zhǔn)加入人類基因組計(jì)劃. .負(fù)責(zé)負(fù)責(zé)測定人類基因組全部序列的測定人類基因組全部序列的1%1% 2000.6.262000.6.26 科學(xué)家公布人類基因組工作草圖科學(xué)家公布人類基因組工作草圖 200

6、1.2.112001.2.11 公布人類基因組基本信息公布人類基因組基本信息 生物技術(shù)工程：生物技術(shù)工程：基因工程、蛋白質(zhì)工程、酶基因工程、蛋白質(zhì)工程、酶工程、細(xì)胞工程工程、細(xì)胞工程、發(fā)酵工程、發(fā)酵工程 克隆羊多利克隆羊多利（Dolly）的誕生的誕生 19971997年年1212月，英國月，英國RoslinRoslin研究所克隆羊多利研究所克隆羊多利（DollyDolly）的誕生揭示一個全新概念：由成年）的誕生揭示一個全新概念：由成年機(jī)體的一個體細(xì)胞核，可以復(fù)制一個基因完全機(jī)體的一個體細(xì)胞核，可以復(fù)制一個基因完全相同的新生命個體。相同的新生命個體。 克隆鼠、克隆牛等實(shí)驗(yàn)的成功進(jìn)一步驗(yàn)證了其克隆

7、鼠、克隆牛等實(shí)驗(yàn)的成功進(jìn)一步驗(yàn)證了其科學(xué)性將體細(xì)胞核移植去核卵細(xì)胞形成的克隆科學(xué)性將體細(xì)胞核移植去核卵細(xì)胞形成的克隆細(xì)胞，其基因組細(xì)胞，其基因組DNADNA與細(xì)胞核供體一致，由克與細(xì)胞核供體一致，由克隆細(xì)胞復(fù)制出可供移植、無免疫排斥的各種組隆細(xì)胞復(fù)制出可供移植、無免疫排斥的各種組織細(xì)胞、器官，是織細(xì)胞、器官，是2121世紀(jì)生命科學(xué)的一個新里世紀(jì)生命科學(xué)的一個新里程碑。程碑。*組織纖溶酶原激活劑組織纖溶酶原激活劑*生長激素生長激素*促生長素促生長素*抗血友病因子抗血友病因子*脫氧核糖核酸酶脫氧核糖核酸酶*葡糖腦苷脂酶葡糖腦苷脂酶*鼠單克隆抗體鼠單克隆抗體*胰島素胰島素*人生長激素人生長激素*干擾

8、素干擾素*白細(xì)胞介素白細(xì)胞介素2 2*粒細(xì)胞集落刺激因子粒細(xì)胞集落刺激因子*粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子*紅細(xì)胞生成素紅細(xì)胞生成素 EPOEPO基因工程的主要技術(shù)基因工程的主要技術(shù) DNA、RNA的分離純化的分離純化 凝膠電泳技術(shù)凝膠電泳技術(shù) PCR 酶切及鑒定、酶切及鑒定、DNA重組連接重組連接 DNA測序、測序、DNA合成技術(shù)合成技術(shù) 分子雜交分子雜交 微生物的培養(yǎng)、保存微生物的培養(yǎng)、保存 克隆（克?。╟lone） 無性繁殖無性繁殖 名詞：從一個共同祖先無性繁殖名詞：從一個共同祖先無性繁殖下來的一群遺傳上同一的下來的一群遺傳上同一的DNA分子、分子、細(xì)胞或個體所組成

9、的特殊的生命群細(xì)胞或個體所組成的特殊的生命群體。體。 動詞：動詞： 基因克隆基因克隆 應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將目的基因目的基因與與載體載體DNA結(jié)合成一具有自我復(fù)制能結(jié)合成一具有自我復(fù)制能力的力的DNA分子（分子（重組體重組體），繼而通過），繼而通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞、篩選出含有目轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞、篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進(jìn)行擴(kuò)增、的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進(jìn)行擴(kuò)增、提取獲得大量同一提取獲得大量同一DNA分子拷貝分子拷貝。 基因克隆示意圖基因克隆示意圖 載體DNA(限制性內(nèi)切酶切開)目的基因宿主細(xì)胞重組體已轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞陽性克隆株繁殖表達(dá)自然界的基因轉(zhuǎn)移和重組自

10、然界的基因轉(zhuǎn)移和重組 基因重組基因重組(genetic recombination)整整段段DNA在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間,甚至不同物種甚至不同物種間進(jìn)行間進(jìn)行交換交換,并能在新的位置上并能在新的位置上復(fù)制復(fù)制, 轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄和翻譯和翻譯 自然界的基因轉(zhuǎn)移和重組是無目的的自然界的基因轉(zhuǎn)移和重組是無目的的 基因工程有目的基因工程有目的 結(jié)合作用結(jié)合作用 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA從一個細(xì)胞（細(xì)菌）轉(zhuǎn)移至另一從一個細(xì)胞（細(xì)菌）轉(zhuǎn)移至另一個細(xì)胞（細(xì)菌）。個細(xì)胞（細(xì)菌）。 轉(zhuǎn)化作用轉(zhuǎn)化作用 transformation 通過自動獲取或人為地供給外源通過自動獲取或人為地供給外源DNA，使，使細(xì)胞或培養(yǎng)的受體細(xì)胞

11、獲得新的遺傳表型的細(xì)胞或培養(yǎng)的受體細(xì)胞獲得新的遺傳表型的過程。過程?；蚬こ袒蚬こ?工具酶工具酶 載體載體 重組重組DNA技術(shù)的基本過程技術(shù)的基本過程 基因的克隆和分離基因的克隆和分離 文庫的構(gòu)建文庫的構(gòu)建 克隆基因的表達(dá)克隆基因的表達(dá)工具酶工具酶限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶切割雙鏈切割雙鏈DNADNA連接酶連接酶生成生成3- 5磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵DNA聚合酶聚合酶探針標(biāo)記、補(bǔ)平探針標(biāo)記、補(bǔ)平3末端末端反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶cDNA合成合成多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶5磷酸化、探針標(biāo)記磷酸化、探針標(biāo)記末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶3末端多聚尾末端多聚尾堿性磷酸酶堿性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基常

12、用的工具酶：常用的工具酶：一把特殊的剪刀一把特殊的剪刀限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)阿爾伯阿爾伯(Arber)(Arber)、史密斯、史密斯(Smith)(Smith)和內(nèi)森斯和內(nèi)森斯(Nathans)(Nathans)，獲，獲19781978年諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎年諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶(restriction enzyme) 識別識別雙鏈雙鏈DNA內(nèi)部內(nèi)部特異位點(diǎn)特異位點(diǎn)并裂解磷酸并裂解磷酸二酯鍵二酯鍵 分類：分類：型、型、型型、型型 命名：命名： EcoR(E：屬名；：屬名；co：種名；：種名；R：株；：株；：發(fā)現(xiàn)次序發(fā)現(xiàn)次序) 識別和切割位點(diǎn)識別和切

13、割位點(diǎn) 回文結(jié)構(gòu)回文結(jié)構(gòu) 46 bp 出現(xiàn)兩種末端出現(xiàn)兩種末端*粘性末端粘性末端 粘端粘端 *平頭末端平頭末端 平端平端 同工異源酶：同工異源酶：來源不同，但能識別和切來源不同，但能識別和切割同一位點(diǎn)割同一位點(diǎn) 同尾酶：同尾酶：識別序列不同，但產(chǎn)生相同的識別序列不同，但產(chǎn)生相同的粘性末端粘性末端粘性末端與平頭末端粘性末端與平頭末端EcoRGAATTCCTTAAG5533553355G GCTTAACTTAAAATTCAATTCG G333355粘性末端粘性末端SmaCCCGGGGGGCCC5533335555CCCCCCGGGGGGGGGGGGCCCCCC333355平頭末端平頭末端 DNA聚

14、合酶聚合酶 逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶(reverse transcriptase) T4DNA連接酶連接酶(T4 ligase) 堿性磷酸酶堿性磷酸酶(alkaline phosphatase) 末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase,TdT) Taq DNA聚合酶聚合酶修飾酶修飾酶DNA聚合酶(pol )的活性 5至至3的聚合活性的聚合活性 5 3方向方向 核酸核酸 外切酶活性外切酶活性 5 3外切酶活性外切酶活性 3 5外切酶活性外切酶活性 pol 經(jīng)枯草桿菌蛋白酶裂解可得大、小兩個經(jīng)枯草桿菌蛋白酶裂解可得大、小兩個片段

15、片段 大片段大片段 （Klenow片段）：聚合活性、片段）：聚合活性、 3 5外切活性外切活性 常用的工具酶常用的工具酶核酸外切酶活性核酸外切酶活性 35外切酶活性外切酶活性 53外切酶活性外切酶活性53外切酶活性35外切酶活性5335DNA 連接酶連接酶堿性磷酸酶的脫磷酸作用堿性磷酸酶的脫磷酸作用末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶(TDT) 載體載體 vector DNA ，能在宿主細(xì)胞中進(jìn)行自我復(fù)制和，能在宿主細(xì)胞中進(jìn)行自我復(fù)制和表達(dá)表達(dá) 克隆載體、表達(dá)載體克隆載體、表達(dá)載體 原核載體原核載體：質(zhì)粒：質(zhì)粒(pBR322, pUC） 噬菌體（噬菌體（，M13）等）等 真核載體真核載體：

16、動物病毒載體：動物病毒載體pLXSN等等載體的基本要求：載體的基本要求： 1.復(fù)制單位復(fù)制單位; 2. 克隆位點(diǎn)克隆位點(diǎn)(多個單克隆位點(diǎn)多個單克隆位點(diǎn)); 3. 篩選標(biāo)記篩選標(biāo)記; 4. 分子量盡可能小分子量盡可能小; 5. 外源外源DNA插入后不影響載體本身的插入后不影響載體本身的復(fù)制復(fù)制. 沒有一個天然的沒有一個天然的DNA完全符合載體完全符合載體條件條件,故使用時(shí)需進(jìn)行改造故使用時(shí)需進(jìn)行改造. 質(zhì)粒質(zhì)粒 plasmid -噬菌體噬菌體 - phage M13 柯斯質(zhì)?？滤官|(zhì)粒 cosmid 常用的克隆載體：常用的克隆載體： 質(zhì)粒質(zhì)粒(plasmid)存在于細(xì)菌染色體外的小型環(huán)存在于細(xì)菌染

17、色體外的小型環(huán)狀雙鏈狀雙鏈DNA分子分子理想的質(zhì)粒理想的質(zhì)粒 * 拷貝數(shù)多拷貝數(shù)多; * 兩三個遺傳標(biāo)志，如抗藥性基因：兩三個遺傳標(biāo)志，如抗藥性基因：抗氨抗氨芐青霉素基因芐青霉素基因(ampr) 、抗四環(huán)素基因抗四環(huán)素基因(terr)；-半乳糖苷酶基因半乳糖苷酶基因(lac Z) 篩選標(biāo)志篩選標(biāo)志* 多個限制酶的單一切點(diǎn)，即多個限制酶的單一切點(diǎn)，即多克隆位點(diǎn)多克隆位點(diǎn)(multiple cloning sites,MCS) * 大小大小 210kb； * 優(yōu)點(diǎn)：易于操作、保存；優(yōu)點(diǎn)：易于操作、保存； * 缺點(diǎn)：轉(zhuǎn)化效率較低，一般缺點(diǎn)：轉(zhuǎn)化效率較低，一般106-7 clone/1ug 轉(zhuǎn)化方法：

18、化學(xué)法轉(zhuǎn)化方法：化學(xué)法 電轉(zhuǎn)電轉(zhuǎn) * 應(yīng)用：應(yīng)用：1. 小基因組的克隆小基因組的克隆 2. 單一序列的克隆單一序列的克隆( 目的基因的目的基因的 克隆克隆)pBR系列系列 來源于來源于Psc101、colE1和和RSF2124三個天然質(zhì)粒改造重組而成，三個天然質(zhì)粒改造重組而成， pBR322是應(yīng)用最多的大腸桿菌質(zhì)粒是應(yīng)用最多的大腸桿菌質(zhì)粒載體，載體，用氯霉素?cái)U(kuò)增法可使質(zhì)粒用氯霉素?cái)U(kuò)增法可使質(zhì)粒DNA占細(xì)胞占細(xì)胞DNA總量的總量的50%，這對，這對制備大量質(zhì)粒制備大量質(zhì)粒DNA極為有利。極為有利。常用的質(zhì)粒載體常用的質(zhì)粒載體 四環(huán)素四環(huán)素抗性基因抗性基因氨芐青霉素氨芐青霉素 抗性基因抗性基因O

19、r i Pst Sal Pvu Ava Bam HHind Eco RpBR322(amp(ampr r) )(ter(terr r) )常用的質(zhì)粒載體常用的質(zhì)粒載體pUC系列系列 pUC系列質(zhì)粒（系列質(zhì)粒（ pUC 8、9、12、13、18、19）具有）具有pBR和和M13的許多的許多特性，一般特性，一般2.7kb. 含有含有Ampr基因和基因和LacZ基因的一部分?；虻囊徊糠?。常用的質(zhì)粒載體常用的質(zhì)粒載體篩選指示系統(tǒng)篩選指示系統(tǒng)藍(lán)白斑篩選藍(lán)白斑篩選 在培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)物在培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)物IPTG（異丙基硫代半乳糖苷）和底物（異丙基硫代半乳糖苷）和底物x-gal，IPTG誘導(dǎo)誘導(dǎo)LacZ

20、表達(dá)產(chǎn)生表達(dá)產(chǎn)生-半半乳糖苷酶，使乳糖苷酶，使x-gal水解，產(chǎn)生蘭色水解，產(chǎn)生蘭色化合物，形成蘭色菌落；化合物，形成蘭色菌落； 當(dāng)插入外源片段，使當(dāng)插入外源片段，使LacZ基因基因失活，形成無色菌斑。失活，形成無色菌斑。IPTG;X-gal(5- 溴溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚-D-半乳糖苷半乳糖苷)常用的克隆載體常用的克隆載體噬菌體噬菌體 噬菌體噬菌體(phage) 外源外源DNA：923kb 常用：常用：EMBL 系列、系列、 gt 系列、系列、charon系列系列 粘性質(zhì)粒粘性質(zhì)粒(cosmid)： DNA的的 cos區(qū)區(qū)+質(zhì)粒，雙質(zhì)粒，雙鏈環(huán)狀鏈環(huán)狀DNA，克隆容量：，克隆容量：405

21、0kb M13噬菌體噬菌體噬菌體噬菌體(phage) 特點(diǎn)：一種能感染大腸桿菌的病毒，野特點(diǎn)：一種能感染大腸桿菌的病毒，野生型為雙鏈線狀生型為雙鏈線狀DNA分子，長度分子，長度48.5kb, 分分子兩端各有一個子兩端各有一個12bp組成的粘性末端組成的粘性末端, 感染感染大腸桿菌后大腸桿菌后,線狀線狀DNA通過粘性末端互補(bǔ)連通過粘性末端互補(bǔ)連接成環(huán)接成環(huán), 連接處稱連接處稱COS位點(diǎn)。位點(diǎn)。 1. 本身有復(fù)制體系本身有復(fù)制體系; 2. 中間中間(J-N間間) 是是生長非必需區(qū)生長非必需區(qū), 可被其可被其它外源它外源DNA取代取代; 3. DNA在體外可包裝成病毒顆粒在體外可包裝成病毒顆粒, 感

22、染效率感染效率高高; 4. 載體容量大載體容量大,可裝入大片段外源可裝入大片段外源DNA (20kb); 5. 可人工加入多克隆位點(diǎn)可人工加入多克隆位點(diǎn); 6. 篩選容易篩選容易噬菌斑篩選噬菌斑篩選; 7. 主要用于主要用于DNA文庫構(gòu)建文庫構(gòu)建. 插入型載體插入型載體含單一的限制含單一的限制性酶切位點(diǎn)，可接受性酶切位點(diǎn)，可接受10kb以下的以下的外源片段，可用于外源片段，可用于cDNA文庫構(gòu)文庫構(gòu)建；建； 取代型載體取代型載體含某一限制性含某一限制性酶的兩個切點(diǎn)，可接受酶的兩個切點(diǎn)，可接受20kb左右左右的外源片段，可用于基因組的外源片段，可用于基因組DNA文庫構(gòu)建。文庫構(gòu)建。將基因組片段克

23、隆進(jìn)將基因組片段克隆進(jìn)lambda置換型載體的基本方法置換型載體的基本方法粘性質(zhì)粒粘性質(zhì)粒(cosmid) 是一種人工改造的載體是一種人工改造的載體,雙鏈環(huán)狀雙鏈環(huán)狀DNA， DNA的的 cos區(qū)區(qū)+質(zhì)粒，克隆容量：質(zhì)粒，克隆容量：40 50kb 1. -DNA的的COS位點(diǎn)及控制包裝的序列位點(diǎn)及控制包裝的序列; 2. 質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)和抗藥性標(biāo)記質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)和抗藥性標(biāo)記 (Ampr); 3. 多種單一的酶切位點(diǎn)多種單一的酶切位點(diǎn).cos:cohesive-end site特點(diǎn)：特點(diǎn)： cosmid較小較小, 約約4 6kb, 可容納可容納40-45kb的外源的外源DNA, 重組體可象噬重組體

24、可象噬菌體一樣進(jìn)行外殼裝配菌體一樣進(jìn)行外殼裝配, 形成噬菌形成噬菌體顆粒體顆粒, 感染大腸桿菌效率比質(zhì)粒感染大腸桿菌效率比質(zhì)粒高得多高得多, 進(jìn)入宿主細(xì)胞后進(jìn)入宿主細(xì)胞后, 只能象質(zhì)只能象質(zhì)粒一樣擴(kuò)增粒一樣擴(kuò)增, 并依賴抗藥性被篩選并依賴抗藥性被篩選.粘性質(zhì)粒粘性質(zhì)粒(Cosmid)優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)缺點(diǎn): 1.克隆效率高克隆效率高; 2.可利用質(zhì)?？衫觅|(zhì)粒DNA的方式擴(kuò)增的方式擴(kuò)增; 3.可克隆較大可克隆較大DNA片段片段; 主要用于真核基因的克隆主要用于真核基因的克隆, 基基因組文庫構(gòu)建因組文庫構(gòu)建 4.缺點(diǎn)缺點(diǎn): 產(chǎn)生串聯(lián)現(xiàn)象。產(chǎn)生串聯(lián)現(xiàn)象。M13噬菌體噬菌體 一種絲狀單鏈?zhǔn)删w，閉環(huán)一種絲狀單

25、鏈?zhǔn)删w，閉環(huán)正鏈正鏈ssDNA，全長，全長6.5kb, 感染大感染大腸桿菌后腸桿菌后, ssDNA 轉(zhuǎn)變?yōu)檗D(zhuǎn)變?yōu)閐sDNA, 可用作克隆載體可用作克隆載體.最大優(yōu)點(diǎn)：最大優(yōu)點(diǎn)：產(chǎn)生單鏈產(chǎn)生單鏈DNA, 可制可制備單鏈備單鏈DNA探針、探針、DNA序列分序列分析及析及DNA的點(diǎn)突變的點(diǎn)突變.RF DNA:replicational form DNAYAC載體（載體（yeast artificial chromosome） 酵母人工染色體，可容納外源基因片酵母人工染色體，可容納外源基因片段長達(dá)段長達(dá)200kb-1000kb，含有酵母第，含有酵母第4號染色號染色體的著絲粒體的著絲粒CEN4、自主復(fù)

26、制序列、自主復(fù)制序列ARS1和和作為端粒的作為端粒的Tel序列，選擇性標(biāo)志序列，選擇性標(biāo)志URA3、TRP1和和SUP4，能在酵母中穩(wěn)定的復(fù)制，能在酵母中穩(wěn)定的復(fù)制，常用于大的染色體基因組常用于大的染色體基因組DNA文庫構(gòu)建。文庫構(gòu)建。一個典型的一個典型的YAC系列載體系列載體YAC克隆的基本過程克隆的基本過程BAC （bacterial artificial chromosome）細(xì)菌人工染色體細(xì)菌人工染色體 基于大腸桿菌的基于大腸桿菌的 F 質(zhì)粒構(gòu)建的，高通量質(zhì)粒構(gòu)建的，高通量低拷貝的質(zhì)粒載體。每個環(huán)狀低拷貝的質(zhì)粒載體。每個環(huán)狀 DNA 分子中攜分子中攜帶一個抗生素抗性標(biāo)記，一個來源于大腸

27、桿帶一個抗生素抗性標(biāo)記，一個來源于大腸桿菌菌 F 因子（致育因子）的嚴(yán)謹(jǐn)型控制的復(fù)制因子（致育因子）的嚴(yán)謹(jǐn)型控制的復(fù)制子子 oriS ，一個，一個RepE 以及三個確保低拷貝質(zhì)以及三個確保低拷貝質(zhì)粒精確分配至子代細(xì)胞的基因座粒精確分配至子代細(xì)胞的基因座 （ parA , parB , 和和 parC ） ，可容納外源基因片段長達(dá)可容納外源基因片段長達(dá)300kb以上，常用于大的染色體基因組以上，常用于大的染色體基因組DNA文庫構(gòu)建。文庫構(gòu)建。 表達(dá)載體表達(dá)載體(expressing vector) 特點(diǎn)：帶表達(dá)構(gòu)件特點(diǎn)：帶表達(dá)構(gòu)件轉(zhuǎn)錄和翻譯所需的轉(zhuǎn)錄和翻譯所需的DNA序列序列 大腸桿菌表達(dá)載體：

28、含啟動子大腸桿菌表達(dá)載體：含啟動子核糖體核糖體結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合位點(diǎn)克隆位點(diǎn)克隆位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄終止信號轉(zhuǎn)錄終止信號 啟動子：啟動子：trp-lac(tac)啟動子、啟動子、噬菌體噬菌體PL啟啟動子、動子、T7噬菌體啟動子噬菌體啟動子 核糖體結(jié)合位點(diǎn)核糖體結(jié)合位點(diǎn)(ribosome-binding site,RBS)：起始密碼子起始密碼子(ATG)和和SD序列序列 轉(zhuǎn)錄終止序列轉(zhuǎn)錄終止序列表達(dá)載體包括的元件表達(dá)載體包括的元件pET11c表達(dá)載體表達(dá)載體pT7-7表達(dá)載體表達(dá)載體哺乳動物表達(dá)載體哺乳動物表達(dá)載體 真核表達(dá)元件：啟動子真核表達(dá)元件：啟動子/增強(qiáng)子增強(qiáng)子克隆位克隆位點(diǎn)點(diǎn)終止信號和加終止信號和加po

29、ly(A)信號信號克隆技術(shù)克隆技術(shù)克隆來源與英語克隆來源與英語“clone”clone”或或“cloning”“cloning”的的音譯，曾譯為無性生殖或無性繁殖，即由同音譯，曾譯為無性生殖或無性繁殖，即由同一個祖先細(xì)胞分裂而形成的純細(xì)胞系，這個一個祖先細(xì)胞分裂而形成的純細(xì)胞系，這個細(xì)胞系每個細(xì)胞的基因彼此是相同的。細(xì)胞系每個細(xì)胞的基因彼此是相同的?？寺〖夹g(shù)第一個發(fā)展時(shí)期克隆技術(shù)第一個發(fā)展時(shí)期微生物克隆。微生物克隆。克隆技術(shù)第二個發(fā)展時(shí)期克隆技術(shù)第二個發(fā)展時(shí)期生物技術(shù)克隆。生物技術(shù)克隆?？寺〖夹g(shù)第三個發(fā)展時(shí)期克隆技術(shù)第三個發(fā)展時(shí)期動物克隆。動物克隆。DNA Cloningi). Restric

30、tion endonucleasesii). Cloning vectorsiii). The process of cloning a segment of DNA How does one isolate a gene for an inherited disorder?There are three options: Start with a candidate proteinDNA protein Start with a candidate mRNADNAmRNA Direct positional cloningDNAAll three options require the cl

31、oning of DNA.DNA mRNA protein4-base cutter:cuts DNA into 256 bp average-sized fragments in a random sequenceevery 256 bp: NO256 bp average-size fragments: YESBar = 256 bpRestriction endonucleasesProducts generated by restriction enzymes COHESIVE ENDSEcoRI5GAATTC35GAATTC33CTTAAG53CTTAA G5PstI5CTGCAG3

32、5CTGCA G33GACGTC53GACGTC5 BLUNT ENDSHaeIII5GGCC3 5GG CC33CCGG5 3CC GG5Formation of recombinant DNA moleculescut DNAsmix together fragments and anneal cohesive endsseal 3, 5 ends by DNA ligaserecombinant DNAsVectors used in molecular cloningVector Insert (and host) Characteristics size rangePlasmid S

33、mall circular DNA phage) plaques form as a consequence of a spreading lytic infectionstarting with a single phage-infected bacterial cell each phage plaque is a clone of identical recombinant phage prepare replica of phage plaques and hybridize DNA with probeE. coli lawn is grown on agar plate and t

34、henoverlayered with the recombinant phage library.Wherever a single bacteriophage particleinfects a bacteria cell, a plaque will form.This is a clear area caused by the lysisof bacteria on the lawn of E. coli.A replica of the agar plate is made on anitrocellulose sheet - the DNA is denaturedand adhe

35、res to the nitrocellulose.The nitrocellulose is hybridized with a labeledDNA probe (such as an oligonucleotide) andthe nitrocellulose is exposed to X-ray film.X-ray filmLabeled probe in solutione.g. an oligo probe32P labelHybridization of probe toimmobilized DNA Probe hybridized to immobilized DNAfo

36、rming double-stranded region How does one isolate a gene for an inherited disorder? Start with a candidate proteinDNAprotein If a protein candidate has been identified for a genetic disease it can be used to make a probe to screen for the gene1. oligonucleotide probe purify the protein of interest p

37、artially sequence the protein find a region having amino acids with the fewest possible codons predict a DNA sequence that could represent a gene regionencoding a portion of the protein synthesize a set of degenerate oligonucleotides for that region hybridize the labeled oligonucleotide to the phage

38、 libraryMET.GLU.PHE.TYR.ILE.CYS.GLN.LYS amino acidsAUG.GAA.UUU.UAU.AUU.UGU.CAA.AAA G C C C C G G all possible A oligonucleotides 1 X 2 X 2 X 2 X 3 X 2 X 2 X 2 = 192-fold degenerate2. antibody probe purify the protein of interest make an antibody to that protein construct cDNA library to express reco

39、mbinant proteins in E. coli use the antibody to detect the protein being made from the cloned cDNA encoded by the recombinant phage in E. coli using plaque hybridization method modified for antibody probesleft armright armbacterial promoter and Shine-Dalgarno sequencehuman cDNA insert How does one i

40、solate a gene for an inherited disorder? Start with a candidate mRNADNAmRNA mRNA candidates can be identified by comparing mRNA populations between normal and abnormal tissues, or by looking for a specific function encoded by the mRNA1. differential cDNA library screening prepare duplicate plaque re

41、plica plates hybridize one with a labeled cDNA probe made to all the mRNAsin the normal cell and hybridize the other (duplicate) with thecorresponding probe to the abnormal cell differences in cell function should be reflected by differencesin the mRNA populations any plaques showing differential hy

42、bridization are candidates hybridization with cDNA probe from normal cellshybridization with cDNA probe from abnormal cellsdifferentially expressed clonenohybrid-izationto thisplaque2. expression screening develop a cell-based functional assay for the abnormality (e.g., a transport assay) construct

43、cDNA library in a way that will allow expression of protein in mammalian cells inject groups of cDNA clones into cells and assay function narrow down cDNA clones using smaller groups of clones until the function is observed with a single cDNA species inject groups of cDNA clones if the function bein

44、g assayed is observed, divide the group of clones into smaller groups and retest continue process of testing smaller groups until the function being assayed is obtained with one clone for example, inject clones and test cells for transport activityleft armright armhuman cDNA insertmammalian promoter

45、克隆基因的表達(dá)克隆基因的表達(dá) 載體有轉(zhuǎn)錄、翻譯的元件；載體有轉(zhuǎn)錄、翻譯的元件； 密碼子通用密碼子通用 原核表達(dá)體系原核表達(dá)體系 原核表達(dá)載體的標(biāo)準(zhǔn)原核表達(dá)載體的標(biāo)準(zhǔn)*合適的篩選標(biāo)志合適的篩選標(biāo)志*強(qiáng)啟動子強(qiáng)啟動子*翻譯控制序列翻譯控制序列*多克隆位點(diǎn)多克隆位點(diǎn)融合蛋白（融合蛋白（fusion protein,包涵體）包涵體）表達(dá)的蛋白質(zhì)或多肽的表達(dá)的蛋白質(zhì)或多肽的N末端由原核末端由原核DNA編碼，編碼，C末斷由克隆的真核末斷由克隆的真核DNA編碼。編碼。大腸桿菌表達(dá)體系的不足大腸桿菌表達(dá)體系的不足缺乏轉(zhuǎn)錄后加工機(jī)制，只能表達(dá)缺乏轉(zhuǎn)錄后加工機(jī)制，只能表達(dá)cDNA缺乏翻譯后加工機(jī)制，不能折疊和糖基化缺乏翻譯后加工機(jī)制，不能折疊和糖基化融合蛋白形成包涵體，復(fù)性后才有活性融合蛋白形成包涵體，復(fù)性后才有活性很難表達(dá)大量的可溶性蛋白很難表