1、畢業(yè)設計說明書人表皮生長因子基因工程發(fā)酵制備中試工藝流程設計學院：生命科學學院專業(yè)： 生物工程學生姓名：黃永鋆學 號：指導教師：劉文2018年6月摘要本設計在基因工程融合表達人表皮生長因子小試工藝基礎上，進行相關流程 和參數(shù)的優(yōu)化，設計出可實施的中試生產工藝。其設計的成果主要有以下三個方 面。第一個方面是對中試工藝的分析與確定，這主要包括以下幾個點，（1）將 發(fā)酵設備從實驗室用的三角瓶設計為中試用的小型全自動發(fā)酵罐，實現(xiàn)了發(fā)酵的 精準控制；（2）將細胞破碎設備從超聲破碎設計為壓力破碎，提高了細胞破碎 率；（3）確定了鎳柱純化方法相較于其他純化方法的優(yōu)勢；（4）分析確定凝膠 層析更適用于蛋白復性

2、。第二個方面設計完成了中試設備的選型，這包括10L發(fā)酵罐、高速冷凍離心 機、壓力破碎儀、鎳柱和凝膠柱。第三個方面是設計了中試的相關操作，這主要有以下幾個點，（1）確定相 關實驗用品的配置；（2）確定具體的操作步驟，設計從最初的菌種放大到最后 純化后蛋白的每一步操作規(guī)程；（3）確定需要進行的相關中試檢測，這包括蛋 白質電泳、紫外分光檢測及最后的濃度計算和活性檢測。通過以上三個方面的內容設計，形成基因工程融合表達人表皮生長因子中試 工藝流程，為后續(xù)中試驗證提供支持。關鍵詞：表皮生長因子，基因工程融合表達，中試工藝，設計AbstractIn this design instrument, an im

3、plementable pilot scale technology was designed and optimized based on the related processes and parameters from human recombinant EGF lab scale technology. The design refers to three detail aspects including: The first aspect is the analysis and determination of the pilot scale technology which inc

4、lude four points.The first point is we can precisely control the fermentation after select a small automatic fermenter in the pilot scale technology.The second point is to change the method of breaking cells to pressure breaking cells to increase the rate of cell disruption.The third point is the ad

5、vantages of the nickel column purification method compared to other purification methods.The last point of analysis gel chromatography is more suitable for protein renaturation.The second aspect was designed to complete the selection of pilot scale technology equipments, which includes 10L fermentor

6、, high-speed refrigerated centrifuge, pressure breaker, nickel column and gel column.The third aspect was the design of related operations, which mainly has the following 3 points.The first point is to determine what relevant experimental supplies are needed;The second point gives the specific opera

7、tion steps from the beginning to the end;The third point lists the detection methods, which include protein electrophoresis, ultraviolet spectrophotometry, concentration calculation, and activity detection.The above three aspects are the main points of the Fere-EGF pilot scale and provide data suppo

8、rt for the next pilot scale technology test.Key words: human recombinant epidermal growth factor, biotechnologiacl expression, pilot scale, design目錄 TOC o 1-5 h z HYPERLINK l bookmark5 o Current Document 摘要IABSTRACT II HYPERLINK l bookmark8 o Current Document 目錄III HYPERLINK l bookmark11 o Current D

9、ocument 第一章引言5 HYPERLINK l bookmark14 o Current Document 1.1課題的背景和意義5 HYPERLINK l bookmark17 o Current Document 1.2EGF蛋白的市場工藝研究分析5 HYPERLINK l bookmark20 o Current Document 1.3本課題設計的對象、目標和方法6第二章基因工程表達及制備過程分析72.1Fere-EGF蛋白小試工藝簡介7小試工程菌發(fā)酵工藝7小試細胞破碎工藝7 HYPERLINK l bookmark27 o Current Document 小試蛋白純化及復性工

10、藝7 HYPERLINK l bookmark30 o Current Document 2.2中試制備過程分析7 HYPERLINK l bookmark33 o Current Document 中試菌種發(fā)酵過程分析7 HYPERLINK l bookmark36 o Current Document 中試細胞破碎過程分析8 HYPERLINK l bookmark39 o Current Document 中試蛋白純化過程分析8 HYPERLINK l bookmark44 o Current Document 2.3中試工藝過程的檢測分析10 HYPERLINK l bookmark5

11、6 o Current Document 菌種發(fā)酵過程檢測10 HYPERLINK l bookmark62 o Current Document 細胞破碎過程檢測11 HYPERLINK l bookmark50 o Current Document 2.3.3 蛋白純化過程檢測 12 HYPERLINK l bookmark53 o Current Document 第三章中試工藝設備分析133.1菌種發(fā)酵過程設備13 HYPERLINK l bookmark59 o Current Document 菌種復蘇及培養(yǎng)器具的配備13發(fā)酵罐的選型分析13 HYPERLINK l bookmar

12、k47 o Current Document 3.2細胞破碎過程設備13離心機的選型分析13 HYPERLINK l bookmark65 o Current Document 壓力破碎儀的選型分析14 HYPERLINK l bookmark68 o Current Document 3.3蛋白純化過程設備14鎳柱的選型分析14凝膠層析柱的選型分析14iii TOC o 1-5 h z HYPERLINK l bookmark71 o Current Document 第四章中試發(fā)酵制備工藝流程設計15 HYPERLINK l bookmark74 o Current Document 4.

13、1中試制備工藝流程圖15 HYPERLINK l bookmark77 o Current Document 4.2工藝操作設計16 HYPERLINK l bookmark80 o Current Document 相關中試用品的預配置16 HYPERLINK l bookmark92 o Current Document 具體工藝操作步驟17 HYPERLINK l bookmark101 o Current Document 蛋白質濃度計算及活性檢測19 HYPERLINK l bookmark104 o Current Document 第五章預期產量及效益分析19 HYPERLINK

14、 l bookmark107 o Current Document 參考文獻20謝辭22第一章引言1.1課題的背景和意義表皮生長因子(Epidermal Growth Factor, EGF) 1962年由Cohen首先在研 究鼠神經生長因子時發(fā)現(xiàn)，由53個氨基酸組成。1975年Starkey、Cohen等從 人尿中提取了人表皮生長因子，與鼠表皮生長因子具有高度一致的結構，并具有 一致的生物學活性。表皮生長因子廣泛存在于人體各種組織中，可刺激多種細胞 增殖，主要是上皮細胞和內皮細胞的增殖，這是通過結合細胞膜上的表皮生長因 子受體(EGFR)而起作用的。EGF通過與細胞受體的膜外部分結合，激活其

15、酪氨 酸激酶活性，誘導蛋白磷酸化，啟動DNA合成，激活RNA、蛋白質合成，促進細 胞增生、移行。因此，EGF可促進表皮細胞、神經細胞和器官組織上皮細胞生長； 可促進新生胎兒齒、骨與各器官的生長；可促進肝細胞再生；可促進胃腸道黏膜 細胞生長和保護胃腸道黏膜受損。鑒于這些功能，現(xiàn)今國內外，天然的或重組的 EGF蛋白已廣泛應用于角膜、皮膚損傷和胃腸潰瘍的治療，其產品涉足醫(yī)藥保健、 化妝品等多個領域，例如表皮生長因子滴眼液，2000年通過CFDA審批，是我國 自行研制的利用酵母體系表達的第一個基因工程藥物?，F(xiàn)今EGF蛋白市場需求量 很大，并隨著對其功能的進一步研究，未來EGF蛋白的應用領域將廣闊。正是

16、基 于這一點，本課題設計的目的是為了在現(xiàn)有的一種EGF蛋白小試生產工藝的基礎 上，進行項目工藝的優(yōu)化，設計一條可以實施的中試生產工藝路線，為接下來的 中試放大工藝驗證提供支持。1.2 EGF蛋白的市場工藝研究分析因EGF具有非常廣泛的應用市場，國內外市場對EGF的生產存在多種工藝。 因天然EGF蛋白提取技術要求較高且較難實現(xiàn)大規(guī)模生產，總的來說主要都是采 用了基因重組的技術，即設計目的基因，導入受體，進行重組蛋白的表達。但受 限于低表達率及低純化收率，在導入受體選擇及純化工藝方法各公司采用的各不 相同。在受體選擇方面，有進行酵母導入，有進行大腸桿菌導入，還有選擇哺乳 細胞進行導入的；而對于蛋白

17、的純化方法，化學沉降、膜分離、金屬親和層析、 離子交換層析、雙水相技術、反膠團技術等各公司選擇都不一樣。例如華諾威藥 業(yè)，其EGF的生產，是選用酵母菌為工程菌，采用了特殊促進劑和處理方法，發(fā) 酵液較平常提高了近30%；又如普羅賽公司，選用哺乳動物細胞做表達載體，在 蛋白純化環(huán)節(jié)加入了特殊的純化介質，使最終的純化后蛋白的純度在95%以上。1.3本課題設計的對象、目標和方法本次課題選用的技術是人表皮生長因子融合蛋白（Fere-EGF）表達工藝，工 程菌為含有Fere-EGF蛋白基因的大腸菌，通過進行發(fā)酵，誘導表達生成重組蛋 白，最后純化得到基因工程表達蛋白。Fere-EGF基因與尋常的EGF蛋白有

18、所不 同，除融合了一段多表位功能序列外，為了便于純化還在EGF末端連接了 6個組 氨酸，以提高蛋白純化純度。在本工藝中，選用的純化方法，是鎳柱親和分離， 而EGF蛋白上加裝的組氨酸因為可以和鎳柱特異性結合，在過鎳柱的過程中，雜 質被洗脫，而目的蛋白被保留，最后再通過洗脫劑，將目的蛋白洗脫，即得到純 度較高的蛋白。另據后續(xù)的結果檢測，顯示Fere-EGF具有和EGF同樣的生理功 能及活性值，可以廣泛應用于科研、生產、藥品等各領域。第二章基因工程表達及制備過程分析2.1 Fere-EGF蛋白小試工藝簡介小試工程菌發(fā)酵工藝首先對冷凍的菌種進行復蘇后擴大培養(yǎng)，即是用含氨芐的LB培養(yǎng)基，在試 管內37C

19、擴大培養(yǎng)12h。之后按接種量1% （菌體積：培養(yǎng)液）接種于含100mlLB 培養(yǎng)液的三角瓶內，先在35C振蕩箱培養(yǎng)2h至對數(shù)期，再提高溫度至42C培養(yǎng) 12h,進行蛋白的誘導表達。小試細胞破碎工藝將三角瓶中的發(fā)酵液降溫后進行離心，4000rpm離心10min，去除上清，將 得到的菌體沉淀用10ml重懸液進行重懸，之后用超聲破碎儀進行菌體破碎。將 破碎液進行離心，8000rpm離心20min，得到我們的含有重組蛋白的包涵體沉淀。小試蛋白純化及復性工藝先進行蛋白洗滌，將得到的包涵體沉淀用PB緩沖液（pH=7.4）進行重懸， 之后加入尿素使溶液體積擴大兩倍，使溶液澄清，8000rpm 20min離心

20、，取上清， 加入1%。-巰基乙醇（V/V）。進行Ni柱純化。將變性后的蛋白液上樣于事先平 衡好的鎳柱，之后分別用4ml的50mM咪唑、14ml的200mM咪唑、4ml的500mM 咪唑進行梯度洗脫，檢測得到目的蛋白在200mM咪唑中被洗脫。對得到的蛋白進 行復性處理，選用透析復性，將得到的咪唑洗脫液裝入干凈的透析袋，先放入事 先配置好的含4M尿素的復性液中24小時，之后放入含2M尿素的復性液中24 小時，最后即得到我們的Fere-EGF蛋白。2.2中試制備過程分析中試菌種發(fā)酵過程分析菌種發(fā)酵的第一步首先是要進行工程菌中的復蘇，由于冷凍工程菌的實驗用 存量較少，其量遠不夠用于中試接種工程菌用量，

21、故其菌種接種前需要進行擴大 培養(yǎng)。小試采用了試管一次擴大菌種量至4ml，在中試環(huán)節(jié)，計劃選用兩次前期 的菌種擴大培養(yǎng)。即在原先試管擴大培養(yǎng)的基礎上，再增加一次大的三角瓶培養(yǎng)， 使工程菌的量達到100ml左右。第二步是進行工程菌的接種并誘導蛋白表達，因設計中試的發(fā)酵量大，我們 需要選擇一個發(fā)酵罐。中試可選用的發(fā)酵罐可分為兩種，傳統(tǒng)型和自動型。在現(xiàn) 今的高校及科研單位、企業(yè)，原有的老式手動型發(fā)酵罐早已經被全自動型的小型 發(fā)酵罐所替代，原先傳統(tǒng)的的手動型發(fā)酵罐操作復雜，且單憑人工很難進行精準 控制，隨著科技的發(fā)展，現(xiàn)有的發(fā)酵罐更加集成化、自動化和網絡化，一般的發(fā) 酵過程參數(shù)都會被記錄，增加了實驗數(shù)據

22、的可溯性。全自動小型發(fā)酵罐一般的容 積為5L、10L，其形體雖小，但結構復雜、全面，包含了空氣系統(tǒng)、蒸汽系統(tǒng)、 冷水系統(tǒng)和補料系統(tǒng)及PH電極、DO電極、溫度電極和泡沫電極等眾多檢測元件。 故本次中試選用10L的小型全自動發(fā)酵罐。中試細胞破碎過程分析中試細胞破碎工藝第一步是需要進行發(fā)酵液的離心，即是將之前的發(fā)酵液放 罐后離心得到我們的大腸桿菌菌體。這一步相較于小試而言，我們需要選擇一臺 處理能力較大的離心機，能夠較快的得到發(fā)酵后的菌體沉淀。第二步是進行菌體的破碎過程，小試工藝選擇的方式為超聲破碎，單純超聲 破碎，在小規(guī)模下且菌量較少的情況下效果較好，由于能量傳遞和局部產熱等原 因，很難用于大體積

23、細胞懸液的破碎，這樣部分未破碎細胞與包涵體混在一起， 給后期純化帶來困難。因此，在中試的細胞破碎中，應當設計選用壓力破碎儀破 碎細菌，細胞壓力破碎儀利用高壓原理對細胞進行擠壓破碎，使樣品均勻并完全 的碎裂，特別適用于厚壁細胞、細菌和較濃樣品的破碎，具有無噪音、溫升少、 無金屬離子污染等特點。用于蛋白質研究、核酸提取及細胞破碎領域，廣泛應用 于各大院校、科研單位的生物實驗室及藥廠。第三步，是進行再離心的過程，將破碎后的破碎液進行高速離心得到我們的 含有重組蛋白的包涵體沉淀。包涵體沉淀，即指大腸桿菌表達的蛋白在細胞內凝 集，形成的無活性的固體顆粒，一般含有50%以上的重組蛋白，其余為核糖體元 件、

24、RNA聚合酶、內毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，環(huán)狀或缺口的質粒 DNA，以及脂體、脂多糖等。中試蛋白純化過程分析中試蛋白純化工藝的第一步是進行目的蛋白的變性、洗滌的過程，同小試一 般，用重懸液將包涵體沉淀重懸以后，加入尿素，能夠使包涵體沉淀變性溶解， 而其中還含有一些附著于包涵體上的一些不溶性雜蛋白，我們通過一次離心的方 法，去除不溶性沉淀，對含有包涵體的上清液進行下步的處理。第二步是進行用鎳柱對蛋白進行純化，其實包涵體純化的工藝中有很多種，以下比較現(xiàn)今主流的幾種包涵體純化的方法，以此說明用鎳柱純化的優(yōu)越性。（1）膜分離，是利用具有一定選擇特性的過濾介質一一膜進行物質的分離 純

25、化。由于蛋白質的尺寸范圍約5-10nm，此次分離的蛋白18.5kDa，屬大分子物 質。因此要對此fere-EGF蛋白分離，需要選用微孔孔徑不同的兩種膜，一種膜 孔徑較小，能使需要的蛋白全部截留，而使小的蛋白、雜質流出，然后將截住的 蛋白質轉移至孔徑較大的膜內，截住比較大的蛋白，使需要的流出，從而達到蛋 白分離的目的。因此需要選用兩種超濾膜，但經過實際的實驗條件分析，該方法 存在以下局限性：1）Fere-EGF蛋白的空間結構目前未知，無法測算其尺寸大小， 即無法選擇大小合適孔徑的膜。2）膜分離均要涉及的問題，濃差極化現(xiàn)象，對 蛋白質穩(wěn)定性及成功率形成挑戰(zhàn)，到目前我們無法拿出有效的風險可控性預案。

26、（2）離子交換層析，是以離子交換劑為固定相，依據流動相中的待分離組 分離子與交換劑上的平衡離子進行可逆交換時結合力大小的差別而將混合物進 行分離的一種方法。已知fere-EGF蛋白等電點為5.83，變性液為堿性，即PH pI值，即色譜柱填充選用陰離子交換樹脂。在經過最后的對比分析后，該設 計方案存在以下局限性：1）離子交換樹脂固定床的床層壓力會隨著分離過程的 進程而不斷加大，需要重新填充，會造成固定床填充過程操作麻煩，對密封性要 求較高。此步目前試驗條件方面達不到。2）離子交換樹脂交聯(lián)度較大，因而空 隙較小，不能允許大分子的進入，而且電荷密度較高，使結合比較牢固，會使吸 附的蛋白質等生物大分子

27、易變性。對于此點，實驗方面尚沒有相關性的檢測及對 應的處理預案。而我們的鎳柱親和層析，即固相金屬親和層析中的一種，是利用螯合金屬離 子Ni2作為蛋白質的連接橋，靠生物學親和層析原理特異性識別蛋白。在本實驗 中，設計的fere-EGF蛋白基因中，即fere序列所編碼的多肽為六個組氨酸，呈 堿性，其設計目的就是為了在過鎳柱時能夠有組氨酸標簽的蛋白特異性結合到柱 子里，其他的雜蛋白流出。這時候再用咪唑洗脫，梯度洗脫，咪唑競爭性結合到 鎳柱上，目的蛋白就被洗脫了，這時候收集浸出液，里面即含有目的蛋白。該分 離技術由于具有簡便、快速、比較專一和高效等特點，能夠得到高純度的目的蛋 白。中試純化蛋白工藝的第

28、三步，是需要進行目的蛋白的復性過程。過鎳柱后的 fere-EGF蛋白，經咪唑洗脫后，仍處于變形狀態(tài)，極大的影響到了后續(xù)的結構 分析和活性測試，因此有必要進行重組蛋白的復性。復性過程是蛋白的重折疊過 程，一般通過降低包涵體變性液中的變性劑含量引發(fā)，蛋白重折疊不是一個單一 的反應，需要進行一系列折疊中間體，最后形成蛋白質的天然構象。小試選用的 復性過程是采用透析袋的方法，因其處理能力及規(guī)模放大存在局限性，故中試選 用凝膠過濾層析法進行復性，此法較透析、稀釋等方法，近年來不斷獲得發(fā)展， 具有回收率高、快速、易放大，樣品稀釋倍數(shù)小等優(yōu)點。選用聚丙烯酰胺葡聚糖 填充凝膠柱，變性蛋白液進入柱頂端后，變形蛋

29、白液由于徑大而進入凝膠顆粒間 的空隙，移動速度快，而變性劑小分子則進入凝膠內部，移動速度慢，隨著變性 劑濃度的逐漸的降低，蛋白開始復性，結構開始緊密，半徑減小，最后進入凝膠 內緩慢緩慢擴散，這減小了分子之間的非特異性疏水相互作用，抑制了復性過程 中聚集的產生，最后蛋白以天然形態(tài)被洗脫。2.3中試工藝過程的檢測分析菌種發(fā)酵過程檢測此步主要是對工程菌誘導表達的檢測，觀測確定是否能夠表達目的蛋白，此 步的檢測方法是利用SDS電泳檢測。首先，將菌種發(fā)酵過程中活化的菌液取樣，轉接40p L到兩個4mL新的含有 Amp的培養(yǎng)基的試管中，記為對照組和誘導組，之后一起放入35C震蕩培養(yǎng)兩個 小時，之后將誘導組

30、轉移到42C水浴搖床誘導過夜，對照組繼續(xù)放在35C培養(yǎng) 箱中培養(yǎng)過夜，剩下的活化菌液（15%的甘油）放入冰箱中4C保存。對誘導組 和對照組進行SDS電泳，取1.5mL兩種菌液制樣，離心收菌后加入200. L 雙蒸水重懸，再加入2X上樣緩沖液，水浴加熱1020min后離心，取可溶性蛋白 質進行SDS電泳，檢測結果圖2-1。23456圖中，1號為對照，2號為C2X, 3號為IL1, 4號為誘導組，5號為對照，6號為誘 導組。對照和誘導分別有兩組，可以看見誘導組有明顯的蛋白條帶而對照組沒有，我們 的目的蛋白是介于C2X和IL1蛋白條帶之間的一個條帶，故通過此步可以確定目的蛋白 可以表達。細胞破碎過程

31、檢測此步主要是對破碎離心后的上清和沉淀做檢測，通過SDS電泳，觀察 蛋白質電泳結果，判斷該蛋白的表達是可溶性還是包涵體表達。首先取破碎用5mL 1M的NaCl溶液洗滌2次(8000rpm 20min 4C)，再用 5mL pH7.4的PB緩沖液重懸，取200. L重懸液加入到1.5mL EP管中，記為沉 淀。同樣取上清液200口 L加入到另一個EP管中，記為上清；另取菌種發(fā)酵過程 中保留的1mL過夜菌離心去上清，用200口 L雙蒸水重懸，記為全菌。將三個EP 管中加入200口 L的2X上樣緩沖液，水浴加熱1020min后離心，取上清液進行 蛋白質電泳。目的蛋白圖中，1號為全菌，2號為上清，3號

32、為上清，4號為沉淀。顯示，沉淀中含有和全 菌中蛋白高度一致的條帶，即為目的蛋白，故可確定蛋白的表達為包涵體表達。蛋白純化過程檢測此步主要是對過鎳柱后的洗脫液及過鎳柱后的洗脫液進行檢測，原有的小試 檢測手法只有對過鎳柱洗脫液進行蛋白質電泳檢測，在中試設計中，因改變了蛋 白復性的方法，考慮選擇一種更加高效快捷的檢測方法，即用紫外分光光度儀對 收集的各組分在280nm波長下測定OD28蛋白質洗脫曲線，如圖2-3，OD280BBVe圖2-3蛋白質洗脫曲線圖收集A、B之間的分部得洗脫后的目的蛋白溶液。第三章中試工藝設備分析3.1菌種發(fā)酵過程設備菌種復蘇及培養(yǎng)器具的配備在菌種復蘇及培養(yǎng)環(huán)節(jié)，基本在實驗室進

33、行小規(guī)模放大，主要需配備的較大 型裝置為高壓蒸汽滅菌鍋、超凈臺、振蕩培養(yǎng)箱。此三種裝置為實驗室配備，能 夠滿足中試需求。以下為三種設備的型號。高壓蒸汽滅菌鍋：LDZX-40SBI型超凈臺：SW-CJ-2D （蘇靜集團）振蕩培養(yǎng)箱：HZQ-F160A型（上海-恒科技有限公司）除此之外，另還需配備相關用的試管、三角瓶等實驗室常用器具。發(fā)酵罐的選型分析按照設計要求，需要選擇一款10L型，根據研究與生產規(guī)律，發(fā)酵罐裝液 系數(shù)為65%-80%，本次設計裝液系數(shù)選擇70%，即發(fā)酵罐裝液7L；工程菌發(fā)酵小 試工藝中溫度波動為35C至42C，中試發(fā)酵罐因涉及滅菌，溫度應能達到121C； 罐壓方面保持常壓或略高

34、于常壓；溶氧值方面保持發(fā)酵過程中供氧充足；PH值 根據小試設計需保持7.2；轉速設定根據具體發(fā)酵罐保持合適值。現(xiàn)今市場的小型全自動發(fā)酵罐多種多樣，具體涉及國內多個品牌，類似美國 NBS、瑞士 Infors或者是國內的上海百侖等企業(yè)，當然其價格也根據品質好壞、 功能多少而定。相對于本次工藝設計所需發(fā)酵罐，市面上基本所有類型都能夠滿 足本中試要求，具體品牌型號的確定可根據具體實施中試計劃時經費的多少和設 計中試使用年限來具體選擇。本次設計以上海百倫公司的10L型全自動發(fā)酵罐為 例來進行設計說明。3.2細胞破碎過程設備離心機的選型分析現(xiàn)今用于發(fā)酵行業(yè)的離心機主要有三種類型，分別為杯式離心機、碟片式離

35、 心機、螺旋式離心機。其中對于碟片式離心機及螺旋式離心機一般應用于實際的 工業(yè)生產中，其能夠實現(xiàn)快速、連續(xù)的處理物料。作為高校和科研單位配備最多 的是杯式離心機，通過離心沉降實現(xiàn)固液分離，而其處理能力也各不相同，小至 幾毫升，大至上萬毫升。本中試設計中，在第一次菌體分離時，發(fā)酵液量較大，在7L左右，故需要 處理能力較大的杯式離心機；另對轉速的要求，在包涵體分離時轉速要求達到 8000rpm。根據本中試要求，設計使用高速冷凍離心機，其轉速一般在20000以上，并 且可控制離心時的溫度。其可選擇的國內或國外型號品牌很多，本次選用現(xiàn)學院 離心室配備的北京時代北利公司的GTR16-2型離心機來進行說明

36、，其可選配的最 大規(guī)格為100mlX4，設計最高轉速為10000r/min，最大相對離心力為11000。 在本次設計中，除第一次發(fā)酵液離心時量大外，后續(xù)的離心量都較小，而對于第 一次的菌體離心可選用多臺離心機同時處理，故此型號規(guī)格的離心機能夠符合實 際的中試生產要求。壓力破碎儀的選型分析本中試設計，需要破碎處理的菌體緩沖液為1L，因每次細胞破碎處理量不 大，只需選用一個實驗型號大小的即可。本次設計選用德國APV-2000 （實驗型） 高壓細胞破碎儀來進行說明。此設備處理量為11L/h，且對大腸桿菌破碎，一次 破碎，細胞破碎率可以達到90%以上，2次或2次以上破碎，細胞破碎率可以達 到大約100

37、%，且細胞破碎后釋放的蛋白活性好。3.3蛋白純化過程設備鎳柱的選型分析根據fere-EGF蛋白小試工藝，鎳柱純化所用柱床體積為1.5ml，中試設計 將柱床體積擴大10倍，即15ml柱體積。按照相應計算，7L發(fā)酵液得到的包涵 體變性液為700ml，15ml柱床體積的鎳柱可處理100ml變性液，即需要7批次的 過鎳柱操作。鎳柱的填充選擇，按照小試所用的純化樹脂選型，繼續(xù)選用上海七海生物科 技有限公司的Ni-NTA His Bind Resin純化樹脂，該直徑平均100um，比表面 積大，結合標簽蛋白的能力大于20mg/ml，另外，此Ni-NTA His Bind Resin 可以連續(xù)多次使用，不需

38、要再生操作，為本次中試中多批次連續(xù)操作帶來了便利。 凝膠層析柱的選型分析目的蛋白洗脫液是在200mM咪唑2倍柱體積到8倍柱體積倍洗脫，即需要進 行凝膠柱復性的洗脫液預估有735ml。為使尿素與目的蛋白能夠徹底分離，設計 洗脫液上樣量為20%，在此基礎上，再設計凝膠柱床體積為500ml，即每次上樣 量可控制在100ml以下，分8批完成復性操作。凝膠柱的填充選擇，按照相關文獻的數(shù)據顯示，固定相選擇Sephacryl S-300 能夠使蛋白的活性回收率最高，故此次設計同樣選擇Sephacryl S-300，洗脫相 選擇PBS緩沖液。第四章中試發(fā)酵制備工藝流程設計4.1中試制備工藝流程圖詳見附件中試人

39、體表皮生長因子制備工藝流程圖。4.2工藝操作設計相關中試用品的預配置（1）培養(yǎng)基的配置初次菌種放大用的LB培養(yǎng)基選用大的500ml三角瓶配置，配置200ml，NaCl 加入2g，酵母提取物加入1g，蛋白胨2g。之后需要進行高溫蒸汽滅菌，并準備 無菌水，相應的氨芐在超凈臺滅菌備用。對于發(fā)酵罐的加料，NaCl加入70g，酵 母提取物加入35g，蛋白胨加入70g。在發(fā)酵罐內加水補充至7L，并加入7ml氨 芐，測定PH，控制在7.2左右。（2）相關試計的配置1）用于沉淀重懸的PB緩沖液（PH=7.4）2）HCI 液（10%）、堿液（10%）3）。-巰基乙醇4）500mM咪唑（含6M尿素）、200mM咪

40、唑（含6M尿素）、50mM咪唑（含6M尿 素）、雙蒸水、含有6M尿素的PB緩沖液5）上樣緩沖液表4-1緩沖液成分1L緩沖液Tris20mM （6MHCI 調 PH 到 7.4）2.42gNaCI250mM14.6gPMSF1mM10ml100 X儲液PBS 緩沖液(將 KH2PO4 0.24 克,Na2HPO4 1.44 克和 NaCl 8.0 克溶于 900ml 蒸 餾水中用HCl調pH至7.4后定容至1000ml，在15磅下滅菌20分鐘)鎳柱及凝膠柱的配置取15ml柱床體積的鎳柱一個，用十倍柱體積上樣緩沖液進行柱平衡。對于凝膠層析柱，取1L大小的層析柱一個，取溶脹后的Sephacryl S

41、-300 水懸浮液500ml加入，用PBS緩沖液10倍進行平衡。具體工藝操作步驟菌種擴大培養(yǎng)即附件工藝流程圖a至b過程。先將預先準備的用于配置200mlLB培養(yǎng)液的 相關實驗用具如物料、燒杯、試管等放入高溫高壓滅菌鍋進行121C30min滅菌。 冷卻后再超凈臺中將取出復蘇后的菌種母液取出40 “L加入到4mL含有Amp (0.1mg/mL)的LB培養(yǎng)基試管內，37C震蕩搖床培養(yǎng)12h，進行菌種的復蘇。之后，再取培養(yǎng)液1ml加入到100ml含有Amp (0.1mg/mL )的LB培養(yǎng)基三角瓶 內，37C震蕩搖床12h培養(yǎng)，進行菌種的擴大培養(yǎng)。發(fā)酵操作即附件工藝流程圖c中發(fā)生的過程。發(fā)酵前先進行準

42、備工作，包括進行儀器 檢查、DO電級斜率標定、PH電級零點標定等。如附件圖例發(fā)酵罐，通過控制面 板對發(fā)酵罐進行3040分鐘的空消操作，之后通過補料泵將事先配置好的物料 加入，并酸堿液同時補料。補料后進行實消操作，123C60min，滅菌后，連接冷 凝水管路，通入冷凝水，連接通氣管路，調整通氣量至5100L/min，并將溫度 電極、pH電極、溶氧電極與控制器連接。溫度降至37C進行接種操作，旋松接 種口，在火焰保護下，打開接種口，倒入70ml擴大培養(yǎng)的菌液，旋緊接種蓋， 移去火焰圈。通過控制面板使溫度保持在35 C，進行對數(shù)期培養(yǎng)，壓力控制0.12MPa, PH控制7.2,轉速80rpm左右，控

43、制通氣速度保持溶氧充足。對數(shù)培 養(yǎng)2h后，升溫至42C，維持12小時，進行蛋白的誘導表達，其他參數(shù)控制不 變。誘導表達后進行降溫處理，準備放罐。在進行發(fā)酵罐的操作時，應同步進行菌種發(fā)酵過程檢測，即取樣擴大培養(yǎng)后 的菌液，按照前述的檢測方法，進行SDS電泳，觀測確定是否能夠表達目 的蛋白。菌體離心即附件工藝流程圖d過程。用潔凈5L燒杯分批接取發(fā)酵液至離心室，打開 GTR16-2型離心機，四個杯瓶每個約裝取80ml發(fā)酵液，可同時選用兩臺離心機 同時處理，相關參數(shù)設定為4000rpm離心10min取出，上清液棄用，將沉淀的菌 體用潔凈大燒杯收集。之后進行下一批次的放料離心，進行多次后，得到發(fā)酵后 的

44、菌體。菌體破碎和離心即附件工藝流程圖e過程。將得到的菌體用1LPB緩沖液進行重懸，之后用 壓力破碎儀進行菌體破碎，反復破碎三次，使菌體破碎完全。破碎液用燒杯收集 后用杯式離心機離心，8000rpm 20min 4C離心分離沉淀上清。將得到的包涵體 沉淀用潔凈燒杯收集。在包涵體沉淀和上清分離后，分別取樣，按照前述第二章檢測方法進行 SDS電泳，確定為包涵體表達。洗滌向包涵體沉淀中加入400mlPB緩沖液進行重懸操作，再加入研磨成細粉的尿 素使體積擴大為原來的兩倍，使溶液澄清，8000rpm 20min離心。過鎳柱即附件工藝流程圖f過程。取上清液加入7ml左右的。-巰基乙醇，進行過 鎳柱操作。對已

45、經配置好的15ml鎳柱，分別用500mM咪唑、NaCI溶液、雙蒸水 進行沖洗，再加入100ml經變性液處理后蛋白液，用40ml50mM咪唑進行沖洗， 之后用140ml200mM咪唑進行沖洗，洗脫液按柱床倍數(shù)用小燒杯收集，再之后用 40ml500mM咪唑進行沖洗。剩余6批重復此操作，將每批的2至8倍柱床體積收 集，預估一共735ml。之后進行前述第二章的紫外分光檢測，得到含目的蛋白的洗脫液。(7)蛋白復性即附件工藝流程圖g過程。將含有目的蛋白的咪唑洗脫液進行過凝膠柱純 化。設計的凝膠柱床500ml，按20%的量加入，即取含目的蛋白洗脫液100ml上 事先平衡后的凝膠柱，用PBS緩沖液進行蛋白質洗

46、脫，洗脫液按組收集，每組 20ml，收集20組后，對凝膠柱進行5倍PBS緩沖液清洗，之后重復進行剩余7 批次的過柱操作。之后進行紫外分光檢測，得到復性后的蛋白液。蛋白質濃度計算及活性檢測取樣品稀釋5倍后測定OD280，OD260。利用公式：計算其蛋白質濃度。對于活性檢測，主要分為三個階段的工作，一為確定表達的蛋白為EGF，可 采用原位抗原抗體熒光標記法檢測；第二階段為檢測的EGF是否具有活性，此步 采用觀測單位時間細胞生長狀況來判斷；第三階段是測定EGF的活性值，此步采 用(中國藥典)中MTT法測定重組蛋白的活性。第五章預期產量及效益分析按小試工藝，每投100ml發(fā)酵液，最終產量在5mg左右。

47、即按照相應放大比 例，每投料7L，則每批產量在350mg左右。每批次投料，即工程菌發(fā)酵環(huán)節(jié)，其為連續(xù)作業(yè)，反應時間需要14h，考慮 放罐、洗釜、滅菌等操作，則每批次所需時間在20h左右。而在工程菌中母液擴第五章預期產量與效益分析大環(huán)節(jié)除第一次生產需要耗時24h夕卜，在后續(xù)的連續(xù)工藝可經過合理設計能夠連 續(xù)每批次提供給發(fā)酵罐足量的活化菌種。剩余工藝環(huán)節(jié)，包括細胞破碎、蛋白純 化，均可實現(xiàn)在發(fā)酵罐投料期內實現(xiàn)量產。故綜合所述，在連續(xù)投料情形下，每 批次量產可按20h計算。在連續(xù)投產的情況下，應不少于以下配置，表5-1崗位人員安排及職責表崗位名稱人數(shù)崗位職責菌種發(fā)酵階段2人/每班負責發(fā)酵罐反應，實時

48、控制參 數(shù)，并同時進行工程菌種的擴 大，為連續(xù)批次的發(fā)酵罐提供 活化菌種細胞破碎及蛋白純化階段3人/每班負責菌種的壓力破碎、離心及后續(xù)的鎳柱純化和凝膠柱復性操作工作模式同工廠試行24小試工作制，年生產天數(shù)按300天計算，則有300 X 24： 20 X 350=126000mg即為126g，人體表皮生長因子中試規(guī)?？蓪崿F(xiàn)年產值126g.按照相關的市場行情估算，每mg在50元左右，則可實現(xiàn)營業(yè)額630萬。參考文獻柴燕濤，姜棋予，謝國明，等.包涵體蛋白3種純化方法的比較J.中國醫(yī)藥導報,2016,(10):4-6.Sharma K,Babu PVC,Sasidhar P, et al.Recomb

49、inant human epidermal growth factorinclusion body solubilization and refolding at large scale using expanded-bed adsorption chromatography from Escherichia coliJ.Protein Expression and Purification,2008,(1):7-14.付明娟,林接玉(綜述),謝捷明(審校).包涵體蛋白復性的研究進展J.醫(yī)學綜述，2015,(20):3657-3659. DOI:10.3969/j.issn.1006-2084.2015.20.004.郭東東，黃秉仁.EGF結構與功能研究J.醫(yī)學研究通訊，2002,(5):24-26. DOI:1