1、湖北理工學(xué)院醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)與免疫學(xué)教研室1湖北理工學(xué)院精品課程醫(yī)學(xué)免疫學(xué)2第二十二章 免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的基本原理第一節(jié) 抗原或抗體的體外檢測(cè)第二節(jié) 免疫細(xì)胞的檢測(cè)第三節(jié) 免疫細(xì)胞功能測(cè)定3第一節(jié) 抗原或抗體的體外檢測(cè)原理：抗原抗體在體外特異性結(jié)合后，出現(xiàn)肉眼可見或借助儀器可檢測(cè)的各種現(xiàn)象，據(jù)此對(duì)樣品中的抗原或抗體能進(jìn)行定性、定量、定位的檢測(cè)。血清學(xué)反應(yīng) ：進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)時(shí)，以往多采用人或動(dòng)物的血清作為抗體來(lái)源，故體外的抗原抗體反應(yīng)也稱血清學(xué)反應(yīng)。一、抗原-抗體反應(yīng)的特點(diǎn)1、抗原-抗體反應(yīng)的特異性 一種抗原通常只能與其刺激機(jī)體產(chǎn)生的抗體結(jié)合，這種抗原-抗體結(jié)合反應(yīng)的專一性稱為特異性。42、抗原

2、-抗體反應(yīng)的可逆性 非共價(jià)鍵結(jié)合的抗原-抗體復(fù)合物不穩(wěn)定，降低溶液的pH值或提高溶液的離子強(qiáng)度，可使抗原-抗體復(fù)合物離解（即具可逆性）。3、抗原-抗體反應(yīng)的可見性 抗原與抗體結(jié)合后能否出現(xiàn)肉眼可見的反應(yīng)取決于二者的比例和濃度。4、抗原-抗體反應(yīng)的階段性 分為兩個(gè)階段，第一個(gè)是抗原-抗體特異性結(jié)合階段，其特點(diǎn)是反應(yīng)快，一般不能為肉眼可見；第二階段為反應(yīng)可見階段，根據(jù)參加反應(yīng)的抗原物理狀態(tài)的不同，可出現(xiàn)凝集、沉淀和細(xì)胞溶解等現(xiàn)象，其特點(diǎn)是所需時(shí)間長(zhǎng)，且受電解質(zhì)、溫度和酸堿度等因素的影響。5二、抗原-抗體反應(yīng)的影響因素1.電解質(zhì) 抗原和抗體在中性和弱堿性條件下，表面帶有較多的負(fù)電荷，適當(dāng)濃度的電解質(zhì)

3、會(huì)使他們失去一部分負(fù)電荷而相互結(jié)合，出現(xiàn)肉眼可見的凝聚團(tuán)塊或沉淀物?？乖?抗體反應(yīng)通常應(yīng)用0.85%的氯化鈉作為稀釋液，以供給適應(yīng)濃度的電解質(zhì)。2.溫度 較高的溫度可以增加抗原和抗體接觸的機(jī)會(huì)，從而加速反應(yīng)的出現(xiàn)。常用37水浴保溫。3.酸堿度 血清學(xué)反應(yīng)常用pH為6-8，過(guò)高或過(guò)低的pH可使抗原抗體復(fù)合物重新離解。6三、抗原-抗體反應(yīng)類型和檢測(cè)方法（一）凝集反應(yīng)：顆粒性抗原（如細(xì)菌、紅細(xì)胞等）與相應(yīng)抗體結(jié)合，在一定條件下（電解質(zhì)、pH、溫度等）出現(xiàn)肉眼可見的凝集物，稱為凝集反應(yīng)。 根據(jù)抗原的性質(zhì)分為直接凝集試驗(yàn)和間接凝集試驗(yàn)。 1.直接凝集試驗(yàn)顆粒性抗原與相應(yīng)抗體直接結(jié)合并出現(xiàn)凝集現(xiàn)象的稱作直

4、接凝集試驗(yàn)。按操作方法可分玻片法和試管法兩種。（1）玻片法 為一種定性試驗(yàn)。將含有已知抗體的診斷血清與待檢抗原懸液在玻片上混合，數(shù)分鐘后，如出現(xiàn)顆粒狀或絮狀凝集，即為陽(yáng)性反應(yīng)。 此法簡(jiǎn)便快速，適用于新分細(xì)菌的鑒定或分型。如沙門氏菌的鑒定。也可用已知的診斷抗原，檢測(cè)待檢血清中的相應(yīng)抗體，如ABO血型鑒定。7傷寒桿菌免疫血清 傷寒桿菌免疫血清 生理鹽水（NS）+ + +大腸埃希菌 傷寒沙門菌 傷寒沙門菌陽(yáng)性：液體變清，并有乳白色凝集塊出現(xiàn)。陰性：液體仍然混濁，無(wú)凝集塊出現(xiàn)。菌種鑒定 8不凝集（-） 凝集（+） 血型鑒定AB 診斷血清 血型鑒定試驗(yàn)結(jié)果與判定血型 抗A 抗B A + - B - +

5、AB + + O - - 910（2）試管法 為一種定量試驗(yàn)，用以檢測(cè)血清抗體含量。以協(xié)助疾病的診斷，如肥大反應(yīng)、外斐反應(yīng)等 。 將待檢血清用生理鹽水作倍比稀釋，然后加入等量抗原，置37水浴數(shù)小時(shí)觀察。視不同凝集程度記錄為+(100凝集)、+(75凝集)、+(50凝集)、+(25凝集)和-(不凝集)。以其+以上的血清最大稀釋度為該血清的凝集價(jià)(或稱滴度)。 試驗(yàn)時(shí)必須設(shè)置陽(yáng)性血清、陰性血清和生理鹽水等對(duì)照。112.間接凝集試驗(yàn)(indirect agglutination)將可溶性抗原吸附于一種與免疫無(wú)關(guān)的顆粒狀載體表面，與相應(yīng)抗體作用，在電解質(zhì)存在條件下，出現(xiàn)的特異性的凝集反應(yīng)稱為間接凝集反

6、應(yīng)。用來(lái)檢測(cè)待檢血清中細(xì)菌、病毒、螺旋體、寄生蟲抗體及自身抗體（抗核抗體、類風(fēng)濕因子等）。 優(yōu)點(diǎn) 敏感性高，比直接凝集反應(yīng)敏感2-8倍。 常用載體 用紅細(xì)胞、聚苯乙烯乳膠、活性炭等顆粒作為載體，當(dāng)載體吸附了可溶性抗原后即稱為致敏顆粒。12間接凝集抑制試驗(yàn)(indirect agglutination inhibition test)：將已知Ab 先與被檢的可溶性Ag混合，隔一定的時(shí)間后再加入致敏顆粒，如果已知抗體與被測(cè)抗原結(jié)合，不再出現(xiàn)凝集現(xiàn)象者稱為間接凝集抑制試驗(yàn)。常用與妊娠診斷，即用乳膠間接凝集抑制實(shí)驗(yàn)檢測(cè)早期妊娠婦女尿中的絨毛膜促性腺激素。左側(cè)對(duì)照實(shí)驗(yàn)：出現(xiàn)均勻的凝集顆粒。妊娠診斷試驗(yàn)陰

7、性：出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，即凝集未被抑制，說(shuō)明待檢尿液中無(wú)HCG。妊娠診斷試驗(yàn)陽(yáng)性：不出現(xiàn)凝集，即凝集被抑制，說(shuō)明待檢尿液中有HCG。 凝集（試驗(yàn)陰性）不凝集（試驗(yàn)陽(yáng)性）13反向間接凝集反應(yīng)：是將已知抗體吸附到載體顆粒表面，以檢測(cè)相應(yīng)可溶性抗原的凝集反應(yīng)。如檢測(cè)乙型肝炎表面抗原（HBsAg）及甲種胎兒蛋白（AFP）協(xié)助診斷乙型肝炎和原發(fā)性肝癌。3. 協(xié)同凝集試驗(yàn)(COAG) 葡萄球菌A蛋白(SPA) 能與多種動(dòng)物IgG分子的Fc片結(jié)合，結(jié)合后保持其抗體活性，當(dāng)與相應(yīng)的抗原結(jié)合時(shí)，就可產(chǎn)生凝集反應(yīng)。本法廣泛應(yīng)用于多種細(xì)菌和某些病毒的快速診斷。14（二）沉淀試驗(yàn) 可溶性抗原與相應(yīng)的抗體結(jié)合，在一定條件下，

8、形成肉眼可見的白色沉淀物稱為沉淀反應(yīng)(precipitation)。 參與沉淀試驗(yàn)的抗原稱沉淀原，抗體稱為沉淀素?？乖梢允嵌嗵?、蛋白質(zhì)、類脂等，抗原分子較小，如細(xì)菌的外毒素、內(nèi)毒素、菌體裂解液，病毒的可溶性抗原、血清、組織浸出液等。1.環(huán)狀沉淀試驗(yàn) 在內(nèi)徑為2-3mm的小試管底部先加入已知抗血清，然后沿試管壁緩緩加入已適當(dāng)稀釋的待測(cè)抗原于血清層上，使之成為分界清晰的兩層。數(shù)分鐘后，兩層液面交界處出現(xiàn)白色環(huán)狀沉淀，即為陽(yáng)性反應(yīng)。用于法醫(yī)的血跡鑒定、昆蟲吸血性測(cè)定、炭疽病的診斷等。 152.瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn) 瓊脂凝膠呈多孔結(jié)構(gòu)，孔內(nèi)充滿水分，1瓊脂凝膠的孔徑約為85nm，各種抗原抗體在瓊脂凝膠中自由

9、擴(kuò)散。 用瓊脂制成固體的凝膠，使抗原抗體在瓊脂凝膠中擴(kuò)散，當(dāng)二者在比例適當(dāng)處相遇形成肉眼可見的沉淀物，即發(fā)生沉淀反應(yīng)，形成肉眼可見的沉淀帶，稱為瓊脂擴(kuò)散。1617雙向雙擴(kuò)散：即用1瓊脂澆成厚2-3mm的凝膠板，在其上打圓孔，是將抗原與抗體分別加入瓊脂凝膠的小孔中，二者自由向周圍擴(kuò)散并相遇，在比例合適處形成沉淀線。如果反應(yīng)體系中含兩種以上的抗原抗體系統(tǒng)，則小孔間可出現(xiàn)兩條以上的沉淀線。本法常用于抗原或抗體的定性 、組成和兩種抗原相關(guān)性分析的檢測(cè)。 用8% Nacl溶液制1%瓊脂糖平板，打孔（孔徑6 mm周邊與中心孔距3 mm）。183.對(duì)流免疫電泳(counter immunoelectroph

10、oresis) 原理 抗原在堿性溶液(pH82)中帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)，而抗體球蛋白帶電荷弱，在瓊脂電泳時(shí)，由于電滲作用，向相反的負(fù)極泳動(dòng)。將抗體置正極端，抗原置負(fù)極端，電泳時(shí)抗原抗體相向泳動(dòng)，在兩孔之間形成沉淀帶。 瓊脂凝膠制備 選用優(yōu)質(zhì)瓊脂（或瓊脂糖），濃度為1-2，pH通常用pH8.2-8.6的巴比妥緩沖液，離子強(qiáng)度為0.025-0.075molL，并加0.01硫柳汞作防腐劑。19極-+極AbAgAbAbAgAg 試驗(yàn)操作 制備瓊脂凝膠玻板、打孔，挑去孔內(nèi)瓊脂后，將抗原置負(fù)極一側(cè)孔內(nèi)，抗血清置正極側(cè)孔。加樣后電泳30-90min觀察結(jié)果。20試驗(yàn)操作 制備瓊脂凝膠玻板、打孔，挑去

11、孔內(nèi)瓊脂后，將抗原置負(fù)極一側(cè)孔內(nèi)，抗血清置正極側(cè)孔。加樣后電泳30-90min觀察結(jié)果。本法優(yōu)點(diǎn) a.敏感 較雙擴(kuò)散敏感10-16倍；b.快速 僅需1h左右，大大縮短了沉淀帶出現(xiàn)的時(shí)間。c.用途 適用快速診斷檢測(cè)。如乙型肝炎抗原的快速檢測(cè)，口蹄疫等的快速確診。21（三）免疫標(biāo)記技術(shù)：是利用熒光素、酶、放射性同位素等標(biāo)記抗體或抗原進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)。具有特異性強(qiáng)，敏感性高的特點(diǎn)，廣泛用于多種抗原抗體的測(cè)定，有免疫酶技術(shù)、免疫熒光技術(shù)、放射免疫測(cè)定法等實(shí)驗(yàn)方法。抗體、抗原分子小，在含量低時(shí)形成的抗原抗體復(fù)合物是不可見的。有一些物質(zhì)即使在超微量時(shí)也能通過(guò)特殊的方法將其檢查出來(lái)，如果將這些物質(zhì)標(biāo)記在抗體

12、分子上，可以通過(guò)檢測(cè)標(biāo)記分子來(lái)顯示抗原抗體復(fù)合物的存在，此種根據(jù)抗原抗體結(jié)合的特異性和標(biāo)記分子的敏感性建立的技術(shù)，稱為標(biāo)記抗體技術(shù)。 22（四）補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn) 補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)是應(yīng)用可溶性抗原，與相抗體結(jié)合后，其抗原抗體復(fù)合物可以結(jié)合補(bǔ)體，但這一反應(yīng)肉眼不能察覺，如再加入致敏紅細(xì)胞(溶血系)，可根據(jù)是否出現(xiàn)溶血反應(yīng)判定反應(yīng)系統(tǒng)中是否存在相應(yīng)的抗原和抗體。參與補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)的抗體稱為補(bǔ)體結(jié)合抗體。補(bǔ)體結(jié)合抗體主要為IgG和IgM。通常是利用已知抗原檢測(cè)未知抗體。 23（五）中和試驗(yàn) 根據(jù)抗體能否中和病毒的感染性而建立的免疫學(xué)試驗(yàn)稱為中和試驗(yàn)。中和試驗(yàn)極為特異和敏感，主要用于病毒感染的血清學(xué)診斷、病毒分離

13、株的鑒定、不同病毒株的抗原關(guān)系研究、疫苗免疫原性的評(píng)價(jià)、免疫血清的質(zhì)量評(píng)價(jià)和測(cè)定動(dòng)物血清抗體的檢測(cè)等。 中和試驗(yàn)的基本過(guò)程 先將抗血清與病毒混合，經(jīng)適當(dāng)時(shí)間作用。然后接種于宿主系統(tǒng)以檢測(cè)混合液中的病毒感染力。宿主系統(tǒng)可以是雞胚、動(dòng)物或細(xì)胞培養(yǎng)等，目前大多采用細(xì)胞中和試驗(yàn)。24 根據(jù)其產(chǎn)生的保護(hù)效果的差異，可判斷該病毒是否已被中和，并根據(jù)一定方法計(jì)算中和的程度(中和指數(shù))，即代表中和抗體的效價(jià)。 種類 根據(jù)測(cè)定中方法的不同，中和試驗(yàn)主要有兩種。一是測(cè)定能使動(dòng)物或細(xì)胞死亡數(shù)目減少至50(半數(shù)保護(hù)率，PD50)血清稀釋度，即終點(diǎn)法中和試驗(yàn)。二是測(cè)定使病毒在細(xì)胞上形成的空斑數(shù)目減少至50時(shí)血清稀釋度，

14、即空斑減少法中和試驗(yàn)。 毒素和抗毒素亦可進(jìn)行中和試驗(yàn)，其方法與病毒中和試驗(yàn)基本相同。 25第三節(jié) 細(xì)胞免疫測(cè)定法a、細(xì)胞免疫體外檢測(cè)法E玫瑰花結(jié)實(shí)驗(yàn)：取受試者外周血，分離淋巴細(xì)胞，與綿羊紅細(xì)胞在培養(yǎng)液中混合，在42h作用后，綿羊紅細(xì)胞吸附于具有E受體的T細(xì)胞的周圍，形成玫瑰花狀的細(xì)胞集團(tuán)。臨床用于：1、細(xì)胞免疫缺陷病的診斷，原發(fā)性或繼發(fā)性細(xì)胞免疫缺陷病時(shí)，E花結(jié)形成較低；2、觀察腫瘤治療及判斷愈后；3、監(jiān)測(cè)移植排斥反應(yīng)，E花環(huán)形成百分率增高，提示排斥反應(yīng)發(fā)生。2627淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)：應(yīng)用最廣的是PHA的T細(xì)胞非特異性轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。取全血或分離的淋巴細(xì)胞，加入定量的植物血凝素（PHA）培養(yǎng)液，36孵育72h，涂片、