1、第2節(jié)動(dòng)物細(xì)胞工程法。3.概述單克隆抗體的制備過(guò)程及應(yīng)用。4.簡(jiǎn)述動(dòng)物體細(xì)胞核移植的過(guò)程、應(yīng)用前景及存在問(wèn)題。重難點(diǎn):1.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)。2.單克隆抗體的制備。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)是指從動(dòng)物體中取出相關(guān)的組織,將它分散成單個(gè)細(xì)胞,然后在適宜的培養(yǎng)條件下,讓這些細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的技術(shù)。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)是動(dòng)物細(xì)胞工程的根底。1 | 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)(1)無(wú)菌、無(wú)毒的環(huán)境:對(duì)培養(yǎng)液和所有培養(yǎng)用具進(jìn)行滅菌處理以及在無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行操作。培養(yǎng)液需定期更換,以便去除代謝物,防止細(xì)胞代謝物積累對(duì)細(xì)胞自身造成危害。(2)營(yíng)養(yǎng):除糖類、氨基酸、無(wú)機(jī)鹽和維生素等細(xì)胞所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)外,通常還需加入血清等一些天然成分。(3)適宜的溫度、p

2、H和滲透壓:哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的溫度多以36.50.5 為宜,多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞生存的適宜pH為7.27.4,此外滲透壓也是動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中需要考慮的一個(gè)重要環(huán)境參數(shù)。(4)適宜的氣體環(huán)境:動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)所需的氣體主要有CO2和O2。O2是細(xì)胞代謝所必需的,CO2的主要作用是維持培養(yǎng)液的pH。(1)材料處理:對(duì)新鮮取材的動(dòng)物組織進(jìn)行處理,或用機(jī)械的方法,或用胰蛋白酶、膠原蛋白酶等處理一段時(shí)間,將組織分散成單個(gè)細(xì)胞。(2)培養(yǎng):用培養(yǎng)液將細(xì)胞制成細(xì)胞懸液,再將細(xì)胞懸液放入培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶?jī)?nèi),置于適宜環(huán)境中培養(yǎng)。(3)原代培養(yǎng)與傳代培養(yǎng)a.原代培養(yǎng):動(dòng)物組織經(jīng)處理后的初次培養(yǎng),通常指分瓶之前的細(xì)胞培養(yǎng)。b.

3、傳代培養(yǎng):分瓶后的細(xì)胞培養(yǎng)。(4)收集:在進(jìn)行傳代培養(yǎng)時(shí),懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞直接用離心法收集;貼壁細(xì)胞需要重新用胰蛋白酶等處理,使之分散成單個(gè)細(xì)胞,然后再用離心法收集。體外培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞可以分為兩大類:一類細(xì)胞能夠懸浮在培養(yǎng)液中生長(zhǎng)增殖;另一類那么需要貼附于某些基質(zhì)外表才能生長(zhǎng)增殖。懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞會(huì)因細(xì)胞密度過(guò)大、有害代謝物積累和培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏等因素而分裂受阻。貼壁細(xì)胞在生長(zhǎng)增殖時(shí),除受上述因素的影響外,還會(huì)發(fā)生 接觸抑制現(xiàn)象,這時(shí)就需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分瓶培養(yǎng)。細(xì)胞往往貼附在培養(yǎng)瓶的瓶壁上,這種現(xiàn)象稱為細(xì)胞貼壁。細(xì)胞數(shù)目不斷增多,當(dāng)貼壁細(xì)胞分裂生長(zhǎng)到外表相互接觸時(shí),細(xì)胞通常會(huì)停止分裂增殖,這種現(xiàn)

4、象稱為細(xì)胞的接觸抑制。1.干細(xì)胞存在部位及其分類干細(xì)胞存在于早期胚胎、骨髓和臍帶血等多種組織和器官中,包括胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞等。2.胚胎干細(xì)胞的特點(diǎn)胚胎干細(xì)胞(簡(jiǎn)稱ES細(xì)胞)具有分化為成年動(dòng)物體內(nèi)的任何一種類型的細(xì)胞,并進(jìn)一步形成機(jī)體的所有組織和器官甚至個(gè)體的潛能。3.成體干細(xì)胞的特點(diǎn)成體干細(xì)胞包括骨髓中的造血干細(xì)胞、神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)干細(xì)胞和睪丸中的精原干細(xì)胞等。一般認(rèn)為,成體干細(xì)胞具有組織特異性,只能分化成特定的細(xì)胞或組織,不具有發(fā)育成完整個(gè)體的能力。2 | 干細(xì)胞培養(yǎng)及其應(yīng)用(1)用于治療白血病及一些惡性腫瘤放療或化療后引起的造血系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)功能障礙等疾病。(2)治療神經(jīng)組織損傷和神

5、經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,如帕金森病、阿爾茨海默病等。因?yàn)檎T導(dǎo)過(guò)程無(wú)須破壞胚胎,而且誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(簡(jiǎn)稱iPS細(xì)胞)可以來(lái)源于病人自身的體細(xì)胞,將它移植回病人體內(nèi)后,理論上可以防止免疫排斥反響,所以科學(xué)家普遍認(rèn)為iPS細(xì)胞的應(yīng)用前景優(yōu)于胚胎干細(xì)胞。1.動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)的概念:動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)就是使兩個(gè)或多個(gè)動(dòng)物細(xì)胞結(jié)合形成一個(gè)細(xì)胞的技術(shù)。融合后形成的雜交細(xì)胞具有原來(lái)兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞的遺傳信息。3 | 動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)與單克隆抗體細(xì)胞膜的流動(dòng)性電融合法PEG融合法滅活病毒誘導(dǎo)法有性雜交的局限遠(yuǎn)緣雜交特別提醒動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)是制備單克隆抗體的根底,制備單克隆抗體是動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)的應(yīng)用。3.單克隆抗體及其應(yīng)

6、用(1)原理:一種B淋巴細(xì)胞在抗原的刺激下,只能產(chǎn)生一種針對(duì)這種抗原的特異性抗體。骨髓瘤細(xì)胞能夠無(wú)限增殖,B淋巴細(xì)胞與其融合后形成的雜交瘤細(xì)胞既能迅速大量增殖,又能產(chǎn)生專一抗體。(2)制備過(guò)程特定的抗原雜交瘤小鼠腹腔 (3)單克隆抗體的優(yōu)點(diǎn):準(zhǔn)確識(shí)別抗原的細(xì)微差異,與特定抗原發(fā)生特異性結(jié)合,并且可以大量制備。(4)單克隆抗體的應(yīng)用:作為診斷試劑,在多種疾病的診斷和病原體鑒定中發(fā)揮重要的作用。單克隆抗體自身也能用于治療疾病。在醫(yī)藥領(lǐng)域,單克隆抗體藥物占有非常重要的地位。4 | 動(dòng)物體細(xì)胞核移植技術(shù)和克隆動(dòng)細(xì)胞核去核的卵母細(xì)胞新組合的細(xì)胞新胚胎克隆動(dòng)物細(xì)胞核的全能性胚胎細(xì)胞核移植體細(xì)胞核移植動(dòng)物個(gè)

7、體M期去核電融合法根本相同(1)應(yīng)用前景a.畜牧生產(chǎn):加速家畜遺傳改進(jìn)進(jìn)程,促進(jìn)優(yōu)良畜群繁育。b.醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域:通過(guò)建立轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞系,再利用體細(xì)胞核移植技術(shù)培育的轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物可以作為生物反響器,生產(chǎn)許多珍貴的醫(yī)用蛋白。c.治療人類疾病:轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物的細(xì)胞、組織或器官可以作為異種移植的供體。d.保護(hù)瀕危物種:該技術(shù)有望增加瀕危物種的存活數(shù)量。(2)存在問(wèn)題:絕大多數(shù)克隆動(dòng)物存在健康問(wèn)題,許多克隆動(dòng)物表現(xiàn)出遺傳和生理缺陷。1.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)選用的培養(yǎng)材料大多為動(dòng)物的受精卵。()提示:動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)選用的培養(yǎng)材料大多為幼齡動(dòng)物的器官或組織。2.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中通常在培養(yǎng)液中通入5%的CO2刺激細(xì)

8、胞呼吸。()提示:動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中通常在培養(yǎng)液中通入5%的CO2,目的是維持培養(yǎng)液的pH。3.動(dòng)物細(xì)胞融合過(guò)程中既有細(xì)胞膜融合也有核的融合。()4.與植物原生質(zhì)體融合相比,動(dòng)物細(xì)胞融合特有的誘導(dǎo)因素有聚乙二醇、滅活的病毒。()提示:與植物原生質(zhì)體融合相比,動(dòng)物細(xì)胞融合特有的誘導(dǎo)因素是滅活的病毒。5.動(dòng)物細(xì)胞融合的結(jié)果是形成單核的雜種細(xì)胞,植物體細(xì)胞雜交的結(jié)果是得到雜種植株。()判斷正誤，正確的畫(huà)“ ，錯(cuò)誤的畫(huà)“ 。6.單克隆抗體制備過(guò)程中的兩次篩選目的相同。()提示:單克隆抗體的制備過(guò)程中,兩次篩選的目的不同,一次是用選擇培養(yǎng)基篩選出雜交瘤細(xì)胞;另一次是用專一性抗體檢測(cè)方法篩選出能產(chǎn)生特異性

9、抗體的雜交瘤細(xì)胞。7.克隆動(dòng)物都只具備一個(gè)親本的遺傳特性。()提示:克隆動(dòng)物應(yīng)用的是動(dòng)物細(xì)胞核移植技術(shù),具有兩個(gè)親本的遺傳物質(zhì)(供體提供核基因,受體提供細(xì)胞質(zhì)基因)。8.體細(xì)胞核移植過(guò)程中通常采用M期的去核卵母細(xì)胞作為受體細(xì)胞。()動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)與植物組織培養(yǎng)的比較1 | 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)項(xiàng)目動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)理論基礎(chǔ)細(xì)胞增殖植物細(xì)胞的全能性前處理無(wú)菌;用胰蛋白酶、膠原蛋白酶等處理,使組織分散成單個(gè)細(xì)胞無(wú)菌、離體取材動(dòng)物胚胎或出生不久的幼齡動(dòng)物的器官或組織植物幼嫩的部位或花藥等培養(yǎng)基性質(zhì)液體固體培養(yǎng)基成分糖類、氨基酸、無(wú)機(jī)鹽、維生素和動(dòng)物血清等水、礦質(zhì)元素、蔗糖、維生素、植物激素和瓊脂等結(jié)果細(xì)

10、胞培養(yǎng)產(chǎn)生大量細(xì)胞,不形成新個(gè)體可產(chǎn)生新個(gè)體應(yīng)用人造皮膚的構(gòu)建、動(dòng)物分泌蛋白的規(guī)模化生產(chǎn)快速繁殖、脫毒苗的培育、細(xì)胞產(chǎn)物的工廠化生產(chǎn)和單倍體育種等相同點(diǎn)都需人工條件下的無(wú)菌操作;都需要適宜的溫度、pH等條件;都進(jìn)行有絲分裂,都不涉及減數(shù)分裂續(xù)表 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中兩次使用胰蛋白酶的作用不同:第一次用胰蛋白酶處理新鮮取材的動(dòng)物組織,使之分散成單個(gè)細(xì)胞;第二次使貼壁細(xì)胞從瓶壁上脫落下來(lái),使之分散成單個(gè)細(xì)胞。犬細(xì)小病毒單克隆抗體是將犬細(xì)小病毒免疫的BALB/c小鼠脾細(xì)胞與SP2/0瘤細(xì)胞融合,制備出能分泌抗犬細(xì)小病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,從中培養(yǎng)、篩選出特異性的雜交瘤細(xì)胞,接種到BALB/c小鼠腹腔

11、內(nèi),從小鼠腹水中提取治療和預(yù)防犬細(xì)小病毒的單克隆抗體制劑。該制劑可迅速到達(dá)病毒侵染的組織和細(xì)胞殺滅病毒,到達(dá)快速治愈的目的,是目前世界上用于治療和預(yù)防犬細(xì)小病毒效果最好的生物制劑。2 | 單克隆抗體的制備問(wèn)題1.文中得到的雜交瘤細(xì)胞的特點(diǎn)是什么?提示:不僅具有分泌抗體的能力,還具有無(wú)限增殖的能力。2.制備單克隆抗體過(guò)程中的幾種細(xì)胞有何特點(diǎn)?提示:免疫的B淋巴細(xì)胞:能產(chǎn)生單一抗體,但不能無(wú)限增殖。骨髓瘤細(xì)胞:能無(wú)限增殖,但不能產(chǎn)生抗體。雜交瘤細(xì)胞:既能產(chǎn)生特定的抗體,又能在培養(yǎng)過(guò)程中進(jìn)行無(wú)限增殖。3.假設(shè)不采用動(dòng)物細(xì)胞融合的方法,能否生產(chǎn)出單克隆抗體?試簡(jiǎn)要說(shuō)明。提示:能?？蓮慕?jīng)免疫的B淋巴細(xì)胞

12、中獲取決定所需抗體的基因,導(dǎo)入骨髓瘤細(xì)胞,然后培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞并從培養(yǎng)液中提取分泌物,便可得到單克隆抗體。項(xiàng)目步驟技術(shù)方法原理取材從已免疫的小鼠的脾中獲取能產(chǎn)生特定抗體的B淋巴細(xì)胞、體外培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞增殖融合通過(guò)滅活的病毒等誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合動(dòng)物細(xì)胞融合細(xì)胞膜的流動(dòng)性單克隆抗體制備過(guò)程的要點(diǎn)分析篩選第一次要從融合形成的雜交細(xì)胞中篩選出雜交瘤細(xì)胞選擇培養(yǎng)基第二次要從雜交瘤細(xì)胞中篩選出能產(chǎn)生所需抗體的雜交瘤細(xì)胞專一性抗體檢測(cè)、克隆化培養(yǎng)免疫學(xué)原理(抗原抗體特異性結(jié)合)培養(yǎng)在小鼠腹腔內(nèi)進(jìn)行體內(nèi)培養(yǎng),或在裝有細(xì)胞培養(yǎng)液的培養(yǎng)基中進(jìn)行體外培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞增殖(1)作為診斷試

13、劑,不但診斷準(zhǔn)確,而且能大大縮短診斷時(shí)間;(2)可用于治療疾病,還可以運(yùn)載藥物。雜交瘤細(xì)胞的特點(diǎn):既能大量增殖,又能產(chǎn)生特定的抗體。單克隆抗體的特點(diǎn):特異性強(qiáng)、靈敏度高、可大量制備。單克隆抗體的應(yīng)用(1)通過(guò)過(guò)程得到的B淋巴細(xì)胞從小鼠體內(nèi)別離出來(lái)之前,需向小鼠體內(nèi)反復(fù)。(2)過(guò)程誘導(dǎo)融合運(yùn)用了原理,該過(guò)程區(qū)別于植物原生質(zhì)體融合的方法是用處理,細(xì)胞融合完成的標(biāo)志是。利用B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞制備單克隆抗體的流程如圖。請(qǐng)據(jù)圖答復(fù)以下問(wèn)題:(3)過(guò)程至少需要通過(guò)2次篩選和克隆化培養(yǎng),其中第一次篩選的目的是獲得。圖中X細(xì)胞具有的特點(diǎn)。(4)從圖中可以看出,單克隆抗體的制備過(guò)程運(yùn)用了等動(dòng)物細(xì)胞工程技術(shù)。答案(1)注射特定抗原(2)細(xì)胞膜的流動(dòng)性滅活的病毒融合成一個(gè)核(3)雜交瘤細(xì)胞既能產(chǎn)生特異性抗體,又能無(wú)限增殖(4)動(dòng)物細(xì)胞融合、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)解析(1)通過(guò)過(guò)程得到的B淋巴細(xì)胞從小鼠體內(nèi)別離出來(lái)之前,需對(duì)小鼠注射相應(yīng)抗原,目的是獲取能產(chǎn)生特定抗體的B淋巴細(xì)胞。(2)過(guò)程將小鼠的B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合形成雜交瘤細(xì)胞,運(yùn)用的原理是細(xì)胞膜具有一定的流動(dòng)性。植物原生質(zhì)體融合的方法有物理法和化學(xué)法,動(dòng)物細(xì)胞融合方法除了物理法和化學(xué)法外,還可以用滅活的病毒誘導(dǎo)。細(xì)