1、目的基因的獲取/制備合成cDNA文庫基因組文庫聚合酶鏈式反應1. 基因文庫2. cDNA文庫3.合成4. PCR1基因組文庫(genomic library)2分離基因組DNADNA片段與載體連接導入細胞篩選限制性內(nèi)切酶基因組DNA基因重組轉化細菌體外包裝3 以 l 噬菌體制作基因 組文庫 , 在一個基因組文庫面 ， 所有可能的 基因皆被大量復制 。 利用探針篩選特定基因 。4組織或細胞染色體DNA基因片斷克隆載體重組DNA分子含重組分子的轉化菌限制性內(nèi)切酶受體菌基因組文庫 存在于轉化細胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA片段的集合.從基因組文庫獲取目的基因 每個細胞含有一個基因組DNA片段

2、與載體的重組DNA分子，許多細胞組成一個含有基因組各DNA片段克隆的集合體.genomic library5 基因庫是通過重組技術轉化篩選而建立，利用低等生物如細菌、病毒、噬菌體等生長快、繁殖能力強的特點作為一種核酸擴增的載體，把人類等高等生物的基因或其片段重組其中，成為便于保存、取用方便的基因庫。建立基因庫的目的是為了便于目的基因的保存、擴增和純化。6基因組文庫的質量評價和完備性 基因組文庫必須包括一定數(shù)量的重組子才可能克隆基因組中的任何序列?；蚪M文庫完備性是指從基因組文庫中篩選出含有某一目的基因的重組克隆的概率。 如果滿足兩個條件：生物體染色體DNA片段被全部克隆，用于構建基因文庫的DN

3、A片段含有完整的基因，則此基因文庫的完備性就是1。 用基因組文庫的克隆數(shù)表示基因組文庫的大小即庫容量。71.理論值基因組文庫的克隆數(shù)目（N）基因組DNA總長DNA插入片段的平均長度 某種生物基因組DNA總長度為3106 kb，酶切后的DNA片段平均長度為15 kb，則基因組文庫的克隆數(shù)應為 3106 kb/15 kb= 2105個克隆。 在實際工作中，由于在基因組文庫的構建過程中存在多步操作，一個具備完好代表性的基因組文庫的庫容量大大超過這個理論值。82.經(jīng)驗值 ln(1f/g)N =ln(1P)P為從文庫中選出任一基因或DNA序列的概率即完備性， 一般 設為99（0.99）；f為載體容量（k

4、b）；g為基因組大小（kb）；N為基因組文庫的克隆總數(shù)，表示文庫中以P概率出現(xiàn)某段DNA,理論上應具有的最少克隆數(shù)；9人單倍體DNA總長為3109bp 若載體裝載量為15kb則構建完備性為 0.9 的基因組文庫大約需要 個重組克隆.完備性0.990.9990.999946萬庫容量92萬138萬184萬 ?10表 幾種典型生物基因組文庫大小與載體容量的關系種類基因組（bp）10kb（質粒）25kb（噬菌體）45kb（粘粒）理論值經(jīng)驗值理論值經(jīng)驗值理論值經(jīng)驗值大腸桿菌4.61064602116184845102468釀酒酵母1.81071800828772033134001840水稻5.71085

5、7000262492228001049961266758330人3.21093200001280005894597111132747611選擇載體的主要參數(shù)是基因組大小構建大腸桿菌（4.6106bp）等基因組較小生物的基因組文庫時，按每個DNA片段平均長5kb計算，一個包括5000個DNA片段克隆的基因文庫就能夠代表一個完整的大腸桿菌基因組序列，采用質粒作為載體便可得到滿意的結果。構建較大基因組的文庫時，噬菌體、粘粒及YAC常選作克隆載體?；蚪M文庫分為：質粒文庫、噬菌體文庫、粘粒文庫、人工染色體文庫（細菌人工染色體文庫、酵母人工染色體文庫等）。 12可獲得的基因HGP對比分析內(nèi)含子、外顯子及

6、調控區(qū)域基因原始結構功能的研究應用范圍該種生物所有基因13cDNA文庫(cDNA library)14逆轉錄mRNADNA以單鏈RNA為模板合成雙鏈DNA的反應。15逆轉錄病毒細胞內(nèi)的逆轉錄現(xiàn)象： RNA 模板逆轉錄酶DNA-RNA 雜化雙鏈RNA酶單鏈DNA雙鏈DNA 逆轉錄現(xiàn)象說明：至少在某些生物，RNA同樣具有遺傳物質的傳代與表達功能。16逆轉錄酶的應用:應用于基因工程基因mRNA蛋白質多肽鏈17尿素-氯化鋰法硫氰酸胍法polyT親和層析法密度梯度離心分級法探針篩選法mRNA的提取與純化18polyT親和層析法AAAAAAAAAAAApolyTpolyTpolyT19基因重組反轉錄酶mR

7、NAcDNA cDNA文庫的組建1.mRNA提取 2.cDNA合成 cDNA第一鏈的合成 cDNA第二鏈的合成3.雙鏈cDNA的分子克隆4.雙鏈cDNA克隆進質粒或噬菌體載體并導入宿主中繁殖.20mRNA分離純化反轉錄合成cDNA構建cDNA文庫篩選目的基因21反轉錄合成單鏈cDNA 22置換合成法合成cDNA第二鏈 23引物-銜接頭法合成cDNA第二鏈 24 包含著細胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合稱該組織細胞的cDNA文庫. 基因組基因在特定的組織細胞中只有一部分表達，且在不同條件、不同分化時期的細胞其基因表達的種類和強度也不盡相同，cDNA文庫具有組織細胞特異性。25cDNA文庫的質

8、量評價 高豐度mRNA的cDNA 克隆所占的比例高，分離容易，低豐度mRNA的cDNA克隆所占的比例低，分離困難。 mRNA根據(jù)其在細胞中的拷貝數(shù)即豐度低豐度：拷貝數(shù)在1至15間中等豐度：拷貝數(shù)在100至1000間高豐度：拷貝數(shù)在1,000至10,000間261.文庫的代表性 cDNA文庫代表性指文庫中包含的重組cDNA分子反映來源細胞中表達信息(即mRNA種類)的完整性，可用庫容量來衡量，指構建的原始cDNA文庫中所包含的重組子克隆數(shù)，庫容量取決于細胞中表達出的mRNA種類和每種mRNA序列的拷貝數(shù)。cDNA文庫庫容量理論估算：細胞總mRNA分子數(shù)/細胞中某種mRNA的拷貝數(shù)。 某細胞的mR

9、NA分子數(shù)為500 000，某個豐度為3500拷貝/細胞的mRNA基因，最小值為500 000/3500=143，豐度為14拷貝/細胞的mRNA基因，最小值為500 000/14=35 71427經(jīng)驗值計算 構建一個完整的cDNA文庫，不論mRNA豐度高低，都要包含任一種mRNA的cDNA克隆，最低要求的cDNA文庫的庫容量公式：N=ln（1-P）/ln（1-n/T）n為細胞中某種（常指最稀少）mRNA的拷貝數(shù)；T為細胞中表達出的所有mRNA的總拷貝數(shù)。P為文庫中任何一種mRNA序列信息的概率，通常設為99；N為文庫中以P概率出現(xiàn)在細胞中任何一種mRNA序列理論上應具有的最少克隆數(shù)；282.序

10、列的完整性 除代表性外，文庫中基因或cDNA片段的序列完整性（所含基因是否完整、是否是全長）也是反映文庫質量的一個重要因素。在細胞中表達出的各種mRNA盡管具體序列不同，但基本上都是由3部分組成，即5端非翻譯區(qū)，中間的編碼區(qū)和3端非翻譯區(qū)。非翻譯區(qū)的序列特征對基因的表達具有重要的調控作用，編碼序列則是合成基因產(chǎn)物蛋白質模板。要求文庫中的重組cDNA片段足夠長以便盡可能地反應出天然基因的結構。 29cDNA文庫的改良 301.均一化cDNA文庫 cDNA文庫的均一化，是指某一特定組織或細胞的所有表達基因均包含其中，且在cDNA文庫中表達基因對應的cDNA的拷貝數(shù)相等或接近。均一化cDNA文庫是克

11、服基因轉錄水平上巨大差異給文庫篩選和分析帶來障礙的有效措施，有利于研究基因的表達和序列分析。 31基因組DNA飽和雜交法 mRNA水平上，基因之間豐度差異極大； 基因組水平上，基因之間拷貝數(shù)差異不大，即基因在基因組上具有拷貝數(shù)相對一致的性質。通過cDNA與基因組DNA飽和雜交降低高豐度mRNA在文庫中高拷貝存在的cDNA的豐度。將隨機打斷的基因組總DNA片段標記為探針，與總cDNA單鏈飽和雜交，棄除未雜交的總cDNA，從cDNA-DNA雜交體上變性釋放已均一化后的總cDNA，轉化宿主。 322.二級復性動力學處理 二級復性動力學是指高豐度的cDNA在退火條件下復性速度快，而低豐度的cDNA復性

12、要很長時間，可以通過控制復性時間來降低豐度。用羥基磷灰石柱將單鏈和雙鏈cDNA分開，保留單鏈cDNA后轉化宿主。33全長cDNA文庫 mRNA發(fā)生降解，第二鏈合成中DNA聚合酶的外切核酶活性、反轉錄酶特性的RNase H活性變化，反轉錄酶與mRNA模板的脫離(主要受mRNA復雜結構影響)等都可能會導致cDNA不完整。保持mRNA的完整性是構建全長cDNA文庫的核心。mRNA完整性的確定可通過直接檢測mRNA分子的大小，或測定mRNA的轉譯能力。 34目的cDNA克隆的篩選和鑒定 從cDNA文庫中篩選和鑒定目的cDNA的方法主要有核酸分子雜交和免疫學檢測分析等方法。差別雜交（differenti

13、al hybridization）又叫差別篩選（differential screening），適用于分離在特定組織細胞或發(fā)育階段表達的、受生長因子調節(jié)的或藥物誘導表達的基因。35 36cDNA文庫與基因組文庫的比較 （1）基因組文庫克隆的是所有基因，包括未知功能的DNA序列和調控基因等，cDNA文庫克隆的是所有表達的基因，即具有蛋白質產(chǎn)物的結構基因，包括調節(jié)基因。（2）基因組文庫克隆的是全部遺傳信息，不受時空影響；cDNA文庫克隆的是不完全的編碼DNA序列，受發(fā)育和調控因子的影響。（3）基因組文庫中編碼的基因是真實的基因，是帶有內(nèi)含子和外顯子的基因組基因；從cDNA文庫中獲得的是經(jīng)過剪切去除

14、內(nèi)含子的基因。37可獲得的基因對比研究異?；蛏镞M化與同源性分析基因表達基因的結構功能調節(jié)研究所有正在表達的基因應用范圍3839扣除文庫（subtracted library） 反應不同組織細胞或同一組織細胞不同功能狀態(tài)下，基因表達差異的cDNA文庫。40差示文庫（differential library）差異顯示反轉錄聚合酶鏈式反應（differential display of reverse transcriptional PCR，DDRT-PCR） （1）PCR擴增：所有的mRNA（2）測序凝膠電泳：對比發(fā)現(xiàn) cDNA的差異mRNA差異顯示法41可獲得的基因：不同組織細胞或同一織細胞

15、不 同功能狀態(tài)下表達差異的基因 。腫瘤等病因的分子機理細胞對外因的反應研究細胞增殖分化機理應用42Intron and Exon in Eukaryotic CellsmRNADNA53cappoly Atailexonexonexonintronintronmature mRNAProcessingTranscriptionSplicingpromotor35Take place in nucleusstart codonstop codonTo cytoplasmIntron deleted43cDNA Is Reverse Transcribed from mRNAmature mRNApoly A tail53TTTTReverse transcriptionCCC35353GGGDNA polymeraseRNA hydrolysis