1、一種檢測(cè)電芬頓體系下DNA損傷的電化學(xué)生物傳感器的研制摘 要：為了檢測(cè)電芬頓體系下DNA的損傷，先采用石墨烯制備了一種致密的rGO/ Fe3O4復(fù)合材料；再將復(fù)合材料和DNA修飾到玻碳電極上，利用電化學(xué)還原作用釋 放游離態(tài)Fe2+，并加入H$O$形成電芬頓體系；最后構(gòu)建了一種檢測(cè)電芬頓體系下 DNA損傷的新型電化學(xué)生物傳感器。檢測(cè)結(jié)果表明，檢測(cè)DNA損傷的最佳時(shí)間為 30 min，最佳pH值為7.0。關(guān)鍵詞：電芬頓體系；DNA損傷；rGO/Fe!。復(fù)合材料；電化學(xué)生物傳感器Construction of an Electrochemical Biosensor for Detecting DN

2、ADamage in t6e ElectroFenton Syste4In order to detect the DNA damage in the electrofentonsystem, compact rGO/ Fe3。 composite material was prepared with graphene at first.Then the composite material and DNA were modified onto glassy carbon electrode, and the free state Fe2m was released by electroche

3、mical reduction, and H$O$ was added to form an ElectroFenton system. Finally ,a novel electrochemical biosensor was constructed to detect DNA damage in the ElectroFentonsystem.The experimental results showed that the optimal detecting time of DNA damage was 30 min, and the optimal pH value was 7.0.k

4、ey words： ElectroFenton system; DNAdamage; rGO/F。！。 composite material; electrochemical biosensor0引言脫氧核糖核酸(dna)是一種重要的生物分 子，含有遺傳信息。環(huán)境中的一些物理和化學(xué)因 素，如電離輻射、生物毒素、代謝產(chǎn)物等，產(chǎn)生的活 性氧(reactive oxygen species, ROS)會(huì)使 DNA 發(fā) 生氧化損傷n，使DNA結(jié)構(gòu)異變,其中活性氧族 主要包括過氧化氫、羥基自由基和超氧陰離子等。 研究表明，過氧化氫與亞鐵離子構(gòu)成的氧化體系 被稱作芬頓體系，芬頓體系下產(chǎn)生的羥基自由 基作為

5、一種常見的ROS，會(huì)引發(fā)人體DNA的損 傷，導(dǎo)致基因組拼接不穩(wěn)定,引發(fā)與癌癥和衰老等 相關(guān)的多種生物學(xué)疾病?？v觀傳統(tǒng)的DNA損傷 的檢測(cè)方法，如熒光法、毛細(xì)管區(qū)帶電泳法、氣相 色譜/質(zhì)譜聯(lián)用法、3$P后標(biāo)記法、凝膠電泳法、免 疫分析法等方法,盡管它們能有效地對(duì)DNA的損 傷進(jìn)行定性或定量，但是通常比較費(fèi)時(shí)、耗力且設(shè) 備昂貴，局限性也很明顯。因此，有必要研制一種 新型的DNA損傷檢測(cè)手段。本文擬利用石墨烯制備rGO/Fe!。復(fù)合材 料;再將復(fù)合材料和DNA修飾到玻碳電極上，利 用電化學(xué)還原作用釋放游離態(tài)Fe2+，并加入H$O$ 形成電芬頓體系；研制一種檢測(cè)電芬頓體系下 DNA損傷的新型電化學(xué)生物

6、傳感器，最后探明檢 測(cè)DNA損傷的最佳時(shí)間和pH值。1材料與方法1-1試劑配制與保存小牛胸腺雙鏈DNA保存于-20 冰箱中。 小牛胸腺DNA儲(chǔ)存液(c = 10 mg/mL)采用pH = 7.4的0.05 mol/L Tris-HCl溶液配制，保存于4 冰箱中。聚二烯丙基二甲基氯化銨(poly dimethyl diallyl ammonium chloride，PDDA)于室溫 下保存。使用0. 1 mol/L磷酸緩沖液(phosphate- buffer saline，PBS)溶解等物質(zhì)的量的鐵氰化鉀和 亞鐵氰化鉀制備成電化學(xué)的氧化還原標(biāo)簽溶液 (:Fe( CN) 63-/4-，c = 5

7、.0 mmol/L)，于 4 下避 光儲(chǔ)存。使用0.1 mol/L PBS溶解計(jì)算量的三氯 化六氨合釘制備c = 50 mol/L的Ru( NH3) 6,溶 液，于4 下避光儲(chǔ)存。1.2復(fù)合材料rGO/Fe!。的合成采用改進(jìn)的Hummers方法制備氧化石墨 烯，獲得石墨烯材料。然后稱取0. 100 g氧化石 墨烯于去離子水中超聲，得到穩(wěn)定的分散懸浮液。 同時(shí)，取0.566 g的FeCl$ - 4H$O加入到上述分 散液中，并添加5 mL的0. 1 mol/L NaOH。室溫 攪拌2 h后轉(zhuǎn)移至反應(yīng)釜中，180 下反應(yīng)8 h,黑 色沉淀經(jīng)過濾、洗滌后,60 下真空干燥12 h,得 到 rGO/F

8、e3O4 1.3電化學(xué)生物傳感器的制備工作電極的預(yù)處理加：在濕潤(rùn)的麂皮上先后 用0. 05 m和0.5 m的氧化鋁將玻碳工作電極 拋光打磨至平滑,然后依次用去離子水、無水乙醇 和去離子水超聲10 min,最后用氮?dú)獯蹈伞ｋ娀瘜W(xué)生物傳感器的制備:首先取一定量的 rGO/Fe3O4超聲分散在PDDA溶液中，用移液槍 吸取8 L新配制的PDDA-GO/Fe3O4溶液，滴加 在預(yù)處理后的玻碳工作電極表面后，在室溫下自 然晾干;然后使用移液槍吸取8 L DNA溶液滴 加在玻碳工作電極上，在室溫下自然晾干后，使用 去離子水徹底清洗玻碳電極;最后將修飾的玻碳 電極連接直流電源的負(fù)極,將鉑絲電極連接直流 電源

9、的正極，電源兩極置于含5. 0 mmol/L H2O2 的PBS溶液中，設(shè)置電源兩極之間的電位差為 1.5 V,電流為0.1 A,持續(xù)反應(yīng)一定時(shí)間后，將電 極取出，用去離子水清洗(如圖1所示)。圖1電化學(xué)生物傳感器的制備圖Fig.l Preparation diagram of electrochemicalbiosensorDNA損傷的檢測(cè)方法使用上海辰華儀器有限公司的電化學(xué)工作站 (CHI660E型)，三電極體系以修飾的玻碳電極為 工作電極，鉑絲電極為對(duì)電極，銀氯化銀電極為 參比電極。采用循環(huán)伏安(cyclicvoltammetry, CV) 法和差分脈沖伏安(differential p

10、ulse voltammetry, DPV)法，在含 50 mol/L Ru( NH!) 63+ 的 0. 1 mol/L 的PBS溶液中檢測(cè)DNA損傷后嘌吟堿基的氧化 信號(hào)，從而確定DNA的受損程度。差分脈沖伏安 試驗(yàn)參數(shù)設(shè)置為脈沖寬度：0. 06 s,脈沖振幅： 0. 05 V,掃描電壓范圍:0. 5 V到1. 1 V。循環(huán)伏 安試驗(yàn)參數(shù)設(shè)置為，掃描速率:0. 1 V/s，掃描電壓 范圍:-0. 5 V到 0.4 V。DNA損傷檢測(cè)的最佳條件通過檢測(cè) 0 min、10 min20 min30 min 和 40 min時(shí)各試驗(yàn)組DNA的腺嘌吟氧化信號(hào),得到最 佳的檢測(cè)時(shí)間。在pH為4、5、5

11、. 5、6、7、8和10的 條件下，通過檢測(cè)DNA的腺嘌吟氧化信號(hào)，得到 最佳的檢測(cè)pH值。2結(jié)果與討論2.1 GO和rGO/Fe3O4復(fù)合材料的SEM表征采用場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡對(duì)合成的GO與 rGO/Fe!。復(fù)合材料的表面形貌進(jìn)行表征。如圖 2中(a)、( b)為GO的掃描電鏡圖，放大倍數(shù)分別 為 200 和 2 000,( c)、( d)為 rGO/Fe!。的掃描電 鏡圖,放大倍數(shù)分別為6 000和30 000。由圖2( a) 所示,合成的GO為片狀且片徑不均一的二維空 間結(jié)構(gòu)，說明石墨經(jīng)過化學(xué)反應(yīng)后，成功剝離出單 層薄片結(jié)構(gòu)，這與L.Shahriary等人的研究結(jié)果一 致10,從圖2(

12、 b)看出，GO表面粗糙且附帶大量 褶皺,失去了石墨表面原有的金屬光澤。由圖2 中(c)、( d)所示，rGO/Fe!。復(fù)合材料為球形粒 子,粒子直徑約為385 nm,且粒子之間沒有間隙。(c)放大倍數(shù)6 000(d)放大倍數(shù)30 000圖2 GO與rGO/Fe3O4的掃描電鏡圖Fig.2 The SEM images of prepared GO and rGO/Fe3OR2.2電化學(xué)傳感器的CV表征采用CV法監(jiān)測(cè)電化學(xué)生物傳感器制備過程 中的電化學(xué)信號(hào)變化。設(shè)置掃描電壓范圍為- 0.2 V到0. 7 V,根據(jù)不同掃描速率下的CV信號(hào) 的電流強(qiáng)度值，計(jì)算傳感器的有效活性表面積。如圖 3 所示

13、，在 5. 0 mmol/L Fe( CN) 6】3-/4- 中得到不同修飾電極的伏安特性曲線，符合經(jīng)典 鐵氰化鉀電化學(xué)標(biāo)簽的電化學(xué)特征其中， 曲線1代表裸GCE,曲線2代表PDDA-rGO/ Fe3O4-GCE,曲線 3 代表 DNA-PDDA-rGO/Fe!。- GCE。裸電極在225 mV和309 mV處得到一對(duì)良 好的可逆氧化還原峰。陰極和陽極的電位差 (為84 mV。電極上修飾了復(fù)合材料后，電 位差(AEp)變?yōu)?7 mV,峰值電流強(qiáng)度J = 199. 9 A)較裸電極的電流強(qiáng)度(J = 166. 5 A)也有所 增加，表明了復(fù)合材料rGO/Fe!。加速了玻碳電 極與氧化還原標(biāo)簽之間

14、的電子轉(zhuǎn)移速率。當(dāng)電極 表面修飾了 DNA后，陰極與陽極的電位差)Ep 增長(zhǎng)至221 mV,這是因?yàn)镈NA的磷酸骨架結(jié)構(gòu) 呈負(fù)電性，氧化還原標(biāo)簽的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)受到限制， 降低了氧化還原反應(yīng)的可逆性皿。-100-150E/V(vs.Ag/AgCl)1-100-150E/V(vs.Ag/AgCl)1裸 GCE； 2PDDA-rGO/Fe3O4_GCE；3DNA-PDDA-rGO/ Fe3 O4 -GCE圖3不同修飾電極上的CV曲線圖Fig.3 Typical CV curves of different electrodes根據(jù)擴(kuò)散控制原理假設(shè)所得的Randles- Sevcik方程，如式(1)所示

15、,計(jì)算修飾電極的有效 活性表面積：15-17:Ip = 2.69 x 105AD1 2/鏟2c( 1)式中：Ip指電流強(qiáng)度(A) ,$指電子轉(zhuǎn)移數(shù)目,A指 rGO/Fe,。復(fù)合材料修飾電極的有效活性表面積 (cm2) ,D 指擴(kuò)散常數(shù)(6.700.02x10A6cm2/s) 指掃描速率(V/s) ,c指:Fe( CN的濃度 (mol/mL) #設(shè)置掃速為 0. 01, 0. 03, 0. 05, 0. 08, 0. 1, 0. 15,0.2,0.25,0. 3 V/s，獲得不同掃速下的CV 曲線，如圖4所示。根據(jù)循環(huán)伏安曲線的電流強(qiáng) 度獲得Ip與)1/2的線性相關(guān)圖(如圖5所示)，將 曲線的斜

16、率帶入式(1),從式(1)可以得出復(fù)合材 料修飾電極的有效工作面積為0. 143 cm2。E7V(vs.Ag/AgCl)圖 4 PDDA-rGO/Fe3O4-GC 電極在不同掃速下的CV曲線圖Fig.4 CV curves of PDDA-rGO /Fe3 O4-GCelectrode under different scan ratesFig.5 The calibration plot for the peak currents vs. the square root of scan rate2.3 DNA損傷的檢測(cè)結(jié)果如圖6為Ru( NH3) 63+標(biāo)簽下的CV曲線。 圖6中結(jié)果顯示，-

17、0.2 V附近出現(xiàn)信號(hào)峰，屬于 Ru( NH3) 63+標(biāo)簽的特征峰，與R-Imani等人的研 究結(jié)果一致18,本研究中-0.212 V和-0. 145 V 處得到的兩個(gè)信號(hào)峰分別對(duì)應(yīng)Ru( NH3) 62+/3+的 氧化和還原反應(yīng)。其中，曲線1代表DNAYDDA- rGO/Fe3O4-GCE的CV曲線，曲線2至曲線5分 別為反應(yīng) 10 min20 min30 min40 min 后的 CV 曲線。DNA發(fā)生損傷后，還原峰強(qiáng)度逐漸增加， 因?yàn)镈NA損傷后暴露出的嘌吟堿基參與電化學(xué) 氧化還原反應(yīng)，促進(jìn)了 Ru( NH3) 63+的還原，使還原峰強(qiáng)度增加。損傷過程描述為如下反應(yīng)方 程式：, 0H

18、TOC o 1-5 h z DNADNA( adenine+guanine)( 1)Ru( NH3) #+DNA( adenine+guanine) #Ru( NH3) #+ +DNA( adenine+ +guanine+)( 2)1一0 min; 2一10 min; 3一20 min; 4一30 min; 5一40 min。圖6不同反應(yīng)時(shí)間后電極的CV曲線Fig.6 CV curves of electrode after differentreaction time0.50.60.70.80.91.01.1E7V(vs.Ag/AgCl)采用差分脈沖伏安法可以檢測(cè)嘌吟的氧化峰 信號(hào)邸，如圖

19、7所示,0. 65 V處出現(xiàn)微弱的鳥嘌 吟氧化峰,0.92 V處出現(xiàn)腺嘌吟氧化峰。其中， 曲線 1 代表 DNA-PDDA-rGO/Fe3O4-GCE 的 DPV 曲線,曲線2至曲線5分別為反應(yīng)10 min20 min、 30 min40 min后的DPV曲線。隨著DNA損傷程 度的增加，暴露的嘌吟堿基量增加，嘌吟的氧化信 號(hào)強(qiáng)度也隨之增加。0.50.60.70.80.91.01.1E7V(vs.Ag/AgCl)2.4 DNA損傷檢測(cè)的最佳條件2.4.1檢測(cè)DNA損傷的最佳時(shí)間如圖8所示，腺嘌吟的氧化峰電流強(qiáng)度隨反 應(yīng)時(shí)間的增加而增加,30 min后，曲線基本持平， 說明腺嘌吟堿基幾乎完全暴露,dna雙鏈全部斷 裂