第七章微生物的生長繁殖掌握研究微生物生長的方法及生長曲線在廢水微生物處理中的應用；一、微生物生長繁殖的概念二、微生物的分離和純種培養(yǎng)三、研究微生物生長的方法四、細菌生長曲線在污（廢）水微生物處理中的應用五、微生物生長量的測定方法微生物的生長繁殖的概念

微生物生長是細胞物質有規(guī)律地、不可逆增加，導致細胞體積擴大的生物學過程，這是個體生長的定義。繁殖是微生物生長到一定階段，由于細胞結構的復制與重建并通過特定方式產生新的生命個體，即引起生命個體數(shù)量增加的生物學過程。在一定時間和條件下細胞數(shù)量的增加，這是微生物群體生長的定義。世代時間：細菌兩次細胞分裂之間的時間。第一節(jié)微生物的分離和純培養(yǎng)用固體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)

不同微生物在特定培養(yǎng)基上生長形成的菌落或菌苔一般都具有穩(wěn)定的特征，可以成為對該微生物進行分類、鑒定的重要依據(jù)。大多數(shù)細菌、酵母菌，以及許多真菌和單細胞藻類能在固體培養(yǎng)基上形成孤立的菌落，采用適宜的平板分離法很容易得到純培養(yǎng)。所謂平板，是指熔化的固體培養(yǎng)基倒入無菌平皿中，冷卻凝固后，成為盛有固體培養(yǎng)基的平皿。固體培養(yǎng)方法可將單個微生物分離和固定在固體培養(yǎng)基表面或里面。二、純培養(yǎng)的分離方法純培養(yǎng)分離的目的：得到純培養(yǎng)物，是研究和利用微生物的第一步。最常用的分離、培養(yǎng)微生物的固體培養(yǎng)基是瓊脂固體培養(yǎng)基平板。Koch建立的平板分離微生物純培養(yǎng)的技術簡便易行，100多年來一直是各種菌種分離的最常用手段。稀釋倒平板法(pourplatemethod) 涂布平板法(spreadplatemethod) 平板劃線分離法(streakplatemethod)選擇培養(yǎng)基分離法單細胞挑取法待分離的材料用無菌水作一系列的稀釋，取不同稀釋液少許，與已熔化并冷卻至45℃左右的瓊脂培養(yǎng)基混合，搖勻后，傾入滅過菌的培養(yǎng)皿中，待瓊脂凝固后，制成可能含菌的瓊脂平板，保溫培養(yǎng)一定時間，可能出現(xiàn)在平板表面或瓊脂培養(yǎng)基中的單個菌落，這個菌落可能就是由一個細菌細胞繁殖形成的。隨后挑取該單個菌落，或重復以上操作數(shù)次，便可得到純培養(yǎng)?！猛緩V泛的分析方法稀釋倒平板法

在微生物學研究中更常用的純種分離方法是涂布平板法。其做法是先將已熔化的培養(yǎng)基倒人無菌平皿，制成無菌平板，冷卻凝固后，將一定量的某一稀釋度的樣品懸液滴加在平板表面，再用無菌玻璃涂棒將菌液均勻分散至整個平板表面，經培養(yǎng)后挑取單個菌落。

涂布平板法用接種環(huán)以無菌操作沾取少許待分離的材料，在無菌平板表面進行平行劃線、扇形劃線或其他形式的連續(xù)劃線，微生物細胞數(shù)量將隨著劃線次數(shù)的增加而減少，并逐步分散開來，如果劃線適宜的話，微生物能一一分散，經培養(yǎng)后，可在平板表面得到單菌落。

——方法簡單，多用于分離細菌平板劃線分離法MixedculturePureculturePureculture光滑型菌落粗糙型菌落粘液型菌落

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1ml9ml土豆培養(yǎng)基牛肉膏培養(yǎng)基高氏培養(yǎng)基該法是從待分離的材料中挑取一個細胞來培養(yǎng)，從而獲得純培養(yǎng)的方法。方法：將顯微鏡挑取器裝在顯微鏡上，將一滴待分離的菌液滴入載玻片上，用安裝在顯微鏡挑取器上的毛細吸管對準某個單獨的細胞挑取，在接種到培養(yǎng)基上，得到純培養(yǎng)?！窒抻诟叨葘I(yè)化的科學研究單細胞挑取法

二、細菌的生長曲線growthcurve活菌數(shù)的對數(shù)培養(yǎng)時間遲緩期衰亡期穩(wěn)定期（靜止期）對數(shù)期（指數(shù)期）細菌的生長繁殖周期細菌的生長繁殖可分為4個時期：１．停滯期（遲滯期或適應期）：２．對數(shù)期（指數(shù)期）：３．靜止期：

４．衰亡期：縮短延滯期的方法：接種對數(shù)生長期的菌種，采用最適菌齡加大接種量用與培養(yǎng)菌種相同組成分的培養(yǎng)基指數(shù)期(對數(shù)期)(exponentialphase)活菌數(shù)和總菌數(shù)接近；酶系活躍，代謝旺盛，對不良環(huán)境抵抗力強；生長速率最大，細菌數(shù)量以幾何級數(shù)速率增長（2n）；細胞的化學組成及形態(tài)，生理特性比較一致；該期的細菌生產中多被用做種子和科學試驗材料。指數(shù)期生長的數(shù)學模型繁殖代數(shù)n=3.322(lgx2-lgx1)生長速率常數(shù)R=3.322(lgx2-lgx1)/(t2-t1)代時G=(t2-t1)/3.322(lgx2-lgx1)x2x1t2t1培養(yǎng)時間Lg細胞數(shù)/ml穩(wěn)定期(靜止期)出現(xiàn)原因：營養(yǎng)的消耗；營養(yǎng)物比例失調；有害代謝產物積累；pH值等理化條件不適?；罹鷶?shù)保持相對穩(wěn)定，總菌數(shù)達最高水平；細菌代謝物積累達到最高峰；芽孢桿菌這時開始形成芽孢；這是發(fā)酵生產收獲時期。穩(wěn)定期的特點衰亡期(declinephase/deathphase)營養(yǎng)物質消耗殆盡，微生物開始利用自身貯存物質進行內源呼吸；細菌死亡數(shù)大于增殖數(shù)，活菌數(shù)明顯減少，群體衰落；細胞出現(xiàn)多形態(tài)、大小不等的畸形，變成衰退型；細胞死亡,出現(xiàn)自溶現(xiàn)象。

是在微生物的整個培養(yǎng)期間，通過一定的方式使微生物能以恒定的比生長速率生長并能持續(xù)生長下去的一種培養(yǎng)方法。三、連續(xù)培養(yǎng)(continouscultureofmicroorganisms)優(yōu)點：縮短發(fā)酵周期；便于自動控制；產物質量均一缺點：菌種易退化；易染雜菌1、恒濁連續(xù)培養(yǎng)：通過不斷調節(jié)流速使培養(yǎng)液中的細菌的濃度恒定,以濁度為控制指標——開用光電控制系統(tǒng)控制培養(yǎng)液流量來實現(xiàn)。2、恒化連續(xù)培養(yǎng)：維持進水中的營養(yǎng)成分恒定（其中對細菌生長有限制作用的成分要保持低濃度水平），以恒定流速進水，以相同流速流出代謝產物，使細菌處于最高生長速率。四、細菌生長曲線在污廢水微生物處理中的應用廢水活性污泥處理系統(tǒng)中的活性污泥微生物與細菌的生長規(guī)律極為相似，因此，細菌生長曲線被廣泛用于活性污泥法系統(tǒng)控制中。

在廢水生物處理設計時，按廢水的水質情況（主要是有機物濃度），可利用不同生長階段的微生物處理廢水。

常規(guī)活性污泥法利用生長下降階段的微生物，包括減速期、靜止期的微生物；原因：對數(shù)期微生物生長快，消耗的營養(yǎng)物多，出水殘留的有機物也高，難以滿足排放要求；且代謝旺盛期微生物難以形成菌膠團，沉淀性差。而靜止期微生物絮凝沉淀性能好，泥水分離效果好。細菌生長不同階段在污水處理中的應用高負荷活性污泥法利用生長上升階段（對數(shù)期）和生長下降階段（減速期）的微生物如AB法的應用，A級采用對數(shù)期提高降解速率，B級采用減速期保證處理水效果。用延時曝氣法處理低濃度的有機廢水時，利用衰亡期的微生物。

對低濃度、難降解的有機廢水處理，采用衰亡期滿足微生物對營養(yǎng)的低要求，延長生物反應時間達到較好的處理效果。直接測定法計數(shù)法：直接計數(shù)法和間接計數(shù)法稱重量法；菌體內重要組成測定法：含N量法：N×6.25=PrDNA/RNA法葉綠素法第三節(jié)微生物生長量的測定方法間接測定法—生理指標法

直接計數(shù)

這類方法是利用特定的細菌計數(shù)板或血細胞計數(shù)板，在顯微鏡下計算一定容積樣品中微生物的數(shù)量。此法的缺點不能區(qū)分死菌與活菌。

每毫升原液所含細菌數(shù)

＝每小格平均細菌數(shù)×（涂布面積÷視野面積）×l00×稀釋倍數(shù)（以樣品為0.01ml為例）計數(shù)法計數(shù)室各種型號的全自動血球計數(shù)儀

間接計數(shù)

此法又稱活菌計數(shù)法，其原理是每個活細菌在適宜的培養(yǎng)基和良好的生長條件下可以通過生長形成菌落。

每毫升原菌液活菌數(shù)＝

同一稀釋度三個以上重復平皿菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)×5（以樣品為0.2ml為例）此法的原理是根據(jù)每個細胞有一定的重量而設計的。它可以用于單細胞、多細胞以及絲狀體微生物生長的測定。微生物干重

DNA含量蛋白質總量

重量法干重法:測定單位體積培養(yǎng)物中細胞的干重，用來表示菌體的生長量。方法：取定容培養(yǎng)物，用離心或過濾將菌體分離洗凈、烘干、稱重，可求得單位體積菌液中的細胞干重。DNA含量測定法核酸DNA是微生物的重要遺傳物質，每個細菌的DNA含量相當恒定，平均為8.4×10-5ng。利用DNA與DABA-2HCl（3,5二氨基苯甲酸-鹽酸）能顯示特殊熒光反應的原理，測定一定體積培養(yǎng)物菌液的熒光反應強度，可求得菌液的DNA含量，據(jù)此計算出細菌的數(shù)量。蛋白質總量（含氮量測定法）原理：在蛋白質中，氮的含量比較穩(wěn)定。因此，測定菌體含氮量可反應菌體的量。測定方法為：分離菌體，用凱氏微量定氮法測定菌體中的總氮量。例如：細菌蛋白質總量＝細菌的含氮量÷（6.5%～13%）細胞總量＝蛋白質總量÷(50%～80%(或65%))≈蛋白質總量×1.54間接測定法—生理指標法

生理指標法：微生物的新陳代謝作用會消耗或產生一定量的物質，用這些物質來表示微生物生長量的方法。生理指標包括微生物的呼吸強度、耗氧量、酶活性、生物熱等。這是根據(jù)微生物在生長過程中伴隨出現(xiàn)的這些指標，樣品中微生物數(shù)量多或生長旺盛，這些指標愈明顯，因此可以借助特定的儀器如瓦氏呼吸儀、微量量熱計等設備來測定相應的指標。本章授課內容到此結束第二節(jié)微生物的生長因子一、溫度二、pH三、氧化還原電位四、溶解氧五、太陽輻射六、水的活度與滲透壓七、表面張力一、溫度細菌最低溫度oC最適溫度oC最高溫度oC嗜冷菌-５～０５～1020～30嗜中溫菌5～1025～4045～50嗜熱菌3050～6070～80嗜超熱菌55oC以上70～105110～113根據(jù)一般微生物對溫度的最適生長需求，將微生物分為四大類：嗜冷微生物（低溫微生物）的嗜冷機理酶系在低溫下仍能起催化作用；細胞膜含較多的不飽合脂肪酸在低溫下仍具有通透性。生長速度溫度停止生長致死最低最高最適低溫對普通微生物的影響：代謝降低；生長繁殖停滯；仍然存活；常在低溫下對菌種和食品保藏嗜熱微生物的嗜熱機制：細胞內的酶具強抗熱性；產生的多胺，熱亞胺和高溫精胺物質對蛋白質等組織結構具有保護作用；核酸也具有熱穩(wěn)定性的保護結構；細胞膜含有較多的飽和脂肪酸和直鏈脂肪酸，使膜具有穩(wěn)定性。二、pH微生物最低pH最適pH最高pH細菌3～56.5～7.58～10酵母菌2～34.5～5.57～8霉菌1～34.5～5.57～8微生物的生命活動、物質代謝與pH密切相關。不同的微生物要求不同pH，見下表：pH對微生物的影響影響細胞膜透性與穩(wěn)定性；影響物質溶解度；影響細胞表面電荷分布；因此影響微生物生長、繁殖、發(fā)育；各類微生物能夠生長的pH值較寬，但細胞內部pH值卻接近中性；微生物的活動也能改變環(huán)境中的pH值。根據(jù)微生物生長的最適pH，可以將微生物分為：嗜酸性微生物嗜堿性微生物耐酸及耐堿微生物三、氧化還原電位（Eh）

在自然環(huán)境中，氧化還原電位的上限是＋820mV,此時環(huán)境中存在高濃度氧（O2）,無利用O2的系統(tǒng)存在；下限是-400mV，是充滿氫（H2）的環(huán)境。不同的微生物對氧化還原電位的要求不同：一般好氧微生物要求Eh為+300mV~+400mV；兼性厭氧微生物在Eh為+100mV以上時進行好氧呼吸，在為+100mV以下時進行無氧呼吸；專性厭氧微生物在Eh為-200mV~-250mV。

氧化還原電位的影響因素：1．氧分壓：氧分壓高，氧化還原電位高；氧分壓低，氧化還原電位低。2．pH：pH低時，氧化還原電位低；pH高時，氧化還原電位高。3．還原劑：當環(huán)境中有還原劑（如維生素、硫而乙醇鈉、谷胱甘肽、硫化氫及金屬鐵）時，可使氧化還原電位維持在低水平。四、溶解氧根據(jù)氧與微生物生長的關系，可將微生物分為：微生物類型適合生長的氧分壓好氧微生物專性好氧微生物0.2×101KPa微量好氧微生物(0.003—0.2)×101KPa兼性厭氧微生物有氧或無氧厭氧微生物專性厭氧微生物小于0.005×101KPa耐氧厭氧微生物0.02×101KPa以下O2+e-O2-H2O2+O2-O2+OH-+OH·2O2-+2H+H2O2+O22H2O22H2O+O2氧對一切生物都會使其產生有毒害作用的代謝產物，如超氧基化合物O2-與H2O2，這兩種代謝產物互相作用還會產生毒性很強的自由基，自由基是一種強氧化基，它與生物大分子互相作用，從而對機體產生損傷或突變作用，直至死亡。氧之所以對專性厭氧微生物以外的其它四種類型微生物不產生致死作用，是因為它們具有超氧化物歧化酶（SOD）可催化O2-生成H2O2，然后在H2O2酶作用下分解生成H2O和O2。超氧化物歧化酶（SOD）功能：使好氧菌免受超氧化物陰離子自由基的毒害過氧化氫酶(Catalase)五、太陽輻射太陽輻射由三部分組成：短波紫外輻射、可見光（380nm~760nm）和長波紅外輻射。太陽輻射中具有正面生物學效應的輻射是波長短于1000nm的紅外輻射和可見光輻射，短波紫外輻射一般具有負面生物學效應。第三節(jié)其他不利環(huán)境因子對微生物的影響一、紫外輻射和電離輻射對微生物的影響二、超聲波對微生物的影響三、重金屬對微生物的影響四、極端溫度對微生物的影響五、極端pH對微生物的影響六、干燥對微生物的影響七、若干有機物對微生物的影響八、抗生素對微生物的影響一、紫外輻射和電離輻射對微生物的影響紫外輻射的波長為200~390nm，以波長260nm的紫外輻射殺菌力最強。紫外輻射對微生物的致死作用是由于微生物細胞中的核酸、嘌呤、嘧啶及蛋白質對紫外輻射有特別強的吸收能力。紫外輻射能引起DNA鏈上兩個鄰近的胸腺嘧啶分子形成胸腺嘧啶二聚體（T=T），致使DNA不能復制，導致微生物死亡。光復活與暗復活：光復活：把經紫外輻射照射的微生物立刻暴露于藍色可見光下部分受損細胞可恢復活力。光復活現(xiàn)象最早由AKelner（1949年）在Streptomycesgriseus（灰色鏈霉菌）中發(fā)現(xiàn)的。后來在許多微生物中都得到證實。暗復活：微生物細胞在黑暗條件下進行的DNA鏈修復，此修復作用與光全然無關。由于微生物的DNA具有修復作用，所以只有當某一劑量的紫外輻射對DNA的損傷力大大超過修復酶對DNA損傷的修復力時，才導致微生物的死亡。紫外線在科研、生產、醫(yī)學和日常生活中的應用一、空氣消毒；二、表面消毒；三、誘變育種。電離輻射對微生物的影響

X—射線和γ—射線是波長極短的高能電磁波，具有很強的穿透力，能使被照射物體產生電離作用。

X—射線和γ—射線對微生物的影響表現(xiàn)為：低劑量照射有促進微生物生長的作用，或引起微生物發(fā)生變異；高劑量照射對微生物有致死作用。利用X—射線和γ—射線誘導微生物變異，篩選優(yōu)良菌種。二、超聲波對微生物的影響超聲波是頻率超過20000Hz、不能引起人耳聽覺的聲波。超聲波對微生物具有強烈的破壞作用。三、重金屬對微生物的影響重金屬Hg、Ag、Cu、Pb及其化合物能與酶的—SH基結合，使酶失去活性；或與菌體蛋白結合，使之變性或沉淀。因而可有效的殺菌和防腐。高溫滅菌多數(shù)細菌，酵母菌和霉菌的營養(yǎng)細胞和病毒在50-65℃10min可以致死；一般噬菌體65－80℃致死；放線菌霉菌的孢子比營養(yǎng)細胞抗熱性強，76－80℃10min可以殺死；細菌芽孢，在100℃下５－20min才能致死；嗜熱脂肪芽孢桿菌可在80oＣ條件下生活，在120℃，12min才能；同種微生物老齡菌比幼菌耐熱。四、極端溫度對微生物的影響超高溫（微生物最高生長溫度以上的溫度）可使微生物細胞的蛋白質凝固變性、破壞細胞質膜的結構，對微生物有致死作用。利用超高溫對微生物有致死作用，可采取高溫殺菌。其殺菌效果與微生物的種類、數(shù)量、生理狀態(tài)、芽孢有無、菌體含水量及pH值有關。五、極端pH對微生物的影響

過高或過低的pH對微生物生長繁殖都不利，表現(xiàn)在：（1）過低的pH會引起微生物表面電荷的改變；（2）極端的pH可影響培養(yǎng)基中有機化合物的離子化作用，間接影響微生物。（3）極端的pH使微生物細胞內的酶活性降低，影響細胞內正常生化反應的進行。（4）極端的pH降低微生物對高溫的抵抗力。六、干燥對微生物的影響

干燥使微生物細胞的代謝處于停滯狀態(tài)。在干燥的條件下，細菌的芽孢、藻類和真菌的孢子及原生動物的胞可一直呈休眠狀態(tài)長期存活?？衫酶稍飦肀２鼐N。七、若干有機物對微生物的影響一、醇以體積分數(shù)為70%的乙醇殺菌力最強。二、甲醛質量濃度為370－400g/L的甲醛水溶液（即福爾馬林）是常用的殺菌劑。三、表面活性劑包括酚、新潔爾樂（季胺鹽）、合成洗滌劑、染料等。八、抗生素對微生物的影響抗生素是微生物在代謝過程中產生的能殺死或抑制其它微生物生長的化學物質。如青霉素、氯霉素、金霉素、土霉素、四環(huán)素等。抗生素有廣譜抗生素和狹譜抗生素之分?？股貙ξ⑸锏挠绊懕憩F(xiàn)在：（1）抑制微生物細胞壁的合成；（2）破壞微生物的細胞質膜；（3）抑制蛋白質的合成；（4）干擾核酸的合成。英國科學家A.Fleming爵士發(fā)現(xiàn)青霉素第四節(jié)微生物與微生物之間的關系一、競爭關系二、原始合作關系三、共生關系四、偏害關系五、捕食關系六、寄生關系一、競爭關系物種1物種2時間數(shù)量競爭關系是指不同的微生物種群在同一環(huán)境中，對食物等營養(yǎng)、溶解氧、空間和其它共同要求的物質互相競爭，通過產生某些代謝產物或改變環(huán)境條件，能抑制其它微生物的生長繁殖，或毒害殺死其它微生物，互相受到不利的影響。二、原始合作關系原始合作關系（或互生關系）是指兩種可以單獨生活的生物共存于同一環(huán)境中，相互提供營養(yǎng)及其它生活條件，雙方互為有利，當兩者分開時各自可單獨生存?；ドP系在自然界中普遍存在。三、共生關系物種1物種2時間數(shù)量共生關系是指兩種不能單獨生活的微生物共同生活于同一環(huán)境中，各自執(zhí)行優(yōu)勢的勝利功能，在營養(yǎng)上互為有利，組成共生體，生理上相互分工，組織上形成了新的結構，彼此分離各自就不能很好地生活。如地衣是藻類與真菌形成的共生體。地衣組成：真菌（子囊菌，擔子菌）單細胞藻類（綠藻，藍藻）共生組成一種植物體；結構：有些種地衣真菌無規(guī)律地纏繞藻類細胞，另一些種地衣真菌與藻類形成一定層排列。當?shù)匾路敝沉私馇闀r，表面生出珠狀粉芽。其中含有少量藻細胞和真菌絲，粉芽脫離母體。生理：地衣中的真菌和藻類已形成特殊形態(tài)的整體，在生理上相互依存，真菌營異養(yǎng)生活，藻類制造養(yǎng)料，真菌提供水分、無機鹽供藻類光合作用。四、偏害關系偏害關系（或拮抗關系）是指共存于同一環(huán)境中兩種微生物，甲方對乙方有害，乙方對甲方無任何影響。偏害關系可分為非特異性偏害和特異性偏害。五、捕食關系捕食關系即一種微生物以另一種微生物為食，如原生動物以水體和土壤中的細菌，放線菌，真菌的孢子及單細胞藻類為食。時間數(shù)量物種1物種2六、寄生關系時間數(shù)量寄主寄生菌寄生關系是指一種生物需要在另一種生物體內生活，從中攝取營養(yǎng)才能生長繁殖。前者為寄生菌，后者為寄主。寄生的結果一般引起寄主損傷或死亡。第五節(jié)菌種的退化、復壯與保藏一、菌種的退化和復壯二、菌種的保藏一、菌種的退化和復壯微生物由于負變（變異）而導致菌種退化?？刹扇∠鄳拇胧┦雇嘶陱蛪?。

純種分離通過寄主復壯聯(lián)合復壯二、菌種的保藏菌種保藏的方法有：一、傳代培養(yǎng)保藏二、冷凍保藏三、干燥保藏法四、沙土管