第十四章動物實(shí)驗(yàn)基本技術(shù)第一節(jié)實(shí)驗(yàn)動物的抓取和固定

在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，為了不損傷動物的健康，不影響觀察指標(biāo)，并防止被動物咬傷，首先要限制動物的活動，使動物處于安靜狀態(tài)，工作人員必須掌握合理的抓取固定方法。抓取動物前，必須對各種動物的一般習(xí)性有所了解。操作時(shí)要小心仔細(xì)、大膽敏捷、熟練準(zhǔn)確、不能粗暴，不能恐嚇動物，同時(shí)，要愛惜動物，使動物少受痛苦。一、小鼠小鼠性情較溫順，一般不會咬人，比較容易抓取固定。通常用右手提起小鼠尾巴將其放在鼠籠蓋或其它粗糙表面上，在小鼠向前掙扎爬行時(shí)，用左手拇指和食指捏住其雙耳及頸部皮膚，將小鼠置于左手掌心、無名指和小指夾其背部皮膚和尾部，即可將小鼠完全固定。在一些特殊的實(shí)驗(yàn)中，如進(jìn)行尾靜脈注射時(shí)，可使用特殊的固定裝置進(jìn)行固定,如尾靜脈注射架或粗的玻璃試管。如要進(jìn)行手術(shù)或心臟采血應(yīng)先行麻醉再操作,如進(jìn)行解剖實(shí)驗(yàn)則必須先行無痛處死后再進(jìn)行。二、大鼠大鼠的門齒很長，在抓取方法不當(dāng)而受到驚嚇或激怒時(shí)易將操作者手指咬傷,所以,不要突然襲擊式地去抓它，取用時(shí)應(yīng)輕輕抓住其尾巴后提起，置于實(shí)驗(yàn)臺上，用玻璃鐘罩扣住或置于大鼠固定盒內(nèi)，這樣即可進(jìn)行尾靜脈取血或注射。如要作腹腔注射或灌胃等操作時(shí)，實(shí)驗(yàn)者應(yīng)戴上棉紗手套(有經(jīng)驗(yàn)者也可不戴)，右手輕輕抓住大鼠的尾巴向后拉，但要避免抓其尖端，以防尾巴尖端皮膚脫落，左手抓緊鼠兩耳和頭頸部的皮膚，并將大鼠固定在左手中，右手即可進(jìn)行操作。三、家兔家兔比較馴服，不會咬人，但腳爪較尖，應(yīng)避免家兔在掙扎時(shí)抓傷皮膚。常用的抓取方法是先輕輕打開籠門，勿使其受驚，隨后手伸入籠內(nèi)，從頭前阻攔它跑動。然后一只手抓住兔的頸部皮毛，將兔提起，用另一只手托其臀，或用手抓住背部皮膚提起來，放在實(shí)驗(yàn)臺上，即可進(jìn)行采血、注射等操作。因家兔耳大，故人們常誤認(rèn)為抓其耳可以提起，或有人用手挾住其腰背部提起均為不正確的操作。在實(shí)驗(yàn)工作中常用兔耳作采血、靜脈注射等用，所以家兔的兩耳應(yīng)盡量保持不受損傷。家兔的固定方法有盒式固定和臺式固定。盒式固定適用于采血和耳部血管注射，臺式固定適用于測量血壓、呼吸和進(jìn)行手術(shù)操作等。四、豚鼠豚鼠膽小易驚，抓取時(shí)必須穩(wěn)、準(zhǔn)、迅速。先用手掌扣住鼠背，抓住其肩胛上方，將手張開，用手指環(huán)握頸部，另一只手托住其臀部，即可輕輕提起、固定。五、蟾蜍抓取蟾蜍時(shí)，可先在蟾蜍體部包一層濕布，用左手將其背部貼緊手掌固定，把后肢拉直，并用左手的中指、無名指及小指夾住，前肢可用拇指及食指壓住，右手即可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。抓取蟾蜍時(shí)不要擠壓兩側(cè)耳部突起的毒腺，以免蟾蜍將毒液射到使用者眼睛里。需要長時(shí)間固定時(shí)，可將蟾蜍麻醉或毀腦脊髓后，用大頭針釘在蛙板上。六、狗用狗做實(shí)驗(yàn)時(shí)，為防止其咬傷操作人員，一般先將狗嘴綁住。對實(shí)驗(yàn)用狗，如畢格狗或馴服的狗，綁嘴時(shí)操作人員可從其側(cè)面靠近并輕輕撫摸頸部皮毛，然后迅速用布帶綁住狗嘴；對家養(yǎng)的笨狗或未經(jīng)馴服的狗，先用長柄捕狗狗夾夾住狗的頸部，將狗按倒在地，再綁嘴。如果實(shí)驗(yàn)需要麻醉，可先使動物麻醉后再移去狗夾。當(dāng)狗麻醉后，要松開綁嘴布帶，以免影響呼吸。

第二節(jié)實(shí)驗(yàn)動物的編號和分組

一、編號實(shí)驗(yàn)動物常需要標(biāo)記以示區(qū)別。編號的方法很多，根據(jù)動物的種類數(shù)量和觀察時(shí)間長短等因素來選擇合適的標(biāo)記方法。(一)掛牌法：將號碼烙壓在圓形或方形金屬牌上(最好用鋁或不銹鋼的,它可長期使用不生銹),或?qū)⑻柎a按實(shí)驗(yàn)分組編號烙在栓動物頸部的皮帶上，將此頸圈固定在動物頸部。該法適用于狗等大型動物。(二)打號法：用刺數(shù)鉗(又稱耳號鉗)將號碼打在動物耳朵上。打號前用蘸有酒精的棉球擦凈耳朵，用耳號鉗刺上號碼，然后在烙印部位用棉球蘸上溶在食醋里的黑墨水擦抹。該法適用于耳朵比較大的兔、狗等動物。(三)針刺法：用七號或八號針頭蘸取少量碳素墨水，在耳部、前后肢以及尾部等處刺入皮下，在受刺部位留有一黑色標(biāo)記。該法適用于大小鼠、豚鼠等。在實(shí)驗(yàn)動物數(shù)量少的情況下，也可用于兔、狗等動物。(四)化學(xué)藥品涂染動物被毛法：經(jīng)常應(yīng)用的涂染化學(xué)藥品有涂染紅色：0.5％中性紅或品紅溶液。涂染黃色：3-5％苦味酸溶液。涂染黑色：煤焦油的酒精溶液。根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組編號的需要，可用一種化學(xué)藥品涂染實(shí)驗(yàn)動物動物背部被毛就可以。如果實(shí)驗(yàn)動物數(shù)量較多，則可以選擇兩種染料。該方法對于實(shí)驗(yàn)周期短的實(shí)驗(yàn)動物較合適，時(shí)間長了染料易退掉；對于哺乳期的子畜也不適合，因母畜容易咬死子畜或把染料舔掉。(五)剪毛法：該法適用于大、中型動物，如狗、兔等。方法是用剪毛刀在動物一側(cè)或背部剪出號碼，此法編號清楚可靠，但只適于短期觀察。(六)打孔或剪缺口法：可用打孔機(jī)在兔耳一定位置打一小孔來表示一定的號碼。如用剪子剪缺口,應(yīng)在剪后用滑石粉捻一下,以免愈合后看不出來。該法可以編至1～9999號，此種方法常在飼養(yǎng)大量動物時(shí)作為終身號采用。

二、分組(一)分組的原則：進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)時(shí)，經(jīng)常需要將選擇好的實(shí)驗(yàn)動物按研究的需要分成若干組。動物分組應(yīng)按隨機(jī)分配的原則，使每只動物都有同等機(jī)會被分配到各個(gè)實(shí)驗(yàn)組與對照組中去，以避免各組之間的差別,影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，特別是進(jìn)行準(zhǔn)確的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn),必須在隨機(jī)分組的基礎(chǔ)上進(jìn)行。每組動物數(shù)量應(yīng)按實(shí)驗(yàn)周期長短、實(shí)驗(yàn)類型及統(tǒng)計(jì)學(xué)要求而定。如果是慢性實(shí)驗(yàn)或需要定期處死動物進(jìn)行檢驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)，就要求選較多的動物，以補(bǔ)足動物自然死亡和認(rèn)為處死所喪失的數(shù)量，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)有合乎統(tǒng)計(jì)學(xué)要求的動物數(shù)量存在。(二)建立對照組：分組時(shí)應(yīng)建立對照組。1.自身對照組：是指實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)而言。實(shí)驗(yàn)動物本身在實(shí)驗(yàn)處理前、后兩個(gè)階段的各項(xiàng)相關(guān)數(shù)據(jù)就分別是對照組和實(shí)驗(yàn)組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，此法可排除生物間的個(gè)體差異。2.平行對照組：有正對照組和負(fù)對照組兩種。給實(shí)驗(yàn)組動物某種處理，而給正對照組用同樣方法進(jìn)行處理，但并不采用實(shí)驗(yàn)所要求的藥物或手段，負(fù)對照組則不給任何處理。3.具體分組時(shí)，應(yīng)避免人為因素,隨機(jī)把所有的動物進(jìn)行編號，然后令其雙數(shù)為Ａ組(實(shí)驗(yàn)組),單數(shù)為B組(對照組)即可或反之。如果要分若干個(gè)組時(shí)，應(yīng)該用隨機(jī)數(shù)字表示進(jìn)行完全隨機(jī)分組。

第三節(jié)實(shí)驗(yàn)動物的麻醉方法麻醉(anesthesia)的基本任務(wù)是消除實(shí)驗(yàn)過程中所至的疼痛和不適感覺，保障實(shí)驗(yàn)動物的安全，使動物在實(shí)驗(yàn)中服從操作，確保實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行。一、常用的麻醉藥(一)常用局部麻醉劑：普魯卡因，此藥毒性小，見效快，常用于局部浸潤麻醉，用時(shí)配成0.5％～1％；利多卡因，此藥見效快，組織穿透性好，常用1％～2％溶液作為大動物神經(jīng)干阻滯麻醉，也可用0.25％～0.5％溶液作局部浸潤麻醉。(二)常用全身麻醉劑：1.乙醚乙醚吸入法是最常用的麻醉方法,各種動物都可應(yīng)用。其麻醉量和致死量相差大,所以其安全度大。但由于乙醚局部刺激作用大,可刺激上呼吸道粘液分泌增加；通過神經(jīng)反射還可擾亂呼吸、血壓和心臟的活動，并且容易引起窒息，在麻醉過程中要注意。但總起來說乙醚麻醉的優(yōu)點(diǎn)多，如麻醉深度易于掌握，比較安全，而且麻醉后恢復(fù)比較快。其缺點(diǎn)是需要專人負(fù)責(zé)管理麻醉，在麻醉初期出現(xiàn)強(qiáng)烈的興奮現(xiàn)象，對呼吸道又有較強(qiáng)的刺激作用，因此，需在麻醉前給予一定量的嗎啡和阿托品(基礎(chǔ)麻醉)，通常在麻醉前20－30分鐘，皮下注射鹽酸或硫酸嗎啡(每公斤體重5～10mg)及阿托品(每公斤體重0.1mg)。鹽酸嗎啡可降低中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性，提高痛閾，還可節(jié)省乙醚用量及避免乙醚麻醉過程中的興奮期。阿托品可對抗乙醚刺激呼吸道分泌粘液的作用，可避免麻醉過程中發(fā)生呼吸道堵塞，或手術(shù)后發(fā)生吸入性肺炎。進(jìn)行手術(shù)或使用過程中，需要繼續(xù)給予吸入乙醚，以維持麻醉狀態(tài)。慢性實(shí)驗(yàn)預(yù)備手術(shù)的過程中，仍用麻醉口罩給藥，而在一般急性使用,麻醉后可以先進(jìn)行氣管切開術(shù),通過氣管套管連接麻醉瓶繼續(xù)給藥。在繼續(xù)給藥過程中，要時(shí)常檢查角膜反射和觀察瞳孔大小(如發(fā)現(xiàn)角膜反射消失，瞳孔突然放大，應(yīng)立即停止麻醉。萬一呼吸停止，必須立即施行人工呼吸。待恢復(fù)自動呼吸后再進(jìn)行操作。2.苯巴比妥鈉此藥作用持久,應(yīng)用方便，在普通麻醉用量情況下對于動物呼吸、血壓和其它功能無多大影響。通常在實(shí)驗(yàn)前半至一小時(shí)用藥。使用劑量及方法為：狗腹腔注射80～100mg/kg體重，靜脈注射70～120mg/kg體重(一般每公斤體重給70～80mg即可麻醉，但有的動物要100～120mg才能麻醉,具體用量可根據(jù)各個(gè)動物的敏感性而定)。兔腹腔注射150～200mg/kg體重。3.戊巴比妥鈉此藥麻醉時(shí)間不很長,一次給藥的有效時(shí)間可延續(xù)3-5小時(shí),所以十分適合一般使用要求。給藥后對動物循環(huán)和呼吸系統(tǒng)無顯著抑制作用，藥品價(jià)格也很便宜。用時(shí)配成1～３％生理鹽水溶液，必要時(shí)可加溫溶解，配好的藥液在常溫下放置1～2月不失藥效。靜脈或腹腔注射后很快就進(jìn)入麻醉期，使用劑量及方法為：狗、貓、兔靜脈注射30～35mg/kg體重,腹腔注射40～45mg/kg體重。4.硫噴妥鈉為黃色粉末，有硫臭，易吸水。其水溶液不穩(wěn)定，故必須現(xiàn)用現(xiàn)配,常用濃度為1～5％。此藥作靜脈注射時(shí)，由于藥液迅速進(jìn)入腦組織，故誘導(dǎo)快，動物很快被麻醉。但蘇醒也很快，一次給藥的麻醉時(shí)效僅維持半至一小時(shí)。在時(shí)間較長的實(shí)驗(yàn)過程中，可重復(fù)注射，以維持一定的麻醉深度。此藥對胃腸道無副作用，但對呼吸有一定抑制作用，由于其抑制交感神經(jīng)較副交感神經(jīng)為強(qiáng),常有喉頭痙攣,因此注射時(shí)速度必須緩慢。實(shí)驗(yàn)劑量和方法：狗靜脈注射20～25mg/kg體重；兔靜脈注射7～10mg/kg體重。靜脈注射速度以15秒鐘注射2ml左右進(jìn)行。小鼠1％溶液腹腔注射0.1～0.3ml/只；大鼠0.6～0.8ml/只。5.巴比妥鈉使用劑量及方法：狗靜脈注射225mg/kg體重；兔腹腔注射200mg/kg體重；鼠皮下注射200mg/kg體重。6.氨基甲酸乙酯此藥是比較溫和的麻醉藥，安全度大。多數(shù)實(shí)驗(yàn)動物都可使用,更適合于小動物。一般用作基礎(chǔ)麻醉，如使用全部過程都用此麻醉時(shí)，動物保溫尤為重要。使用時(shí)常配成20～25％水溶液，狗、兔靜脈、腹腔注射0.75～1g/kg體重。但在作靜脈注射時(shí)必須溶在生理鹽水中，配成5％或10％溶液，及每公斤體重注射10～20ml。鼠1.5～2g/kg體重，由腹腔注射。以上麻醉藥種類雖較多，但各種動物使用的種類多有所側(cè)重。如做慢性實(shí)驗(yàn)的動物常用乙醚吸入麻醉(用嗎啡和阿托品作基礎(chǔ)麻醉)；急性動物實(shí)驗(yàn)對狗、貓和大鼠常用戊巴比妥鈉麻醉；對家兔和青蛙、蟾蜍常用氨基甲酸乙酯；對大鼠和小鼠常用硫噴妥鈉或氨基甲酸乙酯麻醉。二、麻醉方法(一)全身麻醉：麻醉藥經(jīng)呼吸道吸入或靜脈、肌肉注射,產(chǎn)生中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制,呈現(xiàn)神志消失，全身不感疼痛，肌肉松弛和反射抑制等現(xiàn)象，這種方法稱全身麻醉。其特點(diǎn)為抑制深淺與藥物在血液內(nèi)的濃度有關(guān),當(dāng)麻醉藥從體內(nèi)排出或在體內(nèi)代謝破壞后,動物逐漸清醒，不留后遺癥。1.吸入麻醉法麻醉藥以蒸氣或氣體狀態(tài)經(jīng)呼吸道吸入而產(chǎn)生麻醉者，稱吸入麻醉，常用乙醚作麻醉藥。吸入法對多數(shù)動物有良好的麻醉效果，其優(yōu)點(diǎn)是易于調(diào)節(jié)麻醉的深度和較快的終止麻醉，缺點(diǎn)是中、小型動物較適用，對大型動物如狗的吸入麻醉操作復(fù)雜，通常不用。具體方法是：使用乙醚麻醉兔及大小鼠時(shí)，可將動物放入玻璃麻醉箱內(nèi)，把裝有浸潤乙醚棉球的小燒杯放入麻醉箱，然后觀察動物。開始動物自主活動，不久動物出現(xiàn)異常興奮，不停地掙扎，隨后排出大小便。漸漸地動物由興奮轉(zhuǎn)為抑制，倒下不動，呼吸變慢。如動物四肢緊張度明顯減低，角膜反射遲鈍，皮膚痛覺消失，則表示動物已進(jìn)入麻醉，可行手術(shù)和操作。在實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)隨時(shí)觀察動物的變化，必要時(shí)把乙醚燒杯放在動物鼻部，以維持麻醉的時(shí)間與深度。2.注射麻醉法常用的麻醉藥有戊巴比妥鈉、硫噴妥鈉、氨基甲酸乙酯等。大、小鼠和豚鼠常采用腹腔注射法進(jìn)行全身麻醉。狗、兔等動物既可腹腔注射給藥,也可靜脈注射給藥。在麻醉興奮期出現(xiàn)時(shí)，動物掙扎不安，為防止注射針滑脫，常用吸入麻醉法進(jìn)行誘導(dǎo)，待動物安靜后再行腹腔或靜脈穿刺給藥麻醉。在注射麻醉藥物時(shí)，先用麻醉藥總量的三分之二，密切觀察動物生命體征的變化，如已達(dá)到所需麻醉的程度，余下的麻醉藥則不用，避免麻醉過深抑制延腦呼吸中樞導(dǎo)致動物死亡。(二)動物局部麻醉方法：用局部麻醉藥阻滯周圍神經(jīng)末梢或神經(jīng)干、神經(jīng)節(jié)、神經(jīng)叢的沖動傳導(dǎo)，產(chǎn)生局部性的麻醉區(qū)，稱為局部麻醉。其特點(diǎn)是動物保持清醒，對重要器官功能干擾輕微，麻醉并發(fā)癥少，是一種比較安全的麻醉方法。適用于大中型動物各種短時(shí)間內(nèi)的實(shí)驗(yàn)。局部麻醉操作方法很多，可分為表面麻醉、局部浸潤麻醉、區(qū)域阻滯麻醉以及神經(jīng)干(叢)阻滯麻醉。1.表面麻醉利用局部麻醉藥的組織穿透作用，透過粘膜,阻滯表面的神經(jīng)末梢，稱表面麻醉。在口腔及鼻腔粘膜、眼結(jié)膜、尿道等部位手術(shù)時(shí),常把麻醉藥涂敷、滴入、噴于表面上，或尿道灌注給藥，使之麻醉。2.區(qū)域阻滯麻醉：在手術(shù)區(qū)四周和底部注射麻醉藥阻斷疼痛的向心傳導(dǎo),稱區(qū)域阻斷麻醉。常用藥為普魯卡因。3.神經(jīng)干(叢)阻滯麻醉：在神經(jīng)干(叢)的周圍注射麻醉藥，阻滯其傳導(dǎo),使其所支配的區(qū)域無疼痛，稱神經(jīng)干(叢)阻滯麻醉。常用藥為利多卡因。4.局部浸潤麻醉：沿手術(shù)切口逐層注射麻醉藥，靠藥液的張力彌散，浸入組織,麻醉感覺神經(jīng)末梢，稱局部浸潤麻醉。常用藥為普魯卡因。在施行局部浸潤麻醉時(shí)，先固定好動物，用0.5～1％鹽酸普魯卡因皮內(nèi)注射，使局部皮膚表面呈現(xiàn)一桔皮樣隆起，稱皮丘，然后從皮丘進(jìn)針，向皮下分層注射，在擴(kuò)大浸潤范圍時(shí)，針尖應(yīng)從已浸潤過的部位刺入，直至要求麻醉區(qū)域的皮膚都浸潤為止。每次注射時(shí)，必須先抽注射器，以免將麻醉藥注入血管內(nèi)引起中毒反應(yīng)。三、使用全身麻醉劑的注意事項(xiàng)給動物施行麻醉術(shù)時(shí),一定要注意方法的可靠性,根據(jù)不同的動物選擇合適的方法，特別是較貴重的大型動物。1.麻醉劑的用量，除參照一般標(biāo)準(zhǔn)外，還應(yīng)考慮個(gè)體對藥物的耐受性不同,而且體重與所需劑量的關(guān)系也并不是絕對成正比的。一般說，衰弱和過胖的動物，其單位體重所需劑量較小，在使用麻醉劑過程中，隨時(shí)檢查動物的反應(yīng)情況,尤其是采用靜脈注射,絕不可將按體重計(jì)算出的用量匆忙進(jìn)行注射。2.動物在麻醉期體溫容易下降，要采取保溫措施。3.靜脈注射必須緩慢，同時(shí)觀察肌肉緊張、角膜反射和對皮膚夾捏的反應(yīng),當(dāng)這些活動明顯減弱或消失時(shí)，應(yīng)立即停止注射。配制的藥液濃度要適中不可過高，以免麻醉過急；但也不能過低，以減少注入溶液的體積。4.作慢性實(shí)驗(yàn)時(shí)，在寒冷冬季，麻醉劑在注射前應(yīng)加熱至動物體溫水平。四、實(shí)驗(yàn)動物用藥量的確定及計(jì)算方法(一)動物給藥量的確定觀察一種藥物對實(shí)驗(yàn)動物的作用時(shí)，一個(gè)重要的問題就是給動物用多大的劑量較合適。劑量太小，作用不明顯，劑量太大，又可能引起動物中毒致死?？梢园聪率龇椒ù_定劑量：1.先用少量小鼠粗略地探索中毒劑量或致死劑量,然后用小于中毒量的劑量，或取致死量的若干分之一作為應(yīng)用劑量，一般可取1/10～1/5。2.植物藥粗制劑的劑量多按生藥折算。3.化學(xué)藥品可參考化學(xué)結(jié)構(gòu)相似的已知藥物，特別是化學(xué)結(jié)構(gòu)和作用都相似的劑量。4.確定劑量后，如第一次用藥的作用不明顯，動物也沒有中毒的表現(xiàn),可以加大劑量再次實(shí)驗(yàn)。如出現(xiàn)中毒現(xiàn)象，作用也明顯，則應(yīng)降低劑量再次實(shí)驗(yàn)。在一般情況下，在適宜的劑量范圍內(nèi)，藥物的作用常隨劑量的加大而增強(qiáng)。所以有條件時(shí)，最好同時(shí)用幾個(gè)劑量作實(shí)驗(yàn)，以便迅速獲得關(guān)于藥物作用的較完整的資料。如實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)劑量與作用強(qiáng)度之間毫無規(guī)律時(shí)，則更應(yīng)慎重分析。5.用大動物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，防止動物中毒死亡,開始的劑量可采用鼠類的1/15～1/2,以后可根據(jù)動物的反應(yīng)調(diào)整劑量。6.確定動物給藥劑量時(shí)，要考慮給藥動物的年齡大小和體質(zhì)強(qiáng)弱。一般說確定的給藥劑量是指成年動物的，如是幼齡動物，劑量應(yīng)減小。如以狗為例：6個(gè)月以上的狗給藥劑量為1份時(shí)，3～6個(gè)月的給1/2份，45～89日的給1/4份，20～44日的給1/8份，10～19日的給1/16份。7.確定動物給藥劑量時(shí)，要考慮因給藥途徑不同，所用劑量也不同。以口服量為100時(shí)，皮下注射量為30～50，肌肉注射量為20～30，靜脈注射量為25。(二)人與動物的用藥量換算方法人與動物對同一藥物耐受性不同，一般動物的耐受性要比人大，單位體重的用藥量動物比人要高。必須將人的用藥量換算成動物的用藥量。一般可按下列比例換算：人用藥量：1小鼠、大鼠：50～100兔、豚鼠：15～20狗、貓：5～10以上系按單位體重口服用藥量換算。如給藥途徑為靜脈、皮下、腹腔注射，換算比例應(yīng)適當(dāng)減小些。

第四節(jié)實(shí)驗(yàn)動物的除毛、給藥方法

一、實(shí)驗(yàn)動物的除毛在動物實(shí)驗(yàn)中，被毛有時(shí)會影響實(shí)驗(yàn)操作與觀察，因此必須除去。除去被毛的方法有剪毛、拔毛、剃毛和脫毛等。(一)剪毛法：剪毛法是將動物固定后，先用蘸有水的紗布把被毛浸濕，再用剪毛剪刀緊貼皮膚剪去被毛。不可用手提起被毛，以免剪破皮膚。剪下的毛應(yīng)集中放在一容器內(nèi)，防止到處飛揚(yáng)。給狗、羊等動物采血或新生乳牛放血制備血清常用此法。(二)拔毛法：拔毛法是用拇指和食指拔去被毛的方法。在兔耳緣靜脈注射或尾靜脈注射時(shí)常用此法。(三)剃毛法：剃毛法是用剃毛刀剃去動物被毛的方法。如動物被毛較長，先要用剪刀將其剪短，再用刷子蘸溫肥皂水將剃毛部位浸透，然后再用剃毛刀除毛。本法適用于暴露外科手術(shù)區(qū)。(四)脫毛法：脫毛法是用化學(xué)藥品脫去動物被毛的方法。首先將被毛剪短，然后用棉球蘸取脫毛劑，在所需部位涂一薄層，2～3分鐘后用溫水洗去脫落的被毛，用紗布擦干，再涂一層油脂即可。適用于狗等大動物的脫毛劑配方為：硫化鈉10g，生石灰15g，溶于100ml水中。適用于兔、鼠等動物的脫毛劑的配方為：1.硫化鈉3g,肥皂粉1g,淀粉7g,加適量水調(diào)成糊狀；2.硫化鈉8g,淀粉7g，糖4g，甘油5g，硼砂1g,加水75ml；3.硫化鈉8g溶于100ml水中。二、實(shí)驗(yàn)動物的給藥在動物實(shí)驗(yàn)中，為了觀察藥物對機(jī)體功能、代謝及形態(tài)引起的變化，常需要將藥物注入動物體內(nèi)。給藥的途徑和方法多種多樣，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、?shí)驗(yàn)動物種類和藥物劑型、劑量等情況確定。(一)注射給藥法1.皮下注射注射時(shí)用左手拇指及食指輕輕捏起皮膚，右手持注射器將針頭刺入,固定后即可進(jìn)行注射。一般小鼠在背部或前肢腋下，大鼠在背部或側(cè)下腹部；豚鼠在后大腿內(nèi)側(cè)、背部等脂肪少的部位；兔在背部或耳根部注射；蛙可在脊背部淋巴囊注射；狗多在大腿外側(cè)注射，拔針時(shí)，輕按針孔片刻，防藥液逸出。2.皮內(nèi)注射此法用于觀察皮膚血管的通透性變化或觀察皮內(nèi)反應(yīng)。如將一定量的放射性同位素溶液、顏料或致炎物質(zhì)、藥物等注入皮內(nèi)，觀察其消失速度和局部血液循環(huán)變化，作為皮膚血管通透性觀察指標(biāo)之一。方法是：將動物注射部位的毛剪去，消毒后，用皮試針頭緊貼皮膚皮層刺入皮內(nèi)，然后使針頭向上挑起并再稍刺入，即可注射藥液。注射后可見皮膚表面鼓起一白色小皮丘。3.肌肉注射當(dāng)給動物注射不溶于水而混懸于油或其他溶劑中的藥物時(shí),常采用肌肉注射。肌肉注射一般選用肌肉發(fā)達(dá)、無大血管經(jīng)過的部位，多選臀部。注射時(shí)針頭要垂直快速刺入肌肉，如無回血現(xiàn)象即可注射。給大、小鼠作肌肉注射時(shí)，選大腿外側(cè)肌肉進(jìn)行注射。4.腹腔注射先將動物固定,腹部用酒精棉球擦試消毒，然后在左或右側(cè)腹部將針頭刺入皮下，沿皮下向前推進(jìn)約0.5厘米，再使針頭與皮膚呈45度角方向穿過腹肌刺入腹腔，此時(shí)有落空感，回抽無腸液、尿液后，緩緩?fù)迫胨幰骸４朔ù笮∈笥玫妮^多。5.靜脈注射是將藥液直接注射于靜脈管內(nèi)，使其隨著血液分布全身,迅速奏效。但排泄較快，作用時(shí)間較短。小鼠、大鼠的靜脈注射：常采用尾靜脈注射。鼠尾靜脈共有3根，左右兩側(cè)和背側(cè)各1根，兩側(cè)尾靜脈比較容易固定，故常被采用。操作時(shí)，先將動物固定在暴露尾部的固定器內(nèi)(可用燒杯、鐵絲罩或粗試管等物代替),用75％酒精棉球反復(fù)擦試使血管擴(kuò)張,并可使表皮角質(zhì)軟化，以左手拇指和食指捏住鼠尾兩側(cè)，使靜脈充盈,注射時(shí)針頭盡量采取與尾部平行的角度進(jìn)針。開始注射時(shí)宜少量緩注，如無阻力,表示針頭已進(jìn)入靜脈,這時(shí)用左手指將針和尾一起固定起來，解除對尾根部的壓迫后，便可進(jìn)行注射。如有白色皮丘出現(xiàn)，說明未穿刺入血管，應(yīng)重新向尾部方向移動針頭再次穿刺。注射完畢后把尾部向注射側(cè)彎曲以止血。如需反復(fù)注射，盡量從尾的末端開始。一次的注射量為每10g體重0.1-0.2ml。豚鼠的靜脈注射：一般采用前肢皮下頭靜脈。鼠的靜脈管壁較脆，注射時(shí)應(yīng)特別注意。兔的靜脈注射：一般采用外耳緣靜脈，因其表淺易固定。注射部位除毛，用75％的酒精消毒，手指輕彈兔耳，使靜脈充盈，左手食指和中指夾住靜脈的近心端，拇指繃緊靜脈的遠(yuǎn)心端，無名指及小指墊在下面，右手持注射器，盡量從靜脈的遠(yuǎn)端刺入血管，移動拇指于針頭上以固定，放開食、中指，將藥液注入，然后拔出針頭，用手壓迫針眼片刻以止血。狗的靜脈注射：狗的靜脈注射多采用前肢外側(cè)靜脈或后肢外側(cè)的小隱靜脈。注射部位除毛后，在靜脈血管的近心端用橡皮帶扎緊，使血管充盈，從靜脈的遠(yuǎn)心端將注射針頭平行血管刺入，回抽注射器針?biāo)?，如有回血，即可放開像皮帶，將藥液緩緩注入。6.淋巴囊注射蛙類常采用此法,其皮下有數(shù)個(gè)淋巴囊，注入藥物甚易吸收。腹部淋巴囊和頭部淋巴囊常作為蛙類給藥途徑。一般多選用腹部淋巴囊給藥。注射時(shí)將針頭從蛙大腿上端刺入，經(jīng)大腿肌層入腹壁肌層，再進(jìn)入腹壁皮下，即進(jìn)入淋巴囊，然后注入藥液。(二)經(jīng)口給藥法1.口服法：把藥物放入飼料或溶于飲水中讓動物自動攝取。此法優(yōu)點(diǎn)在于簡單方便，缺點(diǎn)是不能保證劑量準(zhǔn)確。一般適用于對動物疾病的防治或某些藥物的毒性實(shí)驗(yàn)，制造某些與食物有關(guān)的人類疾病動物模型。2.灌胃法：在急性實(shí)驗(yàn)中,多采用灌胃法。此法劑量準(zhǔn)確。灌胃法是用灌胃器將所應(yīng)投給動物的藥灌到動物胃內(nèi)。灌胃器由注射器和特殊的灌胃針構(gòu)成。小鼠的灌胃針長約4～5cm，直徑為1mm，大鼠的灌胃針長約6～8cm，直徑約1.2mm。灌胃針的尖端焊有一小圓金屬球，金屬球?yàn)橹锌盏?。焊金屬球的目的是防止針頭刺入氣管或損傷消化道。針頭金屬球端彎曲成20°左右的角度，以適應(yīng)口腔、食道的生理彎曲度走向。鼠類的灌胃法：用左手固定鼠，右手持灌胃器，將灌胃針從鼠的口腔插入，壓迫鼠的頭部，使口腔與食道成一直線,將灌胃針沿咽后壁慢慢插入食道，可感到輕微的阻力,此時(shí)可略改變一下灌胃針方向，以刺激引起吞咽動作，順勢將藥液注入。一般灌胃針插入小鼠深度為3～4cm，大鼠或豚鼠為4～6cm。常用灌胃量小鼠為0.2～1ml,大鼠1～4ml,豚鼠1～5ml。狗、兔的灌胃法：先將動物固定，再將開口器的小孔插入動物口中，再慢慢沿上鄂壁插入食道，將灌胃管的外端浸入水中，如有氣泡逸出，則說明灌胃管誤入氣管，需拔出重插。插好后，將注射器連于灌胃管將藥液推入。灌胃結(jié)束后，先拔出灌胃管，再拿出開口器。一次灌胃能耐受的最大容積兔為80～100ml，狗為200～250ml。(三)其它途徑給藥方法1.呼吸道給藥：呈粉塵、氣體及蒸氣或霧等狀態(tài)的藥物或毒氣,均需要通過動物呼吸道給藥。如實(shí)驗(yàn)時(shí)給動物乙醚作吸入麻醉、用鋸末煙霧制作慢性氣管炎動物模型等，特別在毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用更為廣泛。2.皮膚給藥：為了鑒定藥物或毒物經(jīng)皮膚的吸收作用、局部作用、致敏作用和光感作用等，均需采用經(jīng)皮膚給藥方法。如兔和豚鼠常采用背部一定面積的皮膚脫毛后，將一定的藥液涂在皮膚上，藥液經(jīng)皮膚吸收。3.脊髓腔內(nèi)給藥：此法主要用于錐管麻醉或抽取腦脊液。4.腦內(nèi)給藥：此法常用于微生物學(xué)動物實(shí)驗(yàn),將病原體等接種于被檢動物腦內(nèi)，然后觀察接種后的各種變化。5.直腸內(nèi)給藥：此種方法常用于動物麻醉。兔直腸內(nèi)給藥時(shí),常采用灌腸的膠皮管或用14號導(dǎo)尿管代替。6.關(guān)節(jié)腔內(nèi)給藥：此法常用于關(guān)節(jié)炎的動物模型復(fù)制。

第五節(jié)實(shí)驗(yàn)動物的采血法實(shí)驗(yàn)研究中，經(jīng)常要采集實(shí)驗(yàn)動物的血液進(jìn)行常規(guī)質(zhì)量檢測、細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)或進(jìn)行生物化學(xué)分析，故必須掌握正確的采集血液的技術(shù)。采血方法的選擇，主要決定于實(shí)驗(yàn)的目的和所需血量以及動物種類。一、大鼠、小鼠的采血方法(一)剪尾采血：需血量很少時(shí)常用本法，如作紅、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白測定、制作血涂片等可與此法。動物麻醉后，將尾尖剪去約5mm，從尾部向尾尖部按摩，血即從斷端流出。也可用刀割破尾動脈或尾靜脈，讓血液自行流出。如不麻醉，采血量較小。采血結(jié)束后，消毒、止血。用此法每只鼠可采血10余次。小鼠可每次采血約0.1ml，大鼠約0.4ml。(二)眼眶后靜脈叢采血：穿刺采用一根特制的長7～10cm硬的玻璃取血管,其一端內(nèi)徑為1～1.5mm，另一端逐漸擴(kuò)大，細(xì)端長約1cm即可，將取血管浸入1％肝素溶液，干燥后使用。采血時(shí)，左手拇指及食指抓住鼠兩耳之間的皮膚使鼠固定，并輕輕壓迫頸部兩側(cè)，阻礙靜脈回流，使眼球充分外突，提示眼眶后靜脈叢沖血。右手持取血管，將其尖端插入內(nèi)眼角與眼球之間，輕輕向眼底方向刺入，當(dāng)感到有阻力時(shí)即停止刺入，旋轉(zhuǎn)取血管以切開靜脈叢，血液即流入取血管中。采血結(jié)束后，拔出取血管，放松左手，出血即停止。用本法在短期內(nèi)可重復(fù)采血。小鼠一次可采血0.2～0.3ml，大鼠一次可采血0.5～1.0ml。(三)頸(股)靜脈或頸(股)動脈采血：將鼠麻醉，剪去一側(cè)頸部外側(cè)被毛，作頸靜脈或頸動脈分離手術(shù),用注射器即可抽出所需血量。大鼠多采用股靜脈或股動脈,方法是：大鼠經(jīng)麻醉后，剪開腹股溝處皮膚，即可看到股靜脈，把此靜脈剪斷或用注射器采血即可，股動脈較深需剝離出，再采血。(四)摘眼球采血：此法常用于鼠類大量采血。采血時(shí),用左手固定動物,壓迫眼球，盡量使眼球突出，右手用鑷子或止血鉗迅速摘除眼球，眼眶內(nèi)很快流出血液。(五)斷頭采血：用剪子迅速剪掉動物頭部，立即將動物頸朝下，提起動物，血液可流入已準(zhǔn)備好的容器中。二、豚鼠采血方法(一)耳緣切口采血：先將豚鼠耳消毒,用刀片沿血管方向割破耳緣,切口約長0.5cm,在切口邊緣涂上20％的檸檬酸鈉溶液，防治血凝，則血可自切口處流出。此法采血每次可采0.5ml。(二)背中足靜脈采血：固定豚鼠，將其右或左后肢膝關(guān)節(jié)伸直，腳背消毒，找出足靜脈，左手拇指和食指拉住豚鼠的趾端，右手將注射針刺入靜脈，拔針后立即出血。(三)心臟采血：用手指觸摸，選擇心跳最明顯的部位，把注射針刺入心臟，血液即流入針管。心臟采血時(shí)所用的針頭應(yīng)細(xì)長些，以免發(fā)生采血后穿刺孔出血。三、兔的采血方法(一)耳緣靜脈采血：將兔固定,拔去耳緣靜脈局部的被毛，消毒，用手指輕彈兔耳,使靜脈擴(kuò)張，用針頭刺耳緣靜脈末端,或用刀片沿血管方向割破一小切口,血液即流出。本法為兔最常用的采血方法，可多次重復(fù)使用。(二)耳中央動脈采血：在兔耳中央有一條較粗的、顏色較鮮紅的中央動脈。用左手固定兔耳，右手持注射器，在中央動脈的末端，沿著與動脈平行的向心方向刺入動脈，即可見血液進(jìn)入針管。由于兔耳中央動脈容易痙攣，故抽血前必須讓兔耳充分充血，采血時(shí)動作要迅速。采血所用針頭不要太細(xì)，一般用6號針頭，針刺部位從中央動脈末端開始，不要在近耳根部采血。(三)頸靜脈采血：方法同小鼠、大鼠的頸靜脈采血。(四)心臟采血：使家兔仰臥，穿刺部位在第三肋間胸骨左緣3mm處，針頭刺入心臟后，持針手可感覺到兔心臟有節(jié)律的跳動。此時(shí)如還抽不到血，可以前后進(jìn)退調(diào)節(jié)針頭的位置，注意切不可使針頭在胸腔內(nèi)左右擺動，以防弄傷兔的心、肺。四、狗的采血方法(一)后肢外側(cè)小隱靜脈采血：后肢外側(cè)小隱靜脈位于后肢脛部下三分之一的外側(cè)淺表皮下，由前側(cè)方向后行走。采血時(shí)，將動物固定，局部剪毛、消毒，采血者左手緊握剪毛區(qū)上部或扎緊止血帶，使下部靜脈充血，右手用連有6號或7號針頭的注射器刺入靜脈，左手放松，已適當(dāng)速度抽血即可。(二)前肢背側(cè)皮下頭靜脈采血：前肢背側(cè)皮下頭靜脈位于前腳爪的上方背側(cè)的正前位。采血方法同上。(三)頸靜脈采血：前兩種方法需技術(shù)熟練,且不適于連續(xù)采血。大量或連續(xù)采血時(shí),可采用頸靜脈采血，方法同小鼠、大鼠的頸靜脈采血方法。(四)股動脈采血：本法為采取動脈血最常用的方法。操作簡便，稍加訓(xùn)練的狗，在清醒狀態(tài)下將狗臥位固定于狗解剖臺上。伸展后肢向外伸直，暴露腹股溝三角動脈搏動的部位，剪毛、消毒，左手中指、食指探模股動脈跳動部位，并固定好血管，右手取連有5號半針頭的注射器，針頭由動脈跳動處直接刺入血管，若刺入動脈一般可見鮮紅血液流入注射器，有時(shí)還需微微轉(zhuǎn)動一下針頭或上下移動一下針頭，方見鮮紅血液流入。有時(shí)可能刺入靜脈，必須重抽。抽血畢，迅速拔出針頭，用干藥棉壓迫止血2-3分鐘。第六節(jié)實(shí)驗(yàn)動物各種體液、骨髓的采集方法

一、消化液的采集(一)唾液1.直接抽取法在急性實(shí)驗(yàn)中，可用吸管直接插入動物口腔或唾液腺導(dǎo)管抽吸唾液，此法非常簡單，但從口腔抽吸唾液會有雜質(zhì)混入。2.制造腮腺瘺法在慢性實(shí)驗(yàn)中,收集狗的唾液，要用外科手術(shù)方法將腮腺導(dǎo)管開口移向體外，即以腮腺導(dǎo)管為中心，切成一直徑約2～3cm的圓形粘膜片，將此粘膜片，與周圍組織分開，穿過皮膚切口引到頰外,將帶有導(dǎo)管開口的粘膜片與周圍的皮膚縫合,腮腺分泌的唾液就流出頰外。這種方法可以收集到較純凈的唾液。(二)胃液1.直接收集胃液法急性實(shí)驗(yàn)時(shí)，先將動物麻醉，將插胃管經(jīng)口插入胃內(nèi),在灌胃管的出口連一注射器，用此注射器可收集到胃液,此法適用于狗等大型動物。如是大鼠,需手術(shù)剖腹，從幽門端向胃內(nèi)插入一塑料管，再由口腔經(jīng)食道將一塑料管插入前胃，用pH7.5、35℃左右的生理鹽水，以12ml/h的流速灌胃，收集流出液，進(jìn)行分析。2.制備胃瘺法在慢性實(shí)驗(yàn)中,收集胃液多用胃瘺法,如全胃瘺法、巴氏小胃瘺法、海氏小胃瘺法等。制備小胃是將動物的胃分離出一小部分，縫合起來形成小胃，主胃與小胃互不相通，主胃進(jìn)行正常消化，從小胃可收集到純凈的胃液。應(yīng)用該法，可以待動物恢復(fù)健康后，在動物清醒狀態(tài)下反復(fù)采集胃液。(三)胰液和膽汁在動物實(shí)驗(yàn)中，主要是通過對胰總管和膽總管的插管而獲得胰液或膽汁。狗的胰總管開口于十二指腸降部，在緊靠腸壁處切開胰管，結(jié)扎固定并與導(dǎo)管相連，即可見無色的胰液流入導(dǎo)管。大鼠的胰管與膽管匯集于一個(gè)總管，在其入腸處插管固定，并在近肝門處結(jié)扎和另行插管，可分別收集到胰液和膽汁。有時(shí)也可通過制備胰瘺和膽囊瘺來獲得胰液和膽汁。四、腦脊液的采集(一)狗、兔腦脊液的采集通常采取脊髓穿刺法：穿刺部位在兩髂連線中點(diǎn)稍下方第七腰椎間隙。動物輕度麻醉后，側(cè)臥位固定，使頭部及尾部向腰部盡量彎曲，剪去第七腰椎周圍的被毛。消毒后操作者在動物背部用左手姆、食指固定穿刺部位的皮膚，右手持腰穿刺針垂直刺入，當(dāng)有落空感及動物的后肢跳動時(shí)，表明針已達(dá)椎管內(nèi)(蛛網(wǎng)膜下腔)，抽去針芯,即見腦脊液流出。如果無腦脊液流出，可能是沒有刺破蛛網(wǎng)膜。輕輕調(diào)節(jié)進(jìn)針方向及角度，如果腦脊液流的太快，插入針芯稍加阻塞，以免導(dǎo)致顱內(nèi)壓突然下降而形成腦疝。(二)大鼠腦脊液的采集可采用枕大孔直接穿刺法在大鼠麻醉后，頭部固定于定向儀上。頭頸部剪毛、消毒，用手術(shù)刀沿縱軸切一縱行切口(約2cm）用剪刀鈍性分離頸部背側(cè)肌肉。為避免出血，最深層附著在骨上的肌肉用手術(shù)刀背刮開，暴露出枕骨大孔。由枕骨大孔進(jìn)針直接抽取腦脊液。抽取完畢逢好外層肌肉、皮膚。刀口處可撒些磺胺藥粉，防止感染。采完腦脊液后，應(yīng)注入等量的消毒生理鹽水，以保持原來腦脊髓腔的壓力。五、尿液的采集常用的采集方法較多，一般在實(shí)驗(yàn)前需給動物灌服一定量的水。(一)代謝籠法：此法較常用，適用于大、小鼠。將動物放在特制的籠內(nèi)。動物排便時(shí)，可以通過籠子底部的大小便分離漏斗將尿液與糞便分開，達(dá)到采集尿液的目的。由于大、小鼠尿量較少，操作中的損失和蒸發(fā)，各鼠膀胱排空不一致等原因，都可造成較大的誤差，因此一般需收集5小時(shí)以上的尿液，最后取平均值。(二)導(dǎo)尿法：常用于雄性兔、狗。動物輕度麻醉后，固定于手術(shù)臺上。由尿道插入導(dǎo)尿管(頂端應(yīng)用液體石蠟涂抹)，可以采到?jīng)]有受到污染的尿液。(三)壓迫膀胱法：在實(shí)驗(yàn)研究中，有時(shí)為了某種實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，要求間隔一定的時(shí)間，收集一次尿液，以觀察藥物的排泄情況。動物輕度麻醉后，實(shí)驗(yàn)人員用手在動物下腹部加壓，手要輕柔而有力。當(dāng)加的壓力足以使動物膀胱括約肌松馳時(shí)，尿液會自動由尿道排出。此法適用于兔、狗等較大動物。(四)輸尿管插管法：動物麻醉后，固定于手術(shù)臺上。剪毛、消毒，于恥骨聯(lián)合上緣之上在正中線做皮膚切口(長約3～4cm),沿腹中線切開腹壁及腹膜,找到膀胱翻出腹外。辨認(rèn)清楚輸尿管進(jìn)入膀胱背側(cè)的部位(膀胱三角)后，細(xì)心地分離出兩側(cè)輸尿管，分別在靠近膀胱處穿線結(jié)扎。在離此結(jié)扎點(diǎn)約2cm處的輸尿管近腎段下方穿一根絲線。用眼科剪在管壁上剪一斜向腎側(cè)的小切口，分別插入充滿生理鹽水的細(xì)塑料管(插入端剪成斜面)，用留置的線結(jié)扎固定?？梢姷侥虻螐牟骞苤辛鞒?頭幾滴是生理鹽水)，塑料管的另一端與帶刻度的容器相連或接在記滴器上，以便記錄尿量。在適用過程中應(yīng)經(jīng)?；顒右幌螺斈蚬懿骞埽苑雷枞?。在切口和膀胱處應(yīng)蓋上溫濕的生理鹽水紗布。(五)膀胱插管法：腹部手術(shù)同輸尿管插管。將膀胱翻出腹外后，用絲線結(jié)扎膀胱頸部，阻斷它同尿道的通路。然后在膀胱頂部避開血管剪一小口，插入膀胱漏斗，用絲線做以荷包縫合固定。漏斗最好正對著輸尿管的入口處。注意不要緊貼膀胱后壁而堵塞輸尿管。下端接橡皮管插入帶刻度的容器內(nèi)以收集尿液。(六)穿刺膀胱法：動物麻醉后固定于手術(shù)臺上，在恥骨聯(lián)合之上腹正中線剪毛，消毒后進(jìn)行穿刺，入皮后針頭應(yīng)稍改變一下角度，以避免穿刺后漏尿。(七)剖腹采尿法：同穿刺法做術(shù)前準(zhǔn)備，皮膚準(zhǔn)備范圍應(yīng)大一點(diǎn)。剖腹暴露膀胱，操作者的左手用無齒小平鑷夾住一小部分膀胱，右手持針在小鑷夾住的膀胱部位直視穿刺抽取尿液。可避免針頭貼在膀胱壁上而抽不出尿液。(八)反射排尿法：適用于小鼠，因小鼠被人抓住尾巴提起時(shí)排便反射比較明顯。故需采取少量尿液時(shí)，可提起小鼠，將排出的尿液接到帶刻度的容器內(nèi)。六、精液的采集(一)人工陰道采集精液(semen)：體型較大的動物，如狗、豬、羊等,可用一專門的人工陰道套在發(fā)情的雄性動物陰莖上，采集精液。也可將人工陰道置入雌性動物的陰道內(nèi)，待動物交配完畢后，取出人工陰道采集精液。還可將人工陰道固定在雌性動物外生殖器附近，雄性動物陰莖開始插入時(shí),立即將其陰莖移入人工陰道內(nèi)，待其射精完畢后,采集人工陰道內(nèi)的精液。(二)陰道栓采集精液：大小鼠雌雄交配后，24小時(shí)內(nèi)可在雌性動物陰道口出現(xiàn)白色透明的陰道栓，這是雄鼠的精液和雌鼠陰道分泌液在陰道內(nèi)凝固而成的，取陰道栓涂片染色可觀察到凝固的精液。(三)其它采集精液法：將發(fā)情的雌性動物放在雄性動物一起，當(dāng)雄性動物被刺激發(fā)情后，立即將雄性動物分開，再用人工法刺激其射精。也可按摩雄性動物的生殖器或用電刺激其發(fā)情中樞或性敏感區(qū)，使其射精。七、陰道內(nèi)液體的采集(一)棉拭子法：用消毒棉拭子旋轉(zhuǎn)插入動物陰道內(nèi)，然后在陰道內(nèi)輕輕轉(zhuǎn)動幾下后取出，即可進(jìn)行涂片鏡檢。有的適用如大、小鼠等，陰道液較少，取其陰道液時(shí)，可用先浸濕后又?jǐn)D盡無菌生理鹽水的棉拭子取陰道液,這種棉拭子比干棉拭子容易插入陰道。對體型較大的實(shí)驗(yàn)動物，也可先按摩或刺激其陰部，而后再采集其陰道液。(二)滴管法：用消毒的鈍頭滴管吸取少量的無菌生理鹽水插入動物陰道內(nèi)，然后擠出生理鹽水后又吸入，反復(fù)幾次，吸取陰道沖洗液滴于玻片上制片、染色鏡檢。(三)刮取法：用光滑的玻璃小勺或牛角制的小刮片慢慢插入陰道內(nèi)，在陰道壁輕輕刮取一點(diǎn)陰道內(nèi)含物，進(jìn)行涂片鏡檢。八、胸水的采集收集胸水常采用穿刺法。如果實(shí)驗(yàn)不要求動物繼續(xù)存活，也可用處死動物剖胸取胸水。穿刺部位在動物脊側(cè)腋后線胸壁第11～12肋間隙穿刺較安全。此部位是肺最下界之外側(cè)，既可避免損傷肺組織造成氣胸，又易采集在隔肋竇的胸水。此外，也可在腹側(cè)胸壁近胸骨左側(cè)緣第4～5肋間隙穿刺。動物穿刺部位剪毛、消毒，操作者左手拇、食指繃緊肋間穿刺部位的皮膚，用帶夾的橡皮管套上12～14號針頭，沿肋骨前緣小心地垂直刺入。當(dāng)有阻力消失或落空感時(shí)，表示已穿入胸腔。再接上針管，除去夾子，緩緩抽取胸水。如果有條件在穿刺針頭與注射器之間連一個(gè)三通管，但應(yīng)注意正確運(yùn)用三通管。穿刺結(jié)束迅速拔出針頭，輕揉穿刺部位，促進(jìn)針孔閉合并注意消毒。操作中嚴(yán)防空氣進(jìn)入胸腔，始終保持胸腔負(fù)壓。穿刺應(yīng)用手控制針頭的深度，以防穿刺過深刺傷肺臟。九、腹水的采集抽取狗等大動物腹水，讓狗按自然站立位固定，穿刺部位在恥骨前緣與臍之間，腹中線兩側(cè)。剪毛消毒，局部浸潤麻醉。操作者左手姆、食指緊繃穿刺部位的皮膚，右手控制穿刺深度做垂直穿刺。注意不可刺的太深，以免刺傷內(nèi)臟。穿刺針進(jìn)入腹腔后，腹水多時(shí)可見因腹壓高而自動流出。腹水太少可輕輕回抽，并同時(shí)稍稍轉(zhuǎn)動一下針頭，一旦有腹水流出，立即固定好針頭及注射器的位置連續(xù)抽取。抽取大鼠、小鼠的腹水方法簡單，用左手拇指及食指捏住動物頸部皮膚，無名指、小手指及手掌夾住其尾巴固定好動物，使其腹部略朝上，在腹股溝和腹中線之間，消毒皮膚,用8號針頭刺入腹腔,如腹壓高腹水自然流出，如腹水太少，可借助注射器抽取。抽腹水時(shí)注意不可速度太快，腹水多時(shí)不要一次大量抽出，以免因腹壓突然下降導(dǎo)致動物出現(xiàn)循環(huán)功能障礙等問題。十、骨髓的采集1.大鼠、小鼠骨髓的采集：用頸椎脫臼法處死動物,剝離出胸骨或股骨，用注射器吸取少量的Hank平衡鹽溶液，沖洗出胸骨或股骨中全部骨髓液。如果是取少量的骨髓作檢查，可將胸骨或股骨剪斷，將其斷面的骨髓擠在有稀釋液的玻片上，混勻后涂片涼干即可染色檢查。2.大動物骨髓的采集：狗等大動物骨髓的采集可采取活體穿刺方法。先將動物麻醉、固定、局部除毛、消毒皮膚，然后估計(jì)好皮膚到骨髓的距離，把骨髓穿刺針的長度固定好。操作人員用左手把穿刺點(diǎn)周圍的皮膚繃緊，右手將穿刺針在穿刺點(diǎn)垂直刺入，穿入固定后，輕輕左右旋轉(zhuǎn)將穿刺針鉆入，當(dāng)穿刺針進(jìn)入骨髓腔時(shí)常有落空感。狗骨髓的采集，一般采用髂骨穿刺。狗等大動物常用的骨髓穿刺點(diǎn)：胸骨：穿刺部位是胸骨體與胸骨柄連接處。肋骨：穿刺部位是第5～7肋骨各點(diǎn)的中點(diǎn)。脛骨：穿刺部位是股骨內(nèi)側(cè)、靠下端的凹面處。如果穿刺采用的是肋骨，穿刺結(jié)束后要用膠布封貼穿刺孔，防止發(fā)生氣胸。

第七節(jié)實(shí)驗(yàn)動物的處死

當(dāng)實(shí)驗(yàn)中途停止或結(jié)束時(shí)，實(shí)驗(yàn)者應(yīng)站在實(shí)驗(yàn)動物的立場上以人道的原則去處置動物，原則上不給實(shí)驗(yàn)動物任何恐怖和痛苦，也就是要施行安樂死。安樂死是指實(shí)驗(yàn)動物在沒有痛苦感覺的情況下死去。實(shí)驗(yàn)動物安樂死方法的選擇取決于動物的種類與研究的課題。一、蛙類常用金屬探針插入枕骨大孔,破壞腦脊髓的方法處死。將蛙用濕布包住，露出頭部,左手執(zhí)蛙，并用食指按壓其頭部前端，拇指按壓背部，使頭前俯；右手持探針由凹陷處垂直刺入，刺破皮膚即入枕骨大孔。這時(shí)將探針尖端轉(zhuǎn)向頭方，向前深入顱腔，然后向各方攪動，以搗毀腦組織。再把探針由枕骨大孔刺入并轉(zhuǎn)向尾方，刺入椎管，以破壞脊髓。腦和脊髓是否完全破壞,可檢查動物四肢肌肉的緊張性是否完全消失。拔出探針后,用一小干棉球?qū)⑨樋锥伦?以防止出血。操作過程中要防止毒腺分泌物射入實(shí)驗(yàn)者眼內(nèi)。如被射入時(shí)，則需立即用生理鹽水沖洗眼睛。二、大鼠和小鼠1.頸椎脫臼法：右手抓住鼠尾用力向后拉,同時(shí)左手拇指與食指用力向下按住鼠頭。將脊髓與腦髓拉斷，鼠便立即死亡。2.斷頭法：用剪刀在鼠頸部將鼠頭剪掉，鼠立即死亡。3.擊打法：右手抓住鼠尾,提起，用力摔擊其頭部，鼠痙攣后立即死去?；蛴媚惧N用力擊打鼠頭部也可致死。4.急性大出血法：可采用鼠眼眶動脈和靜脈急性大量失血方法使鼠立即死亡。5.藥物致死法：吸入一定量的一氧化碳、乙醚、氯仿等均可使動物致死。三、狗、兔、豚鼠1.空氣栓塞法：向動物靜脈內(nèi)注入一定量的空氣,使之發(fā)生栓塞而死。當(dāng)空氣注入靜脈后，可在右心隨著心臟的跳動使空氣與血液成泡沫狀，隨血液循環(huán)到全身。如進(jìn)到肺動脈，可阻塞其分支，進(jìn)入心臟冠狀動脈，造成冠狀動脈阻塞，發(fā)生嚴(yán)重的血液循環(huán)障礙，動物很快致死。一般兔、貓等靜脈內(nèi)注入20～40ml空氣即可致死。每條狗由前肢或后肢皮下靜脈注入80～150ml空氣，可很快致死。2.急性失血法：先使動物輕度麻醉，如狗可按每公斤體重靜脈注射硫噴妥鈉20～30mg，動物即很快入睡。暴露股三角區(qū)，用鋒利的殺狗刀在股三角區(qū)作一個(gè)約10厘米的橫切口，把股動、靜脈全切斷，立即噴出血液。用一塊濕紗布不斷擦去股動脈切口周圍處的血液和血凝塊,同時(shí)不斷的用自來水沖洗流血,使股動脈切口保持暢通，動物在3～5分鐘內(nèi)即可致死。采用此種方法，動物十分安靜，對臟器無損傷，對活殺采集病理切片標(biāo)本是一種較好的方法。如果處死狗的同時(shí)要采集其血液時(shí)，則在用硫噴妥鈉輕度麻醉后，將狗固定在狗手術(shù)臺上。分離頸動脈，插一根較粗的塑料管，放低狗頭，打開動脈夾，使動脈血流入裝有抗凝血的容器內(nèi)，并不斷搖晃，以防血液凝固。

第八節(jié)轉(zhuǎn)基因動物

1980年底Gordon等人首次將克隆的基因注入小鼠受精卵原核，然后移植于假孕的母鼠輸卵管,培育出第1個(gè)轉(zhuǎn)基因動物。這種將外源性基因用實(shí)驗(yàn)方法插入動物生殖細(xì)胞的基因組而獲得具有插入基因特性，并能正常繁衍的動物稱為轉(zhuǎn)基因動物(transgenicanimals)。轉(zhuǎn)基因技術(shù)是生物學(xué)領(lǐng)域最新重大進(jìn)展之一，已能滲透到生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、畜牧學(xué)等學(xué)科的廣泛領(lǐng)域。轉(zhuǎn)基因動物已成為探討基因調(diào)控機(jī)理、致癌基因作用和免疫系統(tǒng)反應(yīng)的有力工具。同時(shí)人類遺傳病的轉(zhuǎn)基因動物模型的建立，為遺傳病的基因治療打下堅(jiān)實(shí)的理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。轉(zhuǎn)基因技術(shù)涉及外源基因的組建、載體、受體、基因?qū)爰夹g(shù)、供轉(zhuǎn)基因胚胎發(fā)育的體外培養(yǎng)系統(tǒng)和宿主動物等方面的內(nèi)容。一、轉(zhuǎn)移基因(一)轉(zhuǎn)移基因的原理：轉(zhuǎn)基因技術(shù)的理論基礎(chǔ)在于各種生物的遺傳密碼都是統(tǒng)一的。都是以3個(gè)堿基決定一個(gè)氨基酸這樣的密碼形式貯存在DNA鏈上，各物種間形狀的不同僅僅是由于DNA上的四種核苷酸排列次序的不同，同時(shí)各種生物從DNA到蛋白質(zhì)合成都服從“中心法則”,當(dāng)一個(gè)物種的細(xì)胞內(nèi)加入另一物種或人工合成的DNA(即基因)后就可能產(chǎn)生新的性狀。(二)基因的獲得：取自現(xiàn)有的生物體如病毒、細(xì)菌、體細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞的DNA,用限制內(nèi)切酶或外切酶把DNA切割成若干小段,然后再把這些小段利用連接酶分別放入載體中,并建成載體克隆。載體通常是一種獨(dú)立的，能自我復(fù)制的遺傳物質(zhì)，如質(zhì)粒、某些噬菌體和病毒均可作為載體?；虻钠瑪嗫呻S載體復(fù)制，有時(shí)亦可表達(dá)，用DNA或抗體探針做分子雜交試驗(yàn)或ELISA試驗(yàn)篩選出帶有理想基因的克隆,再把理想基因載體放入大腸桿菌等宿主細(xì)胞中擴(kuò)大、增殖,或采用PCR的方法擴(kuò)增。再對擴(kuò)增的DNA片斷進(jìn)行適當(dāng)修飾,例如將一個(gè)單一的基因與經(jīng)選擇的啟動子重組合，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)移，或?qū)⑻囟ǖ目刂菩蛄羞B接到目的基因的結(jié)構(gòu)序列上，從而創(chuàng)造1個(gè)新的重組基因,然后再進(jìn)行轉(zhuǎn)移。理想基因也可用人工合成的辦法獲得，要合成一特定的基因，就是要合成具有一定排列順序的DNA，DNA上四種堿基的配對是非常嚴(yán)格的,腺嘌呤(A)必定和胸腺嘧啶(T)配對，鳥嘌呤(G)必定和胞嘧啶(C)配對，由于蛋白質(zhì)合成不是直接以DNA作為模板,而是以DNA的副本mRNA作為模板，在RNA中，用尿嘧啶(U)代替了胸腺嘧啶(T)。二、基因轉(zhuǎn)移的受體細(xì)胞研究轉(zhuǎn)基因動物的制備，首先要考慮用何種轉(zhuǎn)基因受體細(xì)胞。選擇合適的受體細(xì)胞和可行的基因?qū)胪緩?，是該技術(shù)成功的前提。基因轉(zhuǎn)移的受體細(xì)胞必須是全能細(xì)胞，全能細(xì)胞隨著細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育，可以把其中的基因組貯存的全部遺傳信息擴(kuò)大到生物體所有的細(xì)胞中。除此以外至少是多能細(xì)胞。滿足轉(zhuǎn)基因動物需要的受體細(xì)胞有以下幾種。(一)原生殖細(xì)胞：禽類的原生殖細(xì)胞容易分離、培養(yǎng)和冷凍，所以，這種受體細(xì)胞在禽類動物較易實(shí)現(xiàn)。(二)配子：配子能把自身攜帶的基因組全部信息和外源插入基因序列，完整地貢獻(xiàn)給合子。由于精子可用作有效的轉(zhuǎn)移載體，所以，可以精子作為目的基因的受體。較多的是用重組病毒直接感染精子，精子即可把外源基因傳到合子。(三)受精卵或胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)：精卵結(jié)合形成的單細(xì)胞受精卵，是最常用的外源基因轉(zhuǎn)移的受體；受精后的早期胚胎及囊胚期稍后的胚胎含有的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，該細(xì)胞團(tuán)內(nèi)含有未分化的胚胎干細(xì)胞，也可認(rèn)為是全能的，或至少是多能性的，所以，用該時(shí)期的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)或囊胚期的細(xì)胞作為外源基因的受體細(xì)胞，也可望達(dá)到基因轉(zhuǎn)移的目的。但這種情況下制備的轉(zhuǎn)基因動物多為嵌合體。三、實(shí)驗(yàn)動物的準(zhǔn)備本文主要敘述制備轉(zhuǎn)基因鼠的實(shí)驗(yàn)程序。(一)不育雄性公鼠:結(jié)扎公鼠與母鼠交配以后產(chǎn)生假孕母鼠。受結(jié)扎的公鼠需8周以上，對種系無特殊要求。在正式實(shí)驗(yàn)前，結(jié)扎公鼠需與性成熟的雌性小鼠交配，反復(fù)交配兩次或三次，經(jīng)檢查雌體有陰道栓，但均不懷孕產(chǎn)仔，則證明結(jié)扎成功。結(jié)扎公鼠使母鼠產(chǎn)生陰道栓的能力可維持2年。值得注意的是，如結(jié)扎公鼠與母鼠交配4～6次均不能產(chǎn)生陰道栓，則該公鼠必須更換。(二)假孕雌性母鼠:作為獲得外源基因即轉(zhuǎn)基因胚胎的養(yǎng)母，要求6周齡至5個(gè)月較合適，對種系無特殊要求。其生殖系統(tǒng)的生理狀態(tài)應(yīng)與移進(jìn)胚胎的發(fā)育階段同步化，從而為移植胚胎提供著床和繼續(xù)發(fā)育的生理?xiàng)l件。將選好的成年健康雌性個(gè)體與不育雄性個(gè)體進(jìn)行交配，時(shí)間應(yīng)與供體(取受精卵的雌體)同時(shí)進(jìn)行。一般為下午4點(diǎn)鐘合籠,次日晨選有陰道栓的待用。(三)取受精卵的雌性母鼠：如果無特殊遺傳背景的要求，一般用雜交F1受精卵較為理想。因雜交F1代胚胎的發(fā)育能力和對外環(huán)境的耐受能力都較強(qiáng)，有益于提高移植胚胎的出生率。在對遺傳背景有特殊要求的情況下，供卵母鼠需選擇種系，例如把一種鼠的等位基因轉(zhuǎn)移到另一種不同等位基因的種系，這種卵供體母鼠必須有特定的遺傳背景，因此需用純系鼠。在實(shí)際操作中，一般用4～6周母鼠作為超排卵供體，3～4周母鼠產(chǎn)卵更多但卵細(xì)胞膜脆性較大，在處理過程中易破裂，而6周以后母鼠產(chǎn)卵逐漸減少。(四)與卵供體母鼠交配的正常公鼠：公鼠性成熟約在6～8周，不同種系有些區(qū)別。每個(gè)作超排卵的母鼠與一只公鼠交配，次日上午檢查是否有陰道栓并作記錄。如兩次以上都不能使母鼠有陰道栓，或總的陰道栓產(chǎn)生率低于60～80％，則需更換公鼠。四、基因?qū)氲姆椒?一)顯微注射法：在顯微鏡下，可借助顯微操作儀，將毛細(xì)玻璃管直接插入受精卵的雄原核中(較大的原核),注入特定的外源基因,即為基因顯微注射法。下面把利用顯微注射法制備轉(zhuǎn)基因鼠的方法和步驟簡述如下。1.超數(shù)排卵(超排)與取卵(1)超數(shù)排卵：在雌性動物發(fā)情周期的某一階段,用促性腺激素促使卵巢里大量卵泡成熟并排出，稱超數(shù)排卵。影響母鼠超排因素有母鼠的性成熟程度、營養(yǎng)、體重及母鼠種系。超排的最佳時(shí)間隨種系不同而異,一般在3～5周，超過6周超排卵數(shù)明顯減少。在實(shí)際操作中常取4～6周齡的母鼠作超排卵供體，腹腔注射孕馬血清(PMS)和人絨毛膜促性腺激素(hCG)誘導(dǎo)母鼠排卵。PMS模擬卵泡刺激素(FSH)作用，hCG模擬黃體生成素(LH)的作用。二者注射時(shí)間間隔為42～48h，排卵發(fā)生在注射hCG后10～13h,注射劑量為每鼠5～10u。為了實(shí)驗(yàn)方便，常在下午注射PMS，隔日同一時(shí)間注射hCG，注射hCG后每只母鼠置于一個(gè)單獨(dú)飼養(yǎng)的正常公鼠籠內(nèi)，次日晨檢查陰道栓。(2)取卵：用頸椎脫臼法處死有陰道栓的雌鼠，把完整的輸卵管帶一小段子宮剪下,置于PBS平衡鹽溶液中，在解剖鏡下找出輸卵管傘部，用帶4號針頭的注射器將受精卵沖出，立即將卵子換至新鮮培養(yǎng)液內(nèi)洗滌3～4次即可用于顯微注射。2.注射外源DNA：顯微注射需用顯微操作儀，用來控制顯微持卵針和顯微注射針。持卵針是顯微注射時(shí)固定受精卵的細(xì)玻璃管，管口平滑，通過一注射器控制持卵針，使其吸住要進(jìn)行注射的受精卵。用來注射外源DNA的細(xì)注射針管表面平滑，尖端鋒利,便于注射時(shí)穿過透明帶、細(xì)胞膜等。取已制備好的受精卵細(xì)胞和外源DNA懸液,在倒置顯微鏡下做顯微注射。注射時(shí)先用持卵針吸住受精卵，再用注射針吸取外源DNA懸液,然后推動注射針，使其刺入受精卵的雄原核，將DNA注入。注射完畢，慢慢抽出注射針,將受精卵放入新的培養(yǎng)液中，使其恢復(fù)。一般50～80％的受精卵在顯微注射后仍保持健康。3.注射后受精卵(或胚胎)的移植：注射后單細(xì)胞至桑椹胚的卵(受精后0.5天到3.5天)移植至受孕后的0.5天的假孕鼠的輸卵管，輸卵管移植需用被透明帶包裹的卵。也可將注射有外源DNA的受精卵或桑椹胚體外培養(yǎng)至囊胚，再行移植。顯微注射后3.5天的囊胚移植至受孕后2.5天的假孕鼠子宮，子宮移植不需要有透明帶。此法的優(yōu)點(diǎn)是，在一定設(shè)備和經(jīng)驗(yàn)條件下，實(shí)驗(yàn)過程大為簡化；任何DNA順序都可直接導(dǎo)入原核內(nèi),導(dǎo)入的外源DNA在卵裂前與受體基因組整合,其缺點(diǎn)在于導(dǎo)入的外源DNA通常以多拷貝串聯(lián)的形式隨機(jī)地整合于受體基因組中，妨礙其表達(dá)的正常調(diào)節(jié)。(二)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法：以逆轉(zhuǎn)錄病毒作載體，把重組的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體DNA包裝成高滴度病毒顆粒，感染發(fā)育早期的胚胎，將外源基因?qū)胨拗鞯娜旧w內(nèi)的方法稱為逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法。此法操作簡單，可通過注射將重組病毒轉(zhuǎn)移到囊胚腔內(nèi)，也可將去透明帶的胚胎與分泌重組病毒顆粒的細(xì)胞共培養(yǎng)，以達(dá)到將外源DNA轉(zhuǎn)移到胚胎中去的目的。這一方法的優(yōu)點(diǎn)是，重組逆轉(zhuǎn)錄病毒可同時(shí)感染大量胚胎。感染后的整合率高；外源DNA在受體細(xì)胞基因組中的整合通常是單拷貝的；不需要昂貴的顯微注射設(shè)備。本法的缺點(diǎn)是，由于選用的受體是早期胚胎，不是受精卵，致使外源DNA在動物各種組織中的分布不均,不易整合到生殖細(xì)胞中；由于病毒衣殼大小有限,限制了被導(dǎo)入的外源DNA的大小，一般不超過15Kb。(三)胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法：囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)含有未分化的胚胎干細(xì)胞。體外建株的胚胎干細(xì)胞稱為EK細(xì)胞(embryonickaryotypecell)或(embryonicstemcell)。如果將EK細(xì)胞移植到正常發(fā)育的囊胚腔中，它們能很快地與受體的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)聚集在一起，參與正常的胚胎發(fā)育。用重組的逆轉(zhuǎn)錄病毒作為載體感染EK細(xì)胞，再將此EK細(xì)胞移植入受體囊胚腔，可發(fā)育成攜帶著特定外源DNA的個(gè)體。采用這一方法的優(yōu)點(diǎn)是，外源DNA的整合率高；整合在生殖細(xì)胞中的比例也很高。缺點(diǎn)是，EK細(xì)胞株不易建立，長期培養(yǎng)后出現(xiàn)細(xì)胞分化現(xiàn)象；生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因動物都是嵌合體。(四)精子載體法將外源DNA與精子一起孵育，精子可捕獲外源DNA，并通過受精過程將外源DNA導(dǎo)入受精卵。此法不僅可免去復(fù)雜而昂貴的設(shè)備，且可省去不少繁雜的操作和條件準(zhǔn)備。但該法有些結(jié)果不能重復(fù)。此外，還有一些其它的方法，都有不同的優(yōu)缺點(diǎn)。五、轉(zhuǎn)基因鼠的檢測待假孕母鼠產(chǎn)出幼仔后,可用幼鼠尾巴提取DNA;對于一些基因調(diào)控研究,需要盡快獲得信息而暫不需保留轉(zhuǎn)基因鼠，從胎鼠組織或幼鼠尾巴提取的DNA,可用PCR、Dotblot(斑點(diǎn)雜交)、Southernblot(Southern轉(zhuǎn)移)等多種方法分析以確定是否轉(zhuǎn)基因鼠。六、基因轉(zhuǎn)移后的存在方式及表達(dá)(一)外源基因?qū)牒蟮拇嬖诜绞剑和庠椿虮粚?dǎo)入受體細(xì)胞后，在受體細(xì)胞內(nèi)的存在方式有三種：1.非同源重組。大多數(shù)外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞后,與受體細(xì)胞染色體的某一位點(diǎn)隨機(jī)整合，這樣可帶來正?；虻牟迦?、缺失、易位等突變。2.同源重組。導(dǎo)入的外源DNA與受體細(xì)胞染色體的DNA通過順序取代或順序插入實(shí)現(xiàn)同源重組。通過同源重組有可能導(dǎo)致受體細(xì)胞正常的基因發(fā)生突變，當(dāng)然，也有可能代替原來的有遺傳缺陷的遺傳基因，從而糾正遺傳缺陷。3.游離存在。外源基因沒有整合到受體細(xì)胞中,而是以附加體的形式游離在受體細(xì)胞內(nèi)，能自我復(fù)制，并能100％的傳給下一代。(二)外源基因?qū)牒蟮谋磉_(dá)：外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞后能否表達(dá)，是受許多因素影響的。1.外源基因本身的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。2.附帶的原核載體順序。研究發(fā)現(xiàn)，原核載體的存在對α-甲胎蛋白、β-珠蛋白等基因的表達(dá)具有明顯的抑制作用，而對免疫球蛋白和膠原蛋白基因的抑制不明顯。3.染色體位置。外源基因在受體動物細(xì)胞染色體上整合部位的基因環(huán)境對外源基因表達(dá)的影響很大。4.甲基化。被轉(zhuǎn)移的基因容易甲基化而失活。外源基因在受體細(xì)胞中的表達(dá)方式表現(xiàn)為組織特異性和發(fā)育階段特異性。組織特異性表達(dá)是由于某些調(diào)節(jié)元件如啟動子和增強(qiáng)子的作用造成的。比如，免疫球蛋白基因只在B細(xì)胞中表達(dá)，原因是免疫球蛋白基因的啟動子只存在于B淋巴細(xì)胞內(nèi)，這是一類只在專一細(xì)胞中表達(dá)的啟動子；另有一類可在多種組織細(xì)胞中表達(dá)的啟動子，比如，人生長激素基因分別在肝與腎、淋巴器官和肌肉中表達(dá)。發(fā)育階段特異性表達(dá)是指轉(zhuǎn)基因在個(gè)體發(fā)育中的表達(dá)具有嚴(yán)格的時(shí)空特性，受到精細(xì)的調(diào)控。(宋淑霞)

第八節(jié)轉(zhuǎn)基因動物1980年底Gordon等人首次將克隆的基因注入小鼠受精卵原核，然后移植于假孕的母鼠輸卵管，培育出第1個(gè)轉(zhuǎn)基因動物。這種將外源性基因用實(shí)驗(yàn)方法插入動物生殖細(xì)胞的基因組而獲得具有插入基因特性，并能正常繁衍的動物稱轉(zhuǎn)基因動物(transgenicanimals)。轉(zhuǎn)基因技術(shù)是生物學(xué)領(lǐng)域最新重大進(jìn)展之一，已能滲透到生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、畜牧學(xué)等學(xué)科的廣泛領(lǐng)域。轉(zhuǎn)基因動物已成為探討基因調(diào)控機(jī)理、致癌基因作用和免疫系統(tǒng)反應(yīng)的有力工具。同時(shí)人類遺傳病的轉(zhuǎn)基因動物模型的建立，為遺傳病的基因治療打下堅(jiān)實(shí)的理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。轉(zhuǎn)基因技術(shù)涉及外源基因的組建、載體、受體、基因?qū)爰夹g(shù)、供轉(zhuǎn)基因胚胎發(fā)育的體外培養(yǎng)系統(tǒng)和宿主動物等方面的內(nèi)容。一、轉(zhuǎn)移基因(一)轉(zhuǎn)移基因的原理：轉(zhuǎn)基因技術(shù)的理論基礎(chǔ)在于各種生物的遺傳密碼都是統(tǒng)一的。都是以3個(gè)堿基決定一個(gè)氨基酸這樣的密碼形式貯存在DNA鏈上，各物種間形狀的不同僅僅是由于DNA上的四種核苷酸排列次序的不同，同時(shí)各種生物從DNA到蛋白質(zhì)合成都服從“中心法則”，當(dāng)一個(gè)物種的細(xì)胞內(nèi)加入另一物種或人工合成的DNA(即基因)后就可能產(chǎn)生新的性狀。(二)基因的獲得：取自現(xiàn)有的生物體如病毒、細(xì)菌、體細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞的DNA，用限制內(nèi)切酶或外切酶把DNA切割成若干小段，然后再把這些小段利用連接酶分別放入載體中，并建成載體克隆。載體通常是一種獨(dú)立的，能自我復(fù)制的遺傳物質(zhì)，如質(zhì)粒、某些噬菌體和病毒均可作為載體?；虻钠瑪嗫呻S載體復(fù)制，有時(shí)亦可表達(dá)，用DNA或抗體探針做分子雜交試驗(yàn)或ELISA試驗(yàn)篩選出帶有理想基因的克隆，再把理想基因載體放入大腸桿菌等宿主細(xì)胞中擴(kuò)大、增殖，或采用PCR的方法擴(kuò)增。再對擴(kuò)增的DNA片斷進(jìn)行適當(dāng)修飾，例如將一個(gè)單一的基因與經(jīng)選擇的啟動子重組合，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)移，或?qū)⑻囟ǖ目刂菩蛄羞B接到目的基因的結(jié)構(gòu)序列上，從而創(chuàng)造1個(gè)新的重組基因，然后再進(jìn)行轉(zhuǎn)移。理想基因也可用人工合成的辦法獲得，要合成一特定的基因，就是要合成具有一定排列順序的DNA，DNA上四種堿基的配對是非常嚴(yán)格的，腺嘌呤(A)必定和胸腺嘧啶(T)配對，鳥嘌呤(G)必定和胞嘧啶(C)配對，由于蛋白質(zhì)合成不是直接以DNA作為模板，而是以DNA的副本mRNA作為模板，在RNA中，用尿嘧啶(U)代替了胸腺嘧啶(T)。二、基因轉(zhuǎn)移的受體細(xì)胞研究轉(zhuǎn)基因動物的制備，首先要考慮用何種轉(zhuǎn)基因受體細(xì)胞。選擇合適的受體細(xì)胞和可行的基因?qū)胪緩?，是該技術(shù)成功的前提?；蜣D(zhuǎn)移的受體細(xì)胞必須是全能細(xì)胞，全能細(xì)胞隨著細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育，可以把其中的基因組貯存的全部遺傳信息擴(kuò)大到生物體所有的細(xì)胞中。除此以外至少是多能細(xì)胞。滿足轉(zhuǎn)基因動物需要的受體細(xì)胞有以下幾種。(一)原生殖細(xì)胞：禽類的原生殖細(xì)胞容易分離、培養(yǎng)和冷凍，所以，這種受體細(xì)胞在禽類動物較易實(shí)現(xiàn)。(二)配子：配子能把自身攜帶的基因組全部信息和外源插入基因序列，完整地貢獻(xiàn)給合子。由于精子可用作有效的轉(zhuǎn)移載體，所以，可以精子作為目的基因的受體。較多的是用重組病毒直接感染精子，精子即可把外源基因傳到合子。(三)受精卵或胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)：精卵結(jié)合形成的單細(xì)胞受精卵，是最常用的外源基因轉(zhuǎn)移的受體；受精后的早期胚胎及囊胚期稍后的胚胎含有的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞，也可認(rèn)為是全能的，或至少是多能性的，所以，用該時(shí)期的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)或囊胚期的細(xì)胞作為外源基因的受體細(xì)胞，也可望達(dá)到基因轉(zhuǎn)移的目的。但這種情況下制備的轉(zhuǎn)基因動物多為嵌合體。三、實(shí)驗(yàn)動物的準(zhǔn)備(一)不育雄性動物:選擇8周齡以上性成熟的健壯雄性小鼠，結(jié)扎其輸精管，2～3周后待其恢復(fù)健康，再與性成熟的雌性小鼠交配，反復(fù)交配兩次或三次，經(jīng)檢查雌體有陰道栓，但均不懷孕產(chǎn)仔，則證明結(jié)扎成功。(二)假孕雌性動物:作為獲得外源基因即轉(zhuǎn)基因胚胎的養(yǎng)母，要求6周齡至5個(gè)月較合適。其生殖系統(tǒng)的生理狀態(tài)應(yīng)與移進(jìn)胚胎的發(fā)育階段同步化，從