1范圍本規(guī)程規(guī)定了古菌、細菌、真菌、病毒（種）純度檢測的程序和方法。本規(guī)程適用于從事微生物菌種資源保藏及研究的機構、大學、企業(yè)、個人等。2術語、定義下列術語和定義適用于本規(guī)程2.1純度檢測puritycheck指通過適當的方法檢測菌種是否為純培養(yǎng)物。2.2純培養(yǎng)pureculture由單個細胞的后代組成的培養(yǎng)物，即單細胞培養(yǎng)物或無性繁殖系。通常是由挑取單個菌落或利用單胞分離技術，移種繁殖獲得。3.菌種的純度檢測3.1古菌和細菌的純度檢測3.1.1菌落形態(tài)在特定的培養(yǎng)基上，將待檢測培養(yǎng)物稀釋涂布或平板劃線，適宜培養(yǎng)后，同一平板上的單菌落的大小、形狀、顏色、質地、光澤等是否相似；對于兩種或以上形態(tài)的出發(fā)菌株，應再分別挑取單菌落劃線或稀釋涂布培養(yǎng)，檢測是否重復出現相同特征。3.1.2細胞形態(tài)對數生長期的培養(yǎng)物革蘭氏染色反應應呈現一致性；細胞形狀、大小、莢膜等特征應相似3.1.3芽抱大小、位置、形狀宜檢測樣品是否形成芽抱，對形成芽抱的菌種，其芽抱大小、位置、形狀應相似。3.2放線菌菌種純度檢測3.2.1菌落形態(tài)在特定的培養(yǎng)基上，將待檢測培養(yǎng)物稀釋涂布或平板劃線，挑取單菌落，適宜培養(yǎng)后，在同一平板上單菌落形狀、大小、表面狀況、質地、光澤、顏色等應相似。如懷疑為細菌污染，則30°C液體培養(yǎng)24小時，培養(yǎng)液不應渾濁，如渾濁則視為細菌污染。3.2.2培養(yǎng)特征分別接種三種以上培養(yǎng)基，在三種以上培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征應相同，包括氣生菌絲、基內菌絲、可溶性色素的顏色等。3.2.3抱子絲及抱囊在特定的培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度及培養(yǎng)時間等條件下，抱子著生方式、抱子絲形態(tài)及其顏色或抱囊著生位置（氣絲或基絲）、抱囊的形狀，大小應呈現出一致性。3.3酵母菌種純度檢測3.3.1菌落形態(tài)應對菌落形態(tài)相似性進行檢測。在特定的培養(yǎng)基上，通過對待檢測菌株進行稀釋或劃線涂布平板獲取單菌落，一定的培養(yǎng)條件下，比較同一平板內，菌落的大小、形狀、顏色、隆起、表面狀況、質地、光澤等應一致。3.3.2個體形態(tài)應對檢測樣品的個體形態(tài)進行檢測。在指定的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件下，細胞形狀、大小及細胞的增殖方式應一致。3.3.3繁殖方式酵母繁殖的方式應一致，如是芽殖，出芽的方位、數量應一致。3.4絲狀真菌菌種純度檢測3.4.1菌落特征菌落的形態(tài)等表觀特征應一致。3.4.2菌絲特征在特定的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下，菌絲分隔、菌絲形態(tài)等應一致。3.4.3其他主要顯微特征應一致3.4.4檢測是否有細菌污染3.4.5對于外觀上不能確定菌種純度的，利用單胞分離技術獲得純培養(yǎng)物進行對比，其菌絲、抱子等特征應與原始菌株的描述一致。3.5病毒的純度檢測3.5.1純粹檢查應將待檢病毒液直接接種含硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基（T.G）、酪蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基（G.A）、葡萄糖蛋白胨湯。通過一定溫度時間培養(yǎng)后，檢查結果應無細菌生長為純粹。3.5.2支原體檢查檢測由禽胚組織或其細胞所培養(yǎng)的病毒應用改良Frey氏培養(yǎng)基。檢測其它培養(yǎng)方法所得病毒應用支原體培養(yǎng)基。任何一次瓊脂平板上出現支原體菌落，判為陽性。陽性對照中至少有一個平板長菌落，而陰性對照中無菌落生長，則檢驗有效。3.5.3外源病毒檢查病毒類制品在毒種選育和生產過程中，經常使用動物或細胞基質培養(yǎng)，因此，有可能造成外源因子（特別是外源病毒因子）的污染。為了保證制品質量，需要對毒種和細胞進行外源因子檢測。3.5.3.1對病毒主種子批或工作種子批，應抽取足夠檢測試驗需要量的供試品進行病毒外源因子檢測。在試驗前應用特異性抗體（血清）中和本病毒（或單克隆抗體），所用的抗體免疫源應采用與生產疫苗（或制品）不同種而且無外源因子污染的細胞（或動物）制品。如果病毒曾在禽類組織或細胞中繁殖過，則抗體不能用禽類來制備。若用雞胚，應來自SPF雞群。以下方法可以選擇一種或多種進行。3.5.3.1.1動物試驗法3.5.3.1.1.1小鼠試驗法取15-20g小鼠至少10只，用經抗血清中和后的病毒懸液，每只腦內接種0.03ml，同時腹腔接種0.5m1。至少觀察21天。在觀察期內至少有80%最初接種的小鼠存活，試驗才有效。如果沒有小鼠出現病毒感染，為符合要求。解剖所用在試驗24小時后死亡或有患病體征的小鼠，直接觀察期病理改變，并將有病變的相應的組織懸液通過腦內和顱腔接種另外至少5只15-20g小鼠，并觀察21天，如果沒有小鼠出現病毒感染，則符合要求。3.5.3.1.1.2乳鼠試驗法取出生后24小時內的乳鼠至少10只，用經抗血清中和后的病毒懸液，腦內接種0.01ml,同時腹腔接種至少0.1m1。每天觀察，至少14天。在觀察內至少有80%最初接種的乳鼠存活，試驗才有效。如果沒有小鼠出現病毒感染，為符合要求。解剖所有在試驗24小時后死亡或有患病體征的乳鼠，直接肉眼觀察其病理改變，并取有病變的相應的組織和腦、脾制備成懸液通過腦內和腹腔接種另外至少5只出生后24小時內乳鼠，并每天觀察至接種第14天，如果沒有小鼠出現病毒感染，則符合要求。3.5.3.1.2細胞培養(yǎng)法3.5.3.1.2.1非血吸附檢查用經抗血清中和后的病毒懸液，接種于生產用的同種的細胞。細胞至少接種6瓶，每瓶病毒懸液接種量不少于培養(yǎng)液總量的25%。于36±1°C培養(yǎng)，觀察14天，必要時可更換細胞培養(yǎng)液，未見細胞病變（CPE）為陰性，符合要求。3.5.3.1.2.2血吸附病毒檢查上述接種病毒的各個細胞于第6-8天后和第14天，取出2瓶進行血吸附病毒檢查。用0.2%—0.5%雞和豚鼠紅細胞混合菌懸液覆蓋于細胞表面，分別置于2—8°C,20—25°C,30分鐘后顯微鏡下觀察，未見血球吸附現象為陰性，符合要求。3.5.3.1.3雞胚檢查法在禽類組織或細胞中繁殖過的病毒種子需用雞胚檢查禽類病毒的污染。選用9—11日和5—7日齡兩組SPF雞胚，每組至少5只，分別于尿囊腔和卵黃囊接種經抗體血清中和后的病毒懸液，每胚0.5m1。孵育7日后，取尿囊液用豚鼠和雞血細胞混合懸液做血球凝集試驗應為陰性。被接種的雞胚至少80%存活7天，試驗有效。3.5.3.2生產用細胞外源因子檢查3.5.321細胞直接觀察每批生產用細胞應留取5%（或不少于500ml），細胞懸液不接種病毒，作為對照細胞加入與疫苗生產相同的細胞維持液，置于與疫苗生產相同的條件下培養(yǎng)，觀察14天，在顯微鏡下觀察是否有細胞病變（CPE）出現，