核酸檢測技術及其在國內外血液篩檢中的應用輸血相關傳染病的預防和掌握已經成為全社會關注的焦點,技術的引進是進一步提高血液安全性的重要一環(huán)。本文就病原體核酸檢測技術(nucleicacidtesting,NAT)及其在國內外血液篩檢中的應用狀況和結果作一介紹,并對該方法在我國推廣和應用的必要性和可行性作初步探討。NAT酶免檢測(EIA)技術已經廣泛運用于血液篩檢,該方法的靈敏度和特異性也HBV、HCVHIV1∶66000、1∶1030001∶676000[1]。這些危急的主要緣由是:病毒感染者“窗口期”獻血,病毒變異,是指從感染病原開頭,直至用某種檢測方法能夠檢測到該病原存在為止的這一段HBsAg、抗-HIV、抗-HCV45-56ｄ22ｄ72ｄ[4,5],故美國90%以上輸血傳播HIVHBV75HCV[6]原或抗體血清學檢測不能有效地保障血液安全。NATNATHBV、HCV和HIV感染的平均“窗口期”縮短9d(縮短“窗口期”20%)、59d(82%)和11d(50%[5,]NAT31504HCVRNANAT性疾病[9]。因此,NAT的引入可使輸血傳播疾病的危急性降到最低[10]。NAT1985年具有劃時代意義的聚合酶鏈反響(polymerasechainreaction,PCR)PCRNAT[11這些技術靈敏度和特異性或高或低,操作或簡潔或簡單,適合在各PCRTMAPCRDNA特異性和快速簡便等優(yōu)勢得到了廣泛的應用。通過簡潔的技術改進和聯(lián)合,涌現(xiàn)RNAPCR(RTPCR)、敏感性和特PCR)PCR、檢PCR(PCRELISA)、PCR酸探針雜交技術(PCRSSOP)PCRPCR目前在臨床檢測中使用較多的是熒光定量PCR,主要用于各種傳染病的診斷、DNAPCR參加濃度的內標或外標,便能進展定量檢測。由于該方法實現(xiàn)了反響體系的全封閉和操作的全自動,不僅削減了污染,還提高了效率。雖然國內很多生物技術企業(yè)已經利用熒光PCRNAT止正式通過美國FDA2RocheCOBASAmpliHIV1/HCV,FDA50copies/ml>95%PCR20copies/ml般都很難滿足95%檢出低病毒載量標本的要求。信任不斷提高檢測靈敏度,早日研發(fā)并注冊成功我國自己的NAT血液篩檢用試劑也是國內生物技術企業(yè)的進展目標。轉錄介導的擴增方法包括轉錄介導的擴增系統(tǒng)(transcriptionmediatedamplification,TMA)和核酸序列依靠擴增系統(tǒng)(nucleicacidｓsequencebased amplification,。TMA是一種利用Money鼠白血病病毒〔MMLV〕逆轉錄酶和T7RNA多聚酶2種酶的共同作用,在等溫條件下來擴增RNA或DNA的反響系統(tǒng),主要擴增原理為:目標序列在逆轉錄酶作用下,以引物為引導進展逆轉錄,逆轉錄酶的RNA酶性將雜合鏈上的RNA降解以后,合成雙鏈的DNA,并在T7RNA多聚酶作用下,轉錄出成千上萬個目標RNA序列,這些RNA又可以作為模板進展下一個循環(huán),整個是一個自催化過程。NASBA的原理與TMA相像,只是在核酸提取和擴增產物檢測的方法上有所不同。這兩種方法的特異性強,靈敏度高,反響條件簡潔,擴增效率高,無需特地的擴增儀器,且因整個反響在1個試管中進展,也削減了污染。NATDNAsignalamplificationassay,bDNA)、環(huán)介導的等溫擴增技術(loopmediatedisothermalamplification,LAMP)、連接酶鏈技術(ligasechainreaction,LCR)和鏈置換擴增(stranddisplacementamplification,SDA)等。這些技術或由于自身緣由,或由于剛研發(fā)出來尚未進入bDNA1995年左右推出,其信號放大是通過堿性磷酸酶(AP)標記的探針雜交結合到一個樹枝狀核酸枝狀體上而實現(xiàn)的。bDNADNAbDNA待測核酸,其檢測靈敏度遠遠低于PCR,故該項技術實際上不適合用于血液篩檢,bDNAHBVHCVNAT在國內外血液篩檢中的應用開展NAT檢測的國家及所用的技術NAT在國外特別是一些興旺國家和地區(qū)已普遍應用于血液篩檢[1例如,日本是世界HBV、HCV、HIVNAT[1]加坡、中NAT1997起就開頭NAT2023NATFDANAT1：國家或地區(qū)技術混合檢測／單檢?Germany(1997國家或地區(qū)技術混合檢測／單檢?Germany(1997?PCR?Pool1999〕?Netherlands(1997〕?PCR?Pool?U.K.英國(2023〕?PCR?Pool?Switzerland?PCR?Pool?Japan日本(1997年１月起對原料?PCR?Pool漿；1999〕?PCR?pool?Canada?TMA/PCR?pool/IDT?韓國〔20231〕?USA(19993〕?TMA?IDTNewZealandTMApool/IDTAustraliaTMAIDTSingaporeTMAIDTPortugalTMA/PCRPool/IDTFrance(2023〕TMA/PCRPoolSpainTMA/PCRPoolItalyTMApoolHongKongTMA/PCRPool?臺灣〔2023〕?TMA/PCR?Pool各國承受的技術各不一樣〔參見表1。日本使用的方法為羅氏公司與日本NATＴＭNPX〔PCRHBV,HCVHIVChironTMATMA(ABC)系統(tǒng)則使用羅氏COBASAmpliScreen;荷蘭及局部歐洲國家將荷蘭阿克蘇公司推出的NucliesensCOBASAmpliScreen擴增體系結合起QiagenScreen進展評估,目的是尋求一種最適合的NAT技術,既保障血液安全,又能保證血液的準時供給,還要做到省時省力。NAT的血液安全水平已經大幅度提高,但是由于EIA“窗口期”所致的漏檢概率仍舊2。1/34.8HIV-1NAT+1/34.8HIV-1NAT+6160121751/266.9國家試劑檢測方式NAT單獨陽性檢出狀況文獻美國ChironProcleixChiron: 16人1999.03-2023.03:14TMAHIV-1/HCVassay;Roche Cobas發(fā)光檢測；Roche：24人份HCVNAT+：170/39,721,4041/23萬；HIV-1NAT+12/37,164,054AmpliScreenHIV-1 and HCV混 合 ，PCR-ELISA1/310萬tests日本 Multiplex1999711999.7–2023.4：文 獻HBV/HCV/HIV-1日-20231月HBVNAT+15,16reagent(Roche31日，500人：26／25609771/9.8與日本共同研制)份；HCVNAT+202321：9／25609771/28.450人份HIV-1NAT+：0／256.1混樣;2023.2.1–2023.12.31：合格血液檢測HBVNAT+308160121751/5.2HCVNAT+46／16012175,ChironProcleix2個點單人份，2023.06.07-2023.11.14：17利亞TMA HIV-1/HCV316人份，及個人assay;TMA, 化學發(fā)萬；交 流光檢測；HIV-1 NAT+1/4,489,5504〔1/449.04,489,55018〕中歐HCVPCR:RocheCobasAmplicon;96人份混合HCVNAT+：6/360萬，1/60萬；HIVNAT+：2/360萬，1/180萬19HIVPCR:自己研PCR法國ChironProcleix單檢，或8人2023.07-2023.12：20TMAHIV-1/HCV；16人份,HCVNAT+：3/6141/205或RocheCobas不考慮血清學HIVNAT+：2/6141/307Nuclisens核酸提取儀坡ChironProcleixTMA HIV-1/HCVassay;單人份檢測2023.10-2023.10:HCVNAT+：4／304,715,即萬；1/7.6個人溝通〔21〕萬韓國ChironProcleix16人份2023.06.14-2023.12.03個人交TMAassay;HIV-1/HCV估：單采獻漿者24599，獻血者15597:流〔22〕HCVNAT+：1/40196；HIVNAT1/40196；2023.01.01南非ChironProcleix單人份199923TMAHIV-1/HCVHIVNAT+:2/197091/1.0assay;HCVNAT＋:0/19709AmpliscreenHIV-1AmpliscreenHIV-1andHCV結合theOrganon我國核酸篩查技術應用的問題很難掌握。有關我國獻血者及原料漿中NAT34。3NAT檢測爭論的狀況單位深圳保安區(qū)中心血站廈門血液

試劑美 國BiotronicsTechHBV,HCVAmpliSensor試劑盒自行設計引

檢測方式2015000rpm離心濃縮，半自動熒光定量PCR50人份混合，

NATHCVNAT+:1/8805(ALT390U/L)；HBVNAT+:抗-HBc陽性中：5/495(1％)HCVNAT+:2/10000,即

文獻2425中心物，HCVNucliSensExtractorNASBA技ECL檢測1／5000江蘇省血液中心HCV試劑盒RNA單人份，PCR,電泳HCVNAT+:／37526上海血液美國Chiron8人份或24人份混HCVNAT+:0／103539;7中心ProcleixHIV-1/HCV光檢測HIVNAT+:0／103539;北京血液匹 基2426000gHCVNAT+:0/34373;27中心HCV/HIV-1熒光PCR檢測試劑Roche提取柱，熒光PCRHIVNAT+:0/34373多單位參與的國際合作深圳血液中心沈陽血液中心

美國ChironProcleixHIV/HCVRocheAmpliscreenHBV/HCV/HIV匹基HCV熒光PCR測試劑

16自動混樣；TMA化學發(fā)光檢測24人份混合，STAR2023自動混樣;RocheMPLC自動提取核酸；RocheCOBASAmplicor擴增和檢測2426000gRoche提取柱，熒光PCR

HCVNAT+：2/802591個ALT254IU/ml)HIVNAT+：0/80259HCVNAT+:0/16512;HIVNAT+:0/16512;HBVNAT+:8/16512,即1/2064HCVNAT+:0/8.3

2829人溝通(深圳2023年５月)陽血液中心，李劍平博士，20236中山中心單人份，PCR,電泳HCVNAT+:30血站及蕪77/28098(1/365)湖中心血正業(yè)HCVPCR站表4 國內原料漿開展NAT檢測爭論狀況單位試劑檢測方式NAT文獻中國藥品匹基HCV/HIV-12426000gHCVNAT+:0/19196;31生物制品檢定所熒光PCR核酸檢測試劑離心濃縮，Roche酸提取柱，熒光PCRHIVNAT+:0/19196上海萊士血制品匹 基HBV/HCV/HIV-1熒光PCR核酸檢測試劑48離心濃縮，Roche酸提取柱，熒光PCRHBVNAT+:1/1401718(1/140HCVNAT+:31/1401718(1/4.532HIVNAT+:3/1250007(1/41.7中國藥品生物制品檢定所

ChironProcleixHCV/HIV-1Assay

16人份混合，TMA技HCVNAT+:1/10032; 個人溝通〔檢術；化學發(fā)光檢測 HIVNAT+:0/10032 定所白堅石20231〕我國核酸篩查技術應用工作小結：NATNATHCV NAT+檢出率結果差異很大，從1/365〔國產試劑,電泳〕～1/4.0NATHCVNAT+:1/1.0～1/4.5NAT+：1/41.7；HBVNAT+：1/140〔48。必需重視核酸檢測的質量掌握體系：留意避開穿插污染：檢測方法：傳統(tǒng)的電泳檢測為開放式，不適合；嚴格的核酸檢測試驗室設置和治理。留意試劑質量：為適應血液混樣檢測對靈敏度的要求，一些國產血篩試〔如匹基〕在考察期間不錯。但仍有待完善，表現(xiàn)在：波動?。粐a試劑批間差異問題；特異性問題。因此存在假陰性問題。國產試劑尚在起步階段，尚不能實現(xiàn)自動化，沒有配套軟件。標本留樣和處理：也是核酸檢測質量掌握體系中的重要環(huán)節(jié)，否則在檢NAT血液核酸篩查進展趨勢NATNAT