菠菜actin基因片段的克隆植物基因組DNA提取DNA的PCR擴增及其產(chǎn)物回收DNA與載體的連接和轉(zhuǎn)化是基因工程中最基本的操作技術(shù)主要包括以下實驗技術(shù)：基因工程狹義：人工創(chuàng)造DNA分子新組合的技術(shù)（即重組DNA技術(shù)）廣義：重組DNA技術(shù)及其產(chǎn)業(yè)化設(shè)計和應(yīng)用，包括上游技術(shù)和下游技術(shù)兩大部分。上游技術(shù)是指重組DNA技術(shù)；下游技術(shù)則涉及到基因工程菌或基因工程細胞的大規(guī)模培養(yǎng)以及基因表達產(chǎn)物的分離和純化，動、植物轉(zhuǎn)基因等DNA重組微生物發(fā)酵分離、提純產(chǎn)品生物反應(yīng)器狹義轉(zhuǎn)基因廣義+提取DNA篩選文庫/PCR連接載體細胞DNA載體重組載體宿主擴增（基因）酶切基因基因轉(zhuǎn)化+上游技術(shù)下游為基因測序和其它研究和應(yīng)用準(zhǔn)備高質(zhì)量的基因片段。YourTextYourTextYourTextPCR及檢測連接轉(zhuǎn)化篩選實驗流程及原理YourText回收鑒定YourText測序DNA提取及檢測產(chǎn)物回收等引物…………….....……………………..……5’-3’--3’-5’

引物設(shè)計正向引物(Forward)→←反向引物(Reverse)正向引物：TCATTCTCTGATCCGTGCAG1.對引物的一般要求

(1)長度一般為18-27nt(2)GC含量為40-60%(3)引物在模板內(nèi)沒有其它高度相似的序列

(4)引物間和引物內(nèi)不形成二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)

(5)引物之間的Tm值應(yīng)基本相同（

Tm估計值與計算方法有關(guān)）

(6)3’端避免出現(xiàn)3個及以上連續(xù)的相同堿基反向引物：AGGCAAGCTTTTCCTTCACA3.引物設(shè)計工具（1）引物設(shè)計軟件

Oligo6.44

PrimerPremier

5.0

Dnastar（2）網(wǎng)上引物設(shè)計工具

Primer3

/primer3/input.htm2.

DNA序列的來源

（1）查詢序列數(shù)據(jù)庫（2）查閱科技文獻（3）測序TheNationalCenterforBiotechnologyInformation（http://www.ncbi.）例1：查詢Spinaciaoleraceaactingene序列2023/2/1/primer3/input.htm例2：利用Primer3設(shè)計引物①復(fù)制和粘貼DNA序列①②②③②勾選所需的引物③獲取引物

連接Taq酶能夠在PCR產(chǎn)物的3’末端加上一個非模板依賴的A；

T載體是一種帶有3’T突出端的載體；在連接酶作用下，可以快速地、一步到位地把PCR產(chǎn)物直接插入到質(zhì)粒載體的多克隆位點（MCS）中。

高效克隆PCR產(chǎn)物（TACloning）的專用載體

轉(zhuǎn)化細胞經(jīng)過一些特殊方法如電擊法,化學(xué)試劑法（CaCl2)等的處理后,細胞膜的通透性發(fā)生了暫時性的改變，成為能允許外源DNA分子進入的感受態(tài)細胞。3、鑒定--

α-互補質(zhì)粒載體帶有一個大腸桿菌的DNA的短區(qū)段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的調(diào)控序列和前146個氨基酸的編碼信息。在這個編碼區(qū)中插入了一個多克隆位點（MCS），它并不破壞讀框，但可使少數(shù)幾個氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影響功能。宿主細胞存在可編碼β-半乳糖苷酶C端部分的序列。它們同時存在時，能恢復(fù)lacZ酶的活性，稱為α-互補。在誘導(dǎo)劑IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在時產(chǎn)生藍色菌落，因而易于識別。當(dāng)外源DNA插入到質(zhì)粒的多克隆位點后，幾乎不可避免地導(dǎo)致無α-互補能力的氨基端片段，使得帶有重組質(zhì)粒的細菌形成白色菌落。Yo