DNA的電泳及PCR分析實驗二孔忠新2010.12.06實驗目的：學習并掌握DNA的電泳原理與技術學習并通過操作掌握基于DNA的聚合酶鏈式反應（PCR）基本技術瓊脂糖凝膠電泳凝膠的EB染色EB使用時的配制、貯存及使用EB常用水配制成10mg/ml的貯存液，于室溫保存在棕色瓶或用鋁箔包裹的瓶中，使用終濃度為0.5μg/ml。聚合酶鏈反應PolymeraseChainReaction,PCR“經過DNA變性，與合適的引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復該過程便可克隆tRNA基因”?！狵orana于1971年1985年美國PE-Cetus公司人類遺傳研究室的Mullis等發(fā)明了具有劃時代意義的聚合酶鏈反應。其原理類似于DNA的體內復制，只是在試管中給DNA的體外合成提供以致一種合適的條件：

模板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合適的緩沖體系，DNA變性、復性及延伸的溫度與時間。具有特異、敏感、產率高、快速、簡便、重復性好、易自動化等突出優(yōu)點；能在一個試管內將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數小時內擴增至十萬乃至百萬倍,使肉眼能直接觀察和判斷；可從一根毛發(fā)、一滴血、甚至一個細胞中擴增出足量的DNA供分析研究和檢測鑒定。PCR技術是生物、醫(yī)學等領域中的一項革命性創(chuàng)舉和里程碑。PCR技術基本原理類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。變性--退火--延伸變性：加熱至93℃左右一定時間后，模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備退火(復性)：模板DNA變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合延伸：模板-引物結合物在Taq聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補鏈，這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。圖PCR擴增DNA原理示意圖①變性（95℃）；②退火；③延伸（72℃）PCR標準反應體系DNA模板

0.1～2ug

引物

10～100pmol

反應緩沖液

10uldNTP各200umol/L

耐熱聚合酶

2.5u

Mg2+1.5mmol/L

ddH2O加至100ul引物：引物是PCR特異性反應的關鍵，PCR產物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。設計引物1.引物長度：15-30bp，常用為20bp左右。2.引物擴增跨度：以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至10kb的片段。3.引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。4.避免引物內部出現(xiàn)二級結構，避免兩條引物間互補，特別是3’端的互補，否則會形成引物二聚體，產生非特異的擴增條帶。5.引物3’端的堿基，特別是最末及倒數第二個堿基，應嚴格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗。6.引物中有或能加上合適的酶切位點，被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點，這對酶切分析或分子克隆很有好處。7.引物的特異性：引物應與核酸序列數據庫的其它序列無明顯同源性。PCR標準反應體系中量的問題引物量：每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量產生所需要的結果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會。模板的量與純化程度：是PCR成敗與否的關鍵環(huán)節(jié)之一。酶及其濃度：催化一典型的PCR反應約需酶量2.5U(指總反應體積為100ul時)。dNTP的質量與濃度：等摩爾配制，遏制錯配率，與Mg2＋的濃度比例。Mg2+濃度：濃度過高，反應特異性降低，出現(xiàn)非特異擴增，濃度過低會降低TaqDNA聚合酶的活性，使反應產物減少。PCR反應條件溫度、時間和循環(huán)次數溫度與時間的設置基于PCR原理三步驟設置變性-退火-延伸三個溫度點。三溫度點法：90～95℃變性再迅速冷卻至40～60℃，引物退火并結合到靶序列上快速升溫至70～75℃，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。二溫度點法對于較短靶基因(長度為100～300bp時)，除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸(此溫度TaqDNA酶仍有較高的催化活性)。溫度與時間的設置變性溫度與時間：變性溫度低，解鏈不完全是導致PCR失敗的最主要原因。93℃～94℃lmin足以使模板DNA變性，溫度不能過高，高溫環(huán)境對酶的活性有影響。退火(復性)溫度與時間：變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃，可使引物和模板發(fā)生結合。由于模板DNA比引物復雜得多，引物和模板之間的碰撞結合機會遠遠高于模板互補鏈之間的碰撞。退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度。對于20個核苷酸，G+C含量約50%的引物，55℃為選擇最適退火溫度的起點較為理想。引物的復性溫度可通過公式選擇：Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T)復性溫度=Tm值-(5～10℃)在Tm值允許范圍內，選擇較高的復性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結合，提高PCR反應的特異性。復性時間一般為30～60s，足以使引物與模板之間完全結合。延伸溫度：一般在70～75℃之間，常用溫度為72℃，過高的延伸溫度不利于引物和模板的結合。延伸時間：可根據待擴增片段的長度而定，一般1Kb以內的DNA片段，延伸時間1min足夠。3～4kb的靶序列需3～4min；擴增10Kb需延伸至15min。延伸進間過長會導致非特異性擴增帶的出現(xiàn)。對低濃度模板的擴增，延伸時間要稍長些。循環(huán)次數：決定PCR擴增程度。PCR循環(huán)次數主要取決于模板DNA的濃度。一般的循環(huán)次數選在30～40次之間，循環(huán)次數越多，非特異性產物的量亦隨之增多。溫度與時間的設置PCR反應的變異反向PCR(reverse

PCR)RACENestedPCR（巢式PCR）半定量PCR實時熒光定量PCR原位PCR……用反向的互補引物來擴增兩引物以外的未知序列的片段。反向PCR的目的在于擴增一段已知序列旁側的DNA，也就是說這一反應體系不是在一對引物之間而是在引物外側合成DNA。反向PCR(reverse

PCR)適用于T-DNA、轉座子和已知序列DNA旁側病毒整合位點分析等研究。不足：限制酶、PCR產物的特異性NestedPCR（巢式PCR）巢式PCR是一種變異PCR，使用兩對PCR引物擴增完整的片段。第一對PCR引物擴增片段和普通PCR相似。第二對引物稱為巢式引物（因為他們在第一次PCR擴增片段的內部）結合在第一次PCR產物內部，使得第二次PCR擴增片斷短于第一次擴增。巢式PCR反應：巢式PCR通過兩輪PCR反應，使用兩套引物擴增特異性的DNA片斷。第二對引物的功能是特異性的擴增位于首輪PCR產物內的一段DNA片斷。巢式PCR的優(yōu)點，如果第一次擴增產生了錯誤片斷，則第二次能在錯誤片段上進行引物配對并擴增的概率極低。因此，巢式PCR的擴增非常特異。

圖

巢式PCR的實驗流程RT-PCRRT-PCR將以RNA為模板的cDNA合成同PCR結合在一起，是一種分析基因表達的快速靈敏的方法。對表達信息進行檢測或定量檢測基因表達差異克隆cDNA（不必構建cDNA文庫）RT-PCR比其他包括Northern印跡、RNase保護分析、原位雜交及S1核酸酶分析在內的RNA分析技術，更靈敏，更易于操作。?RT-PCR的模板可以為總RNA或poly(A)選擇性RNA。逆轉錄反應可以使用反轉錄酶，以隨機引物、oligo(dT)或基因特異性的引物（GSP）起始。RT-PCR可以一步法或兩步法的形式進行。在兩步法RT-PCR中，每一步都在最佳條件下進行。cDNA的合成首先在逆轉錄緩沖液中進行，然后取出1/10的反應產物進行PCR。在一步法RT-PCR中，逆轉錄和PCR在同時為逆轉錄和PCR優(yōu)化的條件下，在一只管中順次進行。RT-PCR一步法或兩步法的形式熒光定量PCR基本原理實時熒光定量PCR技術是在PCR反應體系中加入熒光試劑，利用熒光信號實時檢測PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。實時熒光定量PCR能夠專一、靈敏、快速、高重復性地精確定量起始模板濃度。初始模板濃度定量初始DNA量越多,熒光達到某一值（域值）時所需要的循環(huán)數越少。Log濃度與循數呈關系，根據樣品擴增達到域的循環(huán)數就可計算出樣品中所含的模板量。本實驗中PCR反應體