基因工程汶上縣教研室劉明星基因工程：把一種生物的遺傳物質(zhì)（細(xì)胞核、染色體、脫氧核糖核酸等）轉(zhuǎn)移到另一種生物的細(xì)胞中去，并使這種遺傳物質(zhì)所帶的遺傳信息在受體細(xì)胞中表達(dá)。

基因工程的核心是構(gòu)建重組DNA分子，

因此，基因工程稱(chēng)為重組DNA技術(shù)。（一）基因工程的概念1）它是一種按照人們的意愿定向的改造生物遺傳特性的技術(shù)說(shuō)明：2）DNA水平上的操作3）在體外進(jìn)行的人為的基因重組4）一旦成功便可遺傳5）主要技術(shù)為體外DNA重組技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)基因工程的別名操作環(huán)境操作對(duì)象操作水平基本過(guò)程實(shí)質(zhì)結(jié)果基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)生物體外基因DNA分子水平人們需要的新的生物類(lèi)型和生物產(chǎn)品切割→拼接→導(dǎo)入→表達(dá)基因重組▲基因工程的若干問(wèn)題:為什么人的基因可以導(dǎo)入大腸桿菌內(nèi)并成功表達(dá)？基因工程基礎(chǔ)：（1）DNA規(guī)則雙螺旋結(jié)構(gòu)是基因工程的物質(zhì)基礎(chǔ)；（2）不同生物共用一套密碼子是理論基礎(chǔ)；（3）運(yùn)載體和工具酶的發(fā)現(xiàn)為基因工程提供了技術(shù)基礎(chǔ)?；蚬こ痰?/p>

基本工具基因工程培育抗蟲(chóng)棉的簡(jiǎn)要過(guò)程：普通棉花(無(wú)抗蟲(chóng)特性)蘇云金芽孢桿菌獲取抗蟲(chóng)基因（目的基因）與運(yùn)載體DNA拼接導(dǎo)入棉花細(xì)胞(含抗蟲(chóng)基因)棉花植株(有抗蟲(chóng)特性)▲基因工程實(shí)例:前面介紹的利用基因工程培育抗蟲(chóng)棉的主要步驟有哪幾個(gè)?步驟一：從蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞內(nèi)提取出來(lái)抗蟲(chóng)基因(目的基因).步驟二：抗蟲(chóng)基因與運(yùn)載體DNA連接步驟三：抗蟲(chóng)基因?qū)胧荏w(普通棉花)細(xì)胞▲思考:提示:共四步;步驟四是“檢測(cè)和鑒定”.▲上述的三個(gè)步驟中各需要什么工具？步驟一的工具：步驟二的工具：步驟三的工具：“分子手術(shù)刀”——限制性核酸內(nèi)切酶（限制酶）“分子縫合針”——DNA連接酶“分子運(yùn)載車(chē)”——載體▲這里的“分子”是指__________________分子.DNA(目的基因、載體)1、限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”限制酶主要是從原核微生物中分離純化出來(lái)的。能識(shí)別雙鏈DNA的某種特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間(此處叫“切點(diǎn)”)的磷酸二酯鍵斷開(kāi)注意:

一種限制酶只能識(shí)別一種特定的核苷酸序列,并且能在一個(gè)特定的切點(diǎn)上切割DNA分子。即：特異性.(注意:特異性表現(xiàn)在兩個(gè)方面.)限制性核酸內(nèi)切酶重播限制酶▲在G和A之間被限制酶切斷的是化學(xué)鍵是___________________.▲“黏性末端”和“平末端”

當(dāng)限制酶在它識(shí)別序列的中心軸線(xiàn)的兩側(cè)將DNA的兩條鏈分別切開(kāi)時(shí)，產(chǎn)生的是黏性末端.

而當(dāng)限制酶在它識(shí)別序列的中心軸線(xiàn)處切開(kāi)時(shí)，產(chǎn)生的則是平末端。1.要想獲得某一個(gè)特定性狀的基因(即”目的基因”)必須要用限制酶切幾個(gè)切口？可產(chǎn)生幾個(gè)黏性末端？要切兩個(gè)切口，產(chǎn)生四個(gè)黏性末端.2.如果把兩種來(lái)源不同的DNA用同一種限制酶來(lái)切割，產(chǎn)生黏性末端相同嗎？

會(huì)產(chǎn)生相同的黏性末端..思考:連接的部位磷酸二酯鍵結(jié)果兩個(gè)DNA相同的黏性末端連接起來(lái)。二、DNA連接酶▲DNA連接酶的種類(lèi)及其在功能上的異同.

----見(jiàn)課文P5.來(lái)源功能同異名稱(chēng)E.ColiDNA連接酶T4DNA連接酶大腸桿菌T4噬菌體形成磷酸二酯鍵只能:互補(bǔ)的黏性末端黏性末端和平末端均可DNA連接酶可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來(lái)，即把梯子兩邊扶手的斷口(注意位置)連接起來(lái)，這樣一個(gè)重組的DNA分子就形成了.▲思考:

DNA連接酶的作用是使斷口處的相鄰的兩個(gè)脫氧核苷酸之間形成____________鍵.

異:

DNA連接酶:是將幾個(gè)DNA片段連接起來(lái);不需DNA模板.

DNA聚合酶:則是將脫氧核苷酸連接(聚合)成DNA;需以DNA的一條鏈為模板.▲提示:

注意比較基因工程中的DNA連接酶和DNA復(fù)制中的DNA聚合酶的作用有何異同?

同:兩種酶都是形成磷酸二酯鍵.導(dǎo)入過(guò)程需要運(yùn)輸“目的基因”的工具——載體。

▲如何將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞(即接受目的基因的生物的細(xì)胞）？▲注意:

一般地,不能將目的基因直接導(dǎo)入受體細(xì)胞.▲載體的作用有哪些？1.作為運(yùn)輸工具，將目的基因(如抗蟲(chóng)基因)轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞(如棉花細(xì)胞)中去。

2.利用載體在受體細(xì)胞(如棉花細(xì)胞)內(nèi)，對(duì)目的基因(如抗蟲(chóng)基因)進(jìn)行大量復(fù)制。3.基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體---“分子運(yùn)輸車(chē)”.常用的運(yùn)載體主要有兩類(lèi)：

1）質(zhì)粒:一些細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)里的質(zhì)粒.2）病毒:噬菌體衍生物、動(dòng)、植物病毒.▲什么是質(zhì)粒?

是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、獨(dú)立于細(xì)菌原核DNA之外，并具有自我復(fù)制能力的雙鏈環(huán)狀DNA分子.

質(zhì)粒是基因工程最常用的載體.

▲小結(jié):

質(zhì)粒是小型、環(huán)狀的DNA分子.

最常用的質(zhì)粒是大腸桿菌的質(zhì)粒，其中常含有抗藥基因，如四環(huán)素的標(biāo)記基因。質(zhì)粒的存在與否對(duì)宿主細(xì)胞生存沒(méi)有決定性作用，但復(fù)制只能在宿主細(xì)胞內(nèi)完成?！|(zhì)粒的一種:大腸桿菌的質(zhì)?！⒁?能充當(dāng)載體的是大腸桿菌的質(zhì)粒,而不是大腸桿菌.▲作為載體必須具備哪些條件？1）能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定地保存。2）載體DNA必須有一個(gè)或多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便目的基因插入到載體上去。3）具有某些標(biāo)記基因，便于進(jìn)行篩選。如抗菌素的抗性基因、產(chǎn)物具有顏色反應(yīng)的基因等。載體DNA必須是安全的,不會(huì)對(duì)受體細(xì)胞有害,或不能進(jìn)入到除受體細(xì)胞外的其他生物細(xì)胞中去。基因工程的基本操作程序▲基因工程的基本操作程序主要包括四個(gè)基本步驟：1）目的基因的獲取2）“基因表達(dá)載體”的構(gòu)建3）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞(即“轉(zhuǎn)化”)4）目的基因的檢測(cè)與鑒定步驟一：目的基因的獲取▲什么叫目的基因?

主要是指編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因.▲獲取目的基因的途徑有哪些?1.從“基因文庫(kù)”中獲取目的基因.2.利用“PCR技術(shù)”擴(kuò)增.3.直接人工合成----見(jiàn)課文.▲從基因文庫(kù)中獲取“目的基因”：什么叫“基因文庫(kù)”?分為:1.基因組文庫(kù):

基因文庫(kù)中包含了一種生物所有的基因2.部分基因文庫(kù):

基因文庫(kù)中包含了一種生物的一部分基因,如cDNA文庫(kù).

將含有某種生物不同基因的許多DNA片段,導(dǎo)入受體菌的群體中儲(chǔ)存,各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同的基因,稱(chēng)為基因文庫(kù)▲利用PCR技術(shù)擴(kuò)增“目的基因”.1.概念:PCR即“聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”,是一種在生物體外復(fù)制特定DNA片斷的技術(shù).2.原理:DNA的半保留復(fù)制.3.過(guò)程:(見(jiàn)圖).4.優(yōu)點(diǎn):大量獲取目的基因.(指數(shù)式擴(kuò)增,近2n)▲提示:PCR的基本操作(過(guò)程):

1.變性:通過(guò)加熱(高溫)使模板DNA完全變性成為單鏈,

2.復(fù)性:將溫度下降至適宜溫度，使引物與模板DNA結(jié)合；

3.延伸:將溫度升高,熱穩(wěn)定DNA聚合酶，以即脫氧核苷酸)為底物原料催化合成DNA鏈延伸.

▲顯然,每循環(huán)(擴(kuò)增)一次,就需要添加一次(共兩個(gè))引物.兩個(gè)引物、一個(gè)模板.▲人工合成目的基因

如果基因比較小，核苷酸序列又已知，也可以通過(guò)DNA合成儀用化學(xué)方法直接合成。1.通過(guò)反轉(zhuǎn)錄法合成:又分為:目的基因的mRNA(已知)單鏈DNA雙鏈DNA(即目的基因)反轉(zhuǎn)錄合成2.直接合成.

根據(jù)已知蛋白質(zhì)的氨基酸序列，推測(cè)出相應(yīng)的信使RNA序列，然后按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，推測(cè)出它的結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列，再通過(guò)化學(xué)方法，以單核苷酸為原料合成目的基因。蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列推測(cè)推測(cè)目的基因化學(xué)合成獲取目的基因后,能直接導(dǎo)入受體細(xì)胞嗎?如何將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞呢?

必須借助載體!

怎樣借助載體將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞呢?

必須把目的基因“裝到”載體上!如何裝?步驟二：基因表達(dá)載體的構(gòu)建.（核心）▲什么是“基因表達(dá)載體”?

就是已經(jīng)裝上了(含有)目的基因的載體.1）用一定的限制酶切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個(gè)切口，露出末端。

2）用同一種限制酶切取目的基因，使其產(chǎn)生相同的末端。

3）將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的切口處，再加入適量DNA連接酶，形成了一個(gè)重組DNA分子（重組質(zhì)粒）▲目的基因與載體的結(jié)合過(guò)程，實(shí)際上是不同來(lái)源的基因重組的過(guò)程▲基因表達(dá)載體的構(gòu)建步驟.

----見(jiàn)課文.▲提示與思考:1.“基因表達(dá)載體”就是已插入目的基因的載體.2.看左圖回答:

基因表達(dá)載體由哪些部分組成?___________.3.啟動(dòng)子:有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片斷,位于目的基因的首端,是RNA聚合酶的識(shí)別和結(jié)合的部位.有它才能驅(qū)動(dòng)目的基因轉(zhuǎn)錄出MRNA.最終獲得蛋白質(zhì).4.終止子:位于目的基因的端尾端.作用是終止轉(zhuǎn)錄.5.標(biāo)記基因:是為了鑒別受體細(xì)胞里是否已經(jīng)含有目的基因,從而將含目的基因的細(xì)胞篩選出來(lái).如“抗生素基因”、“熒光標(biāo)記基因”等.6.復(fù)制原點(diǎn)是載體復(fù)制時(shí)的起點(diǎn).▲什么叫轉(zhuǎn)化?

目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定(如復(fù)制)和表達(dá)(即轉(zhuǎn)錄、翻譯為特定蛋白質(zhì)及表現(xiàn)特定性狀等)的過(guò)程.▲受體細(xì)胞是指什么?它包括哪些細(xì)胞?▲提示:注意,目的基因是隨著基因表達(dá)載體被導(dǎo)入受體細(xì)胞的,而不是被單獨(dú)導(dǎo)入的.步驟三：將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞----農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法.▲提示:(1)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法:農(nóng)桿菌能感染雙子葉植物和裸子植物.其細(xì)胞里含Ti質(zhì)粒,該質(zhì)粒上含有一段DNA叫“T-DNA”(

“可轉(zhuǎn)移的DNA”).將目的基因插入到該“T-DNA”中,通過(guò)使農(nóng)桿菌感染植物,而將目的基因轉(zhuǎn)化入植物細(xì)胞并將其插入到植物細(xì)胞中的染色體DNA上.(2)將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法還有:基因槍法和花粉通道法.2.將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞---顯微注射法.將目的基因片段(注意:是含目的基因的“基因表達(dá)載體”,而不是裸的目的基因)注入到受精卵的細(xì)胞核內(nèi)，然后把經(jīng)過(guò)注射的受精卵移植到另一只雌性動(dòng)物的子宮內(nèi)，使受精卵發(fā)育為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。3.將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞微生物在基因工程中的優(yōu)點(diǎn)？轉(zhuǎn)化方法是:

首先用Ca2+(如CaCL溶液)處理細(xì)胞,以增大細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性,使細(xì)胞處于一種能吸收周?chē)h(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài),這種細(xì)胞稱(chēng)為感受態(tài)細(xì)胞.

第二步是將重組表達(dá)載體DNA分子溶于緩沖液中與感受態(tài)細(xì)胞混合,在一定的溫度下促進(jìn)感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子,完成轉(zhuǎn)化過(guò)程.步驟四：目的基因的檢測(cè)與鑒定▲怎樣檢測(cè)和鑒定?思考:有哪幾種檢測(cè)方法?每一種方法的原