第一章抗原抗體反應免疫學診斷技術概述(4學時)檢測抗原制備技術

第一節(jié)抗原抗體反應的原理

第二節(jié)抗原抗體反應的特點

第三節(jié)影響抗原抗體反應的因素

第四節(jié)免疫學檢測技術的類型

第一節(jié)抗原抗體反應的原理

抗原抗體反應，主要是指抗原和抗體在體外結合所表現的反應。由于抗體主要存在于血清中，并且臨床上多用血清做試驗，所以體外實驗中的抗原抗體反應曾稱作血清學反應（serologicalreaction)。但是隨著免疫學的發(fā)展，血清學的含義已不能概括目前的研究內容，現在多以抗原抗體反應代替血清學反應一詞。Ag:AntigenAb:Antibody第一節(jié)抗原抗體反應的原理

抗原抗體反應:指抗原與相應抗體之間所發(fā)生的特異性結合反應。物質基礎:

抗原表位與抗體高變區(qū)間的互補結合抗原表位與抗體高變區(qū)的溝槽分子表面的結合抗原抗體之間的結合力親水膠體轉化為疏水膠體靜電引力（electrostaticforces）范德華引力:作用最?。╲anderWaalsinteractions）氫鍵:最具特異性（hydrogenbond）疏水作用力:作用最大（hydrophobicinteractions）

抗原抗體結合力示意圖一、抗原抗體結合力l.靜電引力

抗原和抗體分子帶有相反電荷的氨基和羧基基團之間相互的引力，稱為靜電引力，又稱庫倫引力。例如，抗體分子上帶電荷的堿性氨基酸的游離氨基(-NH3+)和酸性氨基酸的游離羧基(-COO-)可與抗原分子上帶相反電荷的對應基團相互吸引。這種引力的大小與兩個相互作用基團間的距離平方成反比。

2.范德華引力

抗原和抗體相互接近時，由于分子的極化作用而出現的引力，稱范德華引力。結合力的大小與兩個相互作用基團的極化程度的乘積成正比、與它們之間距離的7次方成反比，鍵能約為4.2-12.5kJ/moL。這種引力的能量小于靜電引力。3.氫鍵結合力

供氫體上的氫原子與受氫體原子間的引力。在抗原抗體反應中，羧基、氨基和羥基是主要供氫體，而羧基氧、羧基碳和肽鍵氧等原子是主要受氫體。氫鍵結合力與供氫體和受氫體之間距離的6次方成反比，鍵能約20.9kJ/mol。4.疏水作用力

兩個疏水基團在水溶液中相互接觸時，由于對水分子排斥而趨向聚集的力稱為疏水作用力，或稱為疏水鍵。當抗原抗體反應時，抗原決定簇與抗體上的結合點靠近，互相間正、負極性消失，由靜電作用形成的親水層立即失去，從而促進抗原與抗體的相互吸引而結合。疏水作用力在抗原抗體反應中的結合是很重要的。提供的作用力最大，約占總結合力的50%?？贵w分子上一個抗原結合點與對應的抗原決定簇之間相適應而存在著的引力，是抗原抗體間固有的結合力親和力(affinity)抗原抗體親和力示意圖二、抗原抗體的親和力和親合力抗體結合部位與抗原表位之間結合的強度親合力(avidity)抗原抗體親合力示意圖

抗體與抗原結合是可逆的反應，在平衡時其

親和常數

K=抗原抗體復合物濃度游離抗原濃度×游離抗體濃度

K代表抗體結合抗原的親和力。

K值大的抗體與抗原牢固結合，不易解離，稱該抗體有高親和力。三、親水膠體轉化為疏水膠體抗體和大多數抗原同屬蛋白質。在通常的血清學反應條件下均帶有負電荷，使極化的水分子在其周圍形成水化層，成為親水膠體，因此蛋白質不會自行凝集出現沉淀。當Ag與Ab結合后，表面電荷減少，水化層變?。欢矣捎贏g-Ab復合物形成后，與水接觸的表面積減少，由親水膠體轉化為疏水膠體。此時在電解質(如NaCl)的作用下，使各疏水膠體之間進一步靠攏、沉淀，形成可見的Ag-Ab復合物。

可見反應抗原抗體復合物

(疏水膠體)電解質

抗原(親水膠體)

抗體(親水膠體)

+三、親水膠體轉化為疏水膠體第二節(jié)抗原抗體反應的特點特異性可逆性比例性階段性特異性：抗原與抗體結合反應的專一性抗原抗體反應特異性示意圖分子基礎:抗原表位與抗體分子高變區(qū)之間空間構型的互補性一、特異性兩種不同的抗原分子具有部分相同或類似結構的抗原表位，可與彼此相應的抗血清發(fā)生反應交叉反應（crossreactions）抗原抗體交叉反應示意圖二、可逆性可逆性：抗原與相應抗體結合成復合物后，在一定條件下又可解離為游離抗原與抗體的特性影響因素：抗體對相應抗原的親合力－親合力越高，結合越牢固，越不易解離環(huán)境因素對復合物的影響－pH、離子強度

Ag與Ab的結合常需適當比例才出現可見反應，在最適比例時反應最明顯；這種現象可以用“格子學說”來解釋：Ab(IgG)為二價，Ag通常為多價，只有Ag，Ab結合形成大的復合物，肉眼才可見。三、比例性格子學說Myoglobin：肌紅蛋白只有當Ag與Ab比例適當時，才能形成大的復合物，比例不適當，就只能形成小的復合物而抑制反應現象的出現，此所謂帶現象；前帶現象：Ab過剩，Ag過少；

稀釋Ab，凝集反應常見；后帶現象：Ag過剩，Ab過少；

稀釋Ag、沉淀反應常見。前帶現象后帶現象前帶(prezone)：抗體過量后帶(postzone)：抗原過量等價帶(equivalencezone)：

抗原抗體比例合適

抗原抗體反應比例性示意圖比例性：抗原與抗體發(fā)生可見反應需遵循一定的量比關系三、比例性第一階段：特異性結合階段，反應快，不可見第二階段：反應可見階段，反應慢，出現凝集、沉淀和細胞溶解等現象四、階段性第三節(jié)影響抗原抗體反應的因素抗原、抗體反應物的自身因素環(huán)境因素一、反應物自身因素抗原:理化性狀、表位種類和數目抗體:來源、特異性、親和性、效價1、抗原

抗原的理化性狀、抗原決定簇的數目和種類均可影響血清學反應結果

例如，可溶性抗原與相應抗體反應出現沉淀，而顆粒性抗原與相應抗體反應則出現凝集；單價抗原與抗體結合不出現可見反應；粗糙型細菌在生理鹽水中易出現自凝；紅細胞與IgG類抗體結合不出現直接凝集等。一、反應物自身因素抗體對反應的影響表現在以下三個方面:(1)來源:來自不同動物的免疫血清，其反應性有差異。家兔等大多數動物的免疫血清具有較寬的等價帶，通常在抗原過量時才易出現可溶性免疫復合物；馬等大動物和人的免疫血清等價帶較窄，少量的抗原或抗體過剩，均可形成可溶性免疫復合物；家禽免疫血清不能結合哺乳動物的補體，并且在高鹽濃度（8.5%NaCl）溶液中沉淀現象明顯。單克隆抗體一般不適用于沉淀反應或凝集反應。

2、抗體(2)特異性與親和力:特異性和親和力是影響血清學反應的兩個關鍵因素，它們共同影響試驗結果的準確程度。免疫動物早期獲得的抗血清特異性較好，但親和力低；后期獲得的抗血清一般親和力較高，但長期免疫易使免疫血清中抗體的類型和反應性變得更為復雜。因此，用于診斷的試劑必須盡量選用特異性高、親和力強的抗體，才能保證和提高試驗結果的可靠性。（3）濃度:

抗體的濃度往往是與抗原相對而言。合適的濃度才出現明顯的反應現象。因此許多試驗應進行抗體預滴定，找出最適反應濃度。

l.電解質

抗原抗體結合后由親水性變?yōu)槭杷?，此時易受電解質影響，如有適當濃度電解質存在，就會使抗原抗體失去一部分電荷而相互凝集或沉淀，出現可見反應;若無電解質存在，則不出現可見反應。通常在血清學試驗中，以8.5%NaCl溶液作為抗原抗體的稀釋液及反應液，其中Na+和Cl-可分別中和膠體顆粒上的電荷，使膠體顆粒的電勢下降，形成可見的沉淀物或凝集物。但如果電解質濃度過高，則會出現非特異性蛋白質沉淀，即鹽析。二、環(huán)境因素2.酸堿度

合適的pH是抗原抗體反應的必要條件之一。血清學試驗一般以pH6-9為宜，超出此范圍可影響抗原和抗體的理化性質，導致假陽性或假陰性結果。當pH為3左右時，接近細菌抗原的等電點，可出現非特異性酸凝集，造成假象。3.溫度

抗原抗體反應一般在15-40℃范圍內均可進行，最適溫度為37℃。在此范圍內溫度越高，分子運動速度加快，增加抗原抗體接觸機會，反應速度越快，但亦容易引起復合物解離;溫度越低，反應速度緩慢，但抗原抗體結合牢固，易于觀察。某些特殊的抗原抗體反應需要特定的溫度，如冷凝集素在4℃時與紅細胞結合，20℃以上反而解離。4、作用時間

抗原抗體反應應有足夠的時間，不同反應時間不同。

此外，抗原抗體反應在液相中反應時，適當振蕩與攪拌，也可促進抗原抗體分子的接觸，加速反應。電解質:生理鹽水或緩沖液酸堿度:pH6～pH9溫度:15℃～40℃，37℃最適二、環(huán)境因素反應類型實驗技術結果判斷凝集反應直接凝集試驗觀察凝集現象間接凝集試驗同上抗球蛋白試驗同上沉淀反應液相沉淀試驗觀察沉淀，檢測濁度免疫電泳技術觀察掃描沉淀峰、沉淀弧補體參與的反應補體溶血試驗觀察測定溶血現象補體結合試驗同上第四節(jié)免疫學檢測技術的類型反應類型實驗技術結果判斷中和反應病毒中和試驗檢測病毒感染性毒素中和試驗檢測外毒素毒性標記免疫反應熒光免疫技術檢測熒光現象放射免疫技術檢測放射性強度酶免疫技術檢測酶底物顯色發(fā)光免疫技術檢測發(fā)光強度金免疫技術檢測金顆粒沉淀原理：將可溶性抗原層積于抗體之上，如果二者相應，則可在抗原、抗體兩液接觸界面形成白色的沉淀環(huán)環(huán)狀沉淀反應試驗組陽性對照組陰性對照組

原理：

可溶性Ag與Ab在含有電解質的半固體（1%）瓊脂內進行自由擴散，當兩者由高濃度向低濃度擴散相遇時，如果二者相對應而且比例適當，則可在相遇處形成白色的沉淀線，為陽性反應。另外，沉淀帶對于組成它的Ag、Ab具有特異地不可透過性，而對其它的Ag與Ab是可透過的，所以一條沉淀帶僅代表一種AgAb系統(tǒng)的沉淀物。雙向瓊脂擴散試驗檢測抗原制備技術抗原是一類能刺激機體免疫系統(tǒng)產生特異性免疫應答，并能與相應免疫應答產物（抗體或致敏淋巴細胞）在體內外發(fā)生特異性反應的物質，或稱免疫原。完全抗原:反應原性+免疫原性半抗原(不完全抗原):只具備反應原性而無免疫原性的物質。

來源于病原體及其病原體的代謝、分泌和排泄物等天然抗原，均可作為良好的檢測抗原。其種類，因病原體的種株不同而異。微生物中的衣原體、支原體、細菌、螺旋體、立克次體、真菌和放線菌等病原體表層結構蛋白以及各種外毒素、內毒素和酶等毒力因子，噬菌體、病毒的各種結構蛋白，如衣殼蛋白、包膜上的各種糖蛋白、基質蛋白以及病毒編碼的復制酶等均是良好的檢測抗原。

大多數寄生蟲是多細胞生物，其抗原具有復雜性、多源性，同時又具有種屬和生活史不同期的特異性。來源于蟲體結構性物質的蟲體抗原、蟲體排泄物和分泌物中的蛋白或多肽類、糖脂或多糖等代謝性抗原以及生活蟲體排放或脫落到宿主體內可出現于血循環(huán)的大分子微粒性循環(huán)抗原等均可作為檢測抗原。抗生素等藥物因其分子量較小，不具有抗原性。與牛血清白蛋白等大分子偶聯后才具有完全抗原的特性。

來源于自然感染或人工感染以及人工培養(yǎng)病原生物體的生物大分子物質，如蛋白質、多肽、酶類等，必須進行分離純化，才能作為特異性較好的檢測抗原。分離純化方法有選擇性沉淀法、有機溶劑沉淀法、等電點沉淀法、電泳法、超速離心法、層析法等。其中用于蛋白質和酶的提取，多采用選擇性沉淀法、有機溶劑沉淀法和等電點沉淀法。（一）分離純化法（1）飽和硫酸銨法：鹽析沉淀法是經典的蛋白質和酶純化分離技術。最常用的方法是以33%~50%的飽和硫酸銨依次沉淀3次。將鹽析沉淀后的蛋白質溶液裝入透析袋中，用蒸餾水或緩沖液，4℃冰箱內進行透析，更換蒸餾水或緩沖液3次，直至袋內鹽充分透析除盡為止。此外，亦可用葡聚糖凝膠層析法脫鹽。（一）分離純化法（2）有機溶劑沉淀法：常用乙醇或丙酮，加入時應攪拌均勻，pH值大多控制在待沉淀蛋白質的等電點附近，置4℃冰箱內進行。（3）分子篩層析法：又稱凝膠過濾法，它是利用分子篩將抗原分成大、中、小三種類型。特別是經過初步純化后的蛋白質和酶抗原采用此種方法進一步純化，效果尤為顯著。（一）分離純化法（4）親和層析法：親和層析法則是利用生物大分子的生物學特異性而設計的層析分離技術。例如抗原抗體、酶和酶抑制劑或配體、酶蛋白和輔酶、DNA和RNA、激素和受體等之間具有特殊的親和力，在一定條件下，二者能緊密結合形成復合物。如果將其中的一方面固定在載體上，則可從溶液中提取和分離相應的另一方。親和層析可以達到很高的純度。有時僅需進行一步純化即可達到純化的目的。（二）抗原定性鑒定純化蛋白質抗原的定性鑒定常用的方法有：免疫電泳及聚丙烯酰胺凝膠電泳等。純化蛋白質抗原濃度的定量測定可用雙縮脲法、酚試劑法或紫外光吸收法。（三）抗原的濃縮

（1）純化后的抗原常用聚乙二醇（PEG）、凝膠和蔗糖等吸收劑進行濃縮。使用PEG或蔗糖吸收劑時，先將生物大分子溶液裝入透析袋里，扎緊袋口，外加吸收劑覆蓋，袋內溶劑滲出被吸收劑吸去，吸收劑被溶劑飽和后，亦可更換，直至濃縮至所需濃度為止。吸收劑可經加熱除去吸收的水分后再次使用。將生物大分子溶液裝入透析袋，扎緊袋口，然后將透析袋置電扇旁吹風，促使水分緩慢蒸發(fā)，可起到濃縮作用。（三）抗原的濃縮（2）超濾濃縮是使用一種特定孔徑的濾膜對溶液中各種