實(shí)驗(yàn)九微生物生理生化實(shí)驗(yàn)第一頁，共十九頁，2022年，8月28日一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)檢測(cè)微生物代謝特性的試驗(yàn)方法掌握

淀粉水解試驗(yàn)

糖發(fā)酵試驗(yàn)

吲哚試驗(yàn)VP試驗(yàn)石蕊牛乳試驗(yàn)的反應(yīng)原理及操作第二頁，共十九頁，2022年，8月28日二、實(shí)驗(yàn)原理

同種的細(xì)菌具有相同或相近的表型特征（形態(tài)、生理特征、代謝產(chǎn)物等），而細(xì)菌的生理特征，主要取決于酶的催化作用，但各種細(xì)菌具有不同的酶系統(tǒng)，從而導(dǎo)致代謝類型的多樣性。在所有生活細(xì)胞中存在的這些化學(xué)反應(yīng)被稱為生理生化反應(yīng)（酶促反應(yīng)）。

人們?cè)谖⑸锏姆诸愯b定工作中，常利用其生理生化反應(yīng)作為重要的分類依據(jù)。第三頁，共十九頁，2022年，8月28日三、實(shí)驗(yàn)材料1.實(shí)驗(yàn)菌種：枯草桿菌（BS）、大腸桿菌（EC）2．培養(yǎng)基：（2人為一組）淀粉培養(yǎng)基（固體）：1皿/人糖發(fā)酵管(乳糖、葡萄糖、蔗糖各2只）：6支/組蛋白胨水培養(yǎng)基：4支/組葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基：4支/組石蕊牛乳培養(yǎng)基：2支/組3．實(shí)驗(yàn)開始前分別標(biāo)記好每一組試管，一半為BS，一半為EC。第四頁，共十九頁，2022年，8月28日四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1.淀粉水解試驗(yàn)（原理：淀粉遇碘變藍(lán)）細(xì)菌對(duì)大分子的淀粉不能直接利用，須靠產(chǎn)生的胞外酶(淀粉酶)將淀粉水解為小分子糊精或進(jìn)一步水解為葡萄糖(或麥芽糖)，再被細(xì)菌吸收利用，細(xì)菌水解淀粉的過程可通過底物的變化來證明，即用碘測(cè)定不再產(chǎn)生藍(lán)色。第五頁，共十九頁，2022年，8月28日（1）倒平板，凝固后在培養(yǎng)皿底面兩側(cè)的中央位置分別標(biāo)記BS或EC。（2）用接種環(huán)以點(diǎn)接的方式接上菌種。一邊接枯草桿菌BS，另一邊接大腸桿菌EC。（3）將接完種的平板倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)7ｄ。（4）觀察結(jié)果時(shí)，可打開皿蓋，滴加少量的碘液于平板上，輕輕旋轉(zhuǎn)，使碘液均勻鋪滿整個(gè)平板。如菌苔周圍出現(xiàn)無色透明圈，則說明淀粉已被水解，為陽性。透明圈的大小，說明該菌水解淀粉能力的強(qiáng)弱，即產(chǎn)生胞外酶活力的高低。（以“+”、“—”表示有無透明圈）具體操作：第六頁，共十九頁，2022年，8月28日2.糖類發(fā)酵試驗(yàn)（含碳化合物的分解利用）原理及現(xiàn)象：不同糖類經(jīng)不同代謝途徑分解后可產(chǎn)生有機(jī)酸，氣體或二者都有，借助于溴甲酚紫顯色。第七頁，共十九頁，2022年，8月28日指示劑：溴甲酚紫（變色范圍pH5.2-6.8,pH<5.2黃色，pH>6.8紫色）pH<5.2,溶液由清亮紫色變?yōu)闇啙狳S色

乳酸、醋酸、丙酸葡萄糖/乳糖甲烷、氫、二氧化碳杜氏小管內(nèi)有氣泡，產(chǎn)氣漂浮第八頁，共十九頁，2022年，8月28日（1）以液體接種的方式分別接種枯草桿菌BS或大腸桿菌EC于葡萄糖、蔗糖、乳糖商品化發(fā)酵管中。以未接種的作為對(duì)照（全班1-2支試管即可）。（2）接種后置于37℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)7d。（3）觀察結(jié)果時(shí)，看各管顏色變化及小管頂部有無氣泡。產(chǎn)酸產(chǎn)氣用“⊕”表示；只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣用“+”表示；不產(chǎn)酸也不產(chǎn)氣用“-”表示。具體操作：第九頁，共十九頁，2022年，8月28日色氨酸→吲哚→玫瑰吲哚↑吲哚試劑

-+3.吲哚（indole）試驗(yàn)：（含氮化合物的分解利用）第十頁，共十九頁，2022年，8月28日（1）以液體接種的方式分別接種枯草桿菌和大腸桿菌于蛋白胨水培養(yǎng)基中。（2）接種后置于37℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)7d。以未接種的作為對(duì)照（全班1-2支試管即可）。（3）觀察結(jié)果時(shí)，在培養(yǎng)液中加入乙醚約1毫升（使呈明顯的乙醚層）。充分振蕩，使吲哚溶于乙醚中，靜置片刻，待乙醚浮于培養(yǎng)液上面時(shí)，沿管壁慢慢加入吲哚試劑10滴。如吲哚存在，則乙醚層呈玫瑰紅色。（注意：加入吲哚試劑后，不可再搖動(dòng)，否則紅色不明顯）。以“+”、“—”表示有無紅色的玫瑰吲哚。具體操作：第十一頁，共十九頁，2022年，8月28日4.VP實(shí)驗(yàn)?zāi)承┘?xì)菌在葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸縮合，脫羧成乙酰甲基甲醇，后者在強(qiáng)堿環(huán)境下，被空氣中氧氧化為二乙酰，二乙酰與蛋白胨中的胍基生成紅色化合物，稱V－P（+）反應(yīng)。第十二頁，共十九頁，2022年，8月28日2CH3COCOOHCH3COCHOHCH3十2CO2丙酮酸乙酰甲基甲醇CH3COCHOHCH3CH3COCOCH3乙酰甲基甲醇NaOH丁二酮（二乙酰）第十三頁，共十九頁，2022年，8月28日取出塞子，

加10滴VP試劑，振蕩混合后，置沸水浴中保溫，5分鐘后觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。出現(xiàn)紅色這位VP試驗(yàn)陽性。接種及培養(yǎng)方式如同吲哚實(shí)驗(yàn)具體操作：第十四頁，共十九頁，2022年，8月28日5.石蕊牛乳試驗(yàn)：（利用蛋白質(zhì)酪素的能力）牛乳的主要成分為乳糖，蔗糖，蛋白質(zhì)和酪素等成分。牛乳中加入石蕊作為酸堿指示劑和氧化還原的指示劑（中性為黃色，酸性為紅色，堿性為藍(lán)色，石蕊被還原時(shí)，則部分或全部脫色）。由于各種細(xì)菌對(duì)牛乳的利用不同，引起培養(yǎng)基的變化也就不同，主要變化為：酸凝：主要從乳糖產(chǎn)生酸，指示劑變紅色。pH4.7以下時(shí)，有牛乳的凝固；如有氣體形成，則凝塊中有裂隙。凝乳酶凝固作用：很少或無酸產(chǎn)生，分泌凝乳酶使牛乳凝固。細(xì)菌產(chǎn)生蛋白酶可將干酪素分解產(chǎn)生胺或氨，使培養(yǎng)基的pH進(jìn)一步升高，呈深藍(lán)紫色。胨化：酪蛋白被水解，部分或大部分牛奶變清亮?？稍谒嵝曰驂A性條件下進(jìn)行，石蕊被還原脫色。第十五頁，共十九頁，2022年，8月28日（1）以液體接種的方式分別接種枯草桿菌和大腸桿菌于石蕊牛乳培養(yǎng)基中。（2）接種后置于37℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)7-14d。（3）觀察結(jié)果時(shí)，看各管顏色變化及牛乳胨化的現(xiàn)象。具體操作：第十六頁，共十九頁，2022年，8月28日五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告1．細(xì)菌對(duì)各種生理生化試驗(yàn)反應(yīng)的結(jié)果：淀粉水解試驗(yàn)糖發(fā)酵試驗(yàn)吲哚試驗(yàn)VP試驗(yàn)石蕊牛乳試驗(yàn)乳糖葡萄糖蔗糖枯草桿菌大腸桿菌菌種名稱第十七頁，共十九頁，2022年，8月28日（1）淀粉等生物大分子物質(zhì)能否不經(jīng)分解而直接被細(xì)菌吸收？