酶學和生物催化第一章緒論第一節(jié)生物催化和工業(yè)生物技術第二節(jié)研究內容第三節(jié)國內外酶制劑工業(yè)概況生物學化學工程工程學化學生物工程生物化學生物技術第一節(jié)生物催化新興、前沿學科往往在學科交叉中產生生物技術醫(yī)藥生物技術農業(yè)生物技術工業(yè)生物技術環(huán)境生物技術材料生物技術

...用生物或生物分子機器生產產品和解決問題生物技術的具體應用背景：工業(yè)生物技術的出現(xiàn)在19—20世紀，人類的化學工業(yè)文明取得了輝煌成就，其主要特征是以化石資源為物質基礎。化石資源是儲量有限的不可再生資源，正走向衰竭。據估計，可開采石油儲量僅可供人類使用約50年，天然氣約75年，煤炭200—300年。進入21世紀，面臨化石資源不斷枯竭、環(huán)境污染日益加劇的嚴重局面，轉向以可再生生物資源為原料，可再生生物能源為能源，環(huán)境友好、過程高效的新一代物質加工模式是必然趨勢，這種加工模式的核心技術就是工業(yè)生物技術(Industrialbiotechnology)。

20世紀后半葉，分子生物學的突破性成就引發(fā)了現(xiàn)代生物技術發(fā)展的三次浪潮。第一次浪潮主要體現(xiàn)在醫(yī)藥生物技術(也稱為紅色生物技術，Redbiotechnology)領域，其標志是1982年重組人胰島素上市。第二次浪潮發(fā)生在農業(yè)生物技術(也稱為綠色生物技術，Greenbiotechnology)領域，其標志為1996年轉基因大豆、玉米和油菜相繼上市。以2000年聚乳酸上市為標志的工業(yè)生物技術(也稱為白色生物技術，Whitebiotechnology)已成為生物技術發(fā)展的第三次浪潮，推動著一個以生物催化和生物轉化為特征，以生物能源、生物材料、生物化工、生物冶金等為代表的現(xiàn)代工業(yè)體系的形成，在全球范圍內掀起了一場新的現(xiàn)代工業(yè)技術革命。2003年，白色生物技術已影響全球5%的化學品市場(約500億美元的市場值)。據有關專家預測，至2015年，全世界的化工行業(yè)將有1/6的產值源自白色生物技術，金額高達3050億美元。生物技術產業(yè)化的三個浪潮

醫(yī)藥生物技術:

1982年重組人胰島素上市農業(yè)生物技術:

1996年轉基因大豆、玉米、油菜相繼上市工業(yè)生物技術:

世紀之交聚交酯、生物鋼、聚乳酸相繼上市工業(yè)生物技術---邁向發(fā)達國家之戰(zhàn)略

什么是工業(yè)生物技術？以微生物或酶為催化劑進行物質轉化，大規(guī)模地生產人類所需的化學品、醫(yī)藥、能源、材料等產品的生物技術。它是人類由化石(碳氫化合物)經濟向生物(碳水化合物)經濟過渡的必要工具，是解決人類目前面臨的資源、能源及環(huán)境危機的有效手段。生物技術在工業(yè)上的應用主要分為兩類，一是以可再生資源(生物資源)替代化石燃料資源；二是利用生物體系如全細胞或酶為反應劑或催化劑的生物加工工藝替代傳統(tǒng)的、非生物加工工藝。

工業(yè)生物技術的核心工業(yè)生物技術的核心是生物催化(Biocatalysis)。由生物催化劑完成的生物催化過程具有催化效率高、專一性強、反應條件溫和、環(huán)境友好等優(yōu)勢。美國能源部、商業(yè)部等部門預測：生物催化劑將成為21世紀化學工業(yè)可持續(xù)發(fā)展的必要工具，生物催化技術的應用可在未來的20年中使傳統(tǒng)化學工業(yè)原材料、水和能源消耗減少30%、污染物排放減少30%。世界經合組織(OECD)指出：“工業(yè)生物技術是工業(yè)可持續(xù)發(fā)展最有希望的技術”[工業(yè)生物技術&生物催化含意：在工業(yè)規(guī)模的生產過程中使用或部分使用生物技術來實現(xiàn)產品的制造，這種技術是應用微生物和生物催化劑來提供產品和服務核心目標：大規(guī)模利用生物體系（如細胞或酶）作為催化劑實現(xiàn)物質轉化工業(yè)生物技術是生物技術的重要組成部分2001年，OECD在一些國家和地區(qū)進行了生物技術用于改造傳統(tǒng)工業(yè)的21個試驗。試驗主要是測試生物技術對傳統(tǒng)重污染工業(yè)的綠色改造效率：在改造紙漿和造紙行業(yè)方面，生物技術能減少漂白過程中10%—15%的氯排放量，并且將漂白過程中的能量消耗降低40%；在改造紡織業(yè)方面，生物技術可以減少14%—18%的水消耗量，與用水有關和空氣散熱方面的費用減少50%—60%，漂白過程的能源消耗也將降低9%—14%；塑料產品生產在改造方面，用生物有機原料替代石化原料，能夠減少20%—80%的對石化資源的需求，而且產品是可自然降解的“綠色塑料”；生物技術用于化學制藥行業(yè)，例如維生素B2的生產過程中，能夠減少80%的CO2排放量，減少67%的污水排放量。將生物技術用于頭孢類抗生素的生產，能夠減少50%的CO2排放量，節(jié)約20%的能源消耗，節(jié)水75%。中國高度重視工業(yè)生物技術的發(fā)展，2005年9月，由國家科技部中國生物技術發(fā)展中心組織了“首屆國際生物經濟高層論壇”在北京召開。在2006年頒布的《國家中長期科學和技術發(fā)展規(guī)劃綱要》中把“新一代工業(yè)生物技術”作為“前沿技術”列入規(guī)劃。工業(yè)生物催化和生物轉化的研究，是中國參與生物技術國際競爭的一個難得的機遇和切入點，也是我國生物技術應用研究的一個戰(zhàn)略重點，其最終目標是通過生物學、化學和過程科學的交叉，建立以生物催化和生物轉化為基礎的新生物加工體系。國際工業(yè)生物技術的研究熱點和未來趨勢當前生物催化和轉化技術具代表性的研究熱點包括以酶法生產甜味劑阿斯巴甜、L-苯丙酸、抗菌素中間體6-APA、D-對羥苯甘氨酸和1,3-丙二醇等。作為生物材料的代表產品聚乳酸，目前已有多家公司大規(guī)模生產。2000年全球以生物法生產的可再生的生物能源——液體燃料已近1000萬噸。1.工業(yè)生物催化劑改性和提高

生物催化劑是生物催化和轉化技術的核心。生物催化劑快速定向改造新技術已被用于上百個酶的進化，大大提高了生物酶的活性和效率。如枯草桿菌蛋白酶E在有機溶液中(60%DMF)的活性提高了170倍；今后生物催化劑的研發(fā)與改進需要追求如下目標：性能更好(包括選擇性、熱穩(wěn)定性、溶劑耐受性等)、催化范圍更廣、催化功能更多、催化速度更快、生產成本更低。這些目標可具體量化為：酶的溫度穩(wěn)定性提高到120℃—130℃、酶活性比現(xiàn)有的在水或有機溶劑中其活性增加100—10000倍、產率提高10—100倍、酶轉化率達到現(xiàn)有化學催化劑的水平；耐久性達到幾個月至幾年；提高了固定化酶或微生物的活性。近年來，這方面的研究工作主要集中在極端微生物、未培養(yǎng)微生物、共生微生物、非水相催化、分子定向進化、合理化設計等。

1.1極端微生物極端微生物的研究和應用已成為國際熱點，高溫DNA聚合酶、堿性酶、堿性纖維素酶、環(huán)糊精酶及極端采油菌已在產業(yè)上產生了重要影響。極端微生物研究涉及嗜高溫菌、嗜低溫菌、嗜鹽菌、嗜極端pH菌等。嗜高溫菌主要應用于食品工業(yè)和洗滌劑工業(yè)；嗜低溫菌有助于提高熱敏性產品的產量；嗜鹽菌由于在高鹽濃度下穩(wěn)定而被用于含鹽體系催化劑。現(xiàn)已篩選出30多屬中的70多種嗜高溫菌。最近的研究集中在與工業(yè)生物催化相關的極端酶的認定上，這些酶包括：酯酶/脂肪酶、糖苷酶、醛縮酶、腈水解酶/酰胺酶、膦酸酯酶、消旋酶等。

1.2非水相酶催化

非水相酶催化反應對一些傳統(tǒng)化學催化困難的過程具有重要意義。通過改變溶劑和相條件，可以得到不同空間結構和光學特性的聚合物。盡管非水相體系有諸多優(yōu)點，但是酶在有機相中由于分子間鍵能的變化，容易發(fā)生結構重排而失活。為了提高酶活性和使用壽命，可采用化學修飾、表面改性、固定化等多種方法，業(yè)已取得顯著的成果。1.3催化劑改造的方法學

自然界的酶都是在自然生理條件下進化而來的，當其應用到條件迥然不同的非生理條件下的工業(yè)制造過程中，往往穩(wěn)定性、活性或溶液的兼容性差，因此必須對生物催化劑進行適當改造以適應實際工程的需要。酶的改進技術主要集中于以下兩種方法：(1)基于酶結構和催化機理的理性分子設計；(2)基于隨機突變、DNA重排等技術的定向進化，如：易錯PCR(Error-pronePCR)和DNA改組(DNAshuffling)技術[7]。

2功能基因組學與代謝工程

代謝工程是在對細胞(包括微生物、植物、動物乃至人體細胞)內代謝途徑網絡系統(tǒng)分析的基礎上，進行定向的、有目的地改變，以更好地理解和利用細胞代謝進行化學轉化、能量傳遞和超分子組裝。代謝工程可在細胞與分子水平上認識和改造細胞[8]。代謝工程的核心與功能基因組密切相關。通過對不同細胞菌體進行遺傳改變并觀察識別所產生的生理響應，代謝工程工作者取得經驗并能找出基因組?螄生理學(或基因型?螄表型)之間的關系，從而進一步開展代謝工程研究。根據功能基因組(轉錄物組、蛋白質組及代謝物組)信息，可以進行代謝網絡重建、優(yōu)化及設計，進而通過代謝工程改進細胞菌體性能[9]。3系統(tǒng)生物學

隨著后基因組時代的到來，“系統(tǒng)生物學”這一學科的重要作用受到特別強調。根據系統(tǒng)生物學原理，充分利用不斷增加的基因組(序列)數據及生物信息學工具，有機結合轉錄組學、蛋白質組學，特別是代謝物組學進行代謝工程研究，結合生物信息學和計算生物學的研究，達到改造和控制細胞性質、提高底物利用及產品收率、促進工業(yè)生物技術發(fā)展的目的。

4未來發(fā)展趨勢的特點

世界各國在工業(yè)生物技術研發(fā)領域，不僅制定了近期及長遠的發(fā)展規(guī)劃，還在政策和資金上給予資助。目前工業(yè)生物技術的發(fā)展趨勢有以下特點：

(1)傳統(tǒng)的以石油為原料的化學工業(yè)發(fā)生變化，向條件溫和、以可再生資源為原料的生物加工過程轉移；

(2)利用生物技術生產有特殊功能、性能、用途或環(huán)境友好的化工新材料，特別是利用生物技術可生產一些用化學方法無法生產或生產成本高以及對環(huán)境產生不良影響的新型材料，如丙烯酰胺、殼聚糖等；

(3)利用生物生產工藝取代傳統(tǒng)工藝，如生物可降解高分子的生產；

(4)傳統(tǒng)的發(fā)酵工業(yè)已由基因重組菌種取代或改良；

(5)生物催化成為化工產品合成的支柱。

國外主要工業(yè)生物技術領域的研發(fā)現(xiàn)狀

目前，國際范圍內的工業(yè)生物技術研究開發(fā)領域主要集中于生物能源、生物材料和其它生物基產品三大方面。1生物能源(Bioenergy)

生物能源主要包括生物乙醇、生物柴油、沼氣、生物制氫等。為保障石油安全，美國、加拿大、歐盟、日本等國家在生物燃油的政策扶植和研發(fā)投入方面比較領先，取得了顯著的社會效益和經濟效益。2生物材料(Biomaterial)

廣義的生物材料可以理解為一切與生物體相關的應用性材料或由生物體合成的材料。按其應用可分為生物工程材料、生物醫(yī)用材料和其它生物材料。而按生物材料來源可分為天然生物材料和人工生物材料，有些材料兼具天然和人工合成的特性。狹義的生物材料指生物醫(yī)用材料，即能夠用來制作各種人工器官和制造與人工生理環(huán)境相接觸的醫(yī)療用具和制品的材料。

目前，由生物合成的聚乳酸(PLA)和聚羥基脂肪酸酯(PHA)是生物材料的典型代表，因其良好的性能及同時兼具生物工程材料和生物醫(yī)用材料應用特性而成為近年來研究最活躍的兩種生物材料。3其它生物基產品(bio-basedproducts)

目前，以生物質為原料，運用生物質煉制技術(Biomassrefinery)進行生物加工，可生產大宗化學品、精細化學品、醫(yī)藥中間體和各種清潔能源等，其中包括酶、香料、化妝品、潤滑劑、抗生素、殺蟲劑、植物生長催化劑、氨基酸、維生素、抗氧化劑以及其它化學制品等。

我國工業(yè)生物技術發(fā)展現(xiàn)狀及思考

中國工業(yè)生物技術是國際上發(fā)展較早、產業(yè)規(guī)模最大的領域之一。在微生物資源、基因組學、蛋白質組學、代謝工程、酶蛋白分子進化等研究領域呈現(xiàn)出快速成長的良好勢頭。產業(yè)技術水平與產品產量也呈快速增長趨勢，如丙稀酰胺、谷氨酸、檸檬酸、維生素C、青霉素等產品的產量已進入世界的前例；又如丙稀酰胺、維生素C、1,6-二磷酸-果糖、黃原膠、L-蘋果酸等產品的技術水平已達國際先進或領先；在生物能源方面也取得了較大的進展，如目前我國酒精產量為300多萬噸，僅次于巴西、美國列世界第三。但是我國生物技術的研究和產業(yè)技術總體水平與世界先進水平仍有較大的差距，國外代謝工程菌的工業(yè)化成功例子雖然不多，但在我國尚無一例代謝工程菌株進入中試試驗。由于國外已積累了較豐富的構建及使用代謝工程菌株的經驗，未來5年內預期將會有一批產品至少在中試規(guī)模用工程菌生產。我國相關大學和研究機構雖已開展了一些微生物功能基因組、代謝工程等的研究，但大多數研究仍停留在前期的單基因操作階段，而生物能源、生物材料和精細化學品的生物制造的研究和技術水平落后于發(fā)達國家。無論是原始創(chuàng)新的基礎研究，還是技術創(chuàng)新性研究，整體水平都落后于發(fā)達國家，因此急需加強與工業(yè)生物技術相關的應用基礎和技術開發(fā)的研究。

工業(yè)生物技術發(fā)展空間提升傳統(tǒng)產業(yè)生物能源環(huán)境生物技術生物材料底物生物反應器檢測控制儀表培養(yǎng)基（滅菌）經加工原料酶細胞生物催化劑（游離或固定化）機械能除菌空氣產品提取純化副產品產品廢物熱能原材料營養(yǎng)物典型工業(yè)生物技術過程核心技術？生物催化（Biocatalysis)利用酶或有機體（細胞或細胞器等）作為催化劑實現(xiàn)化學轉化的過程。生物轉化（Biotransformation)生物催化化學工業(yè)發(fā)酵工業(yè)輕工業(yè)采礦醫(yī)藥食品能源材料生物安全環(huán)境生物催化是工業(yè)生物技術的核心技術以生物催化法合成的主要產品

產品名稱產量丙烯酰胺10萬噸/年聚乳酸1.3萬噸/年阿斯巴甜2萬噸/年生物柴油與汽油1000萬噸/年抗菌素中間體6－APA0.9萬噸/年趨勢判斷和需求分析生物催化劑在精細化學品市場中呈現(xiàn)強勁的增長勢頭。到2020年，通過生物催化技術，將實現(xiàn)化學工業(yè)的原料消耗、水資源消耗、能量消耗降低30%，污染物的排放和污染擴散減少30%。趨勢判斷和需求分析目前生物催化技術已成為各公司爭奪的目標并且已成為一些公司謀求發(fā)展和提升地位的工具。Degussa、DSM、Roche、BASF、Dow、Lonza等許多跨國公司都在積極采取措施，擴大他們在生物催化領域里的生產能力。生物催化發(fā)展的主要推動力新產品需求(社會壓力)-健康：醫(yī)藥、檢測-日用品：洗滌用品、乳品、生物可降解塑料環(huán)境(法律法規(guī)壓力)－綠色化學、能源、溫室效應新發(fā)現(xiàn)或基礎研究(技術壓力）－基因工程/定點突變/定向進化、代謝工程、組合化學

得益/成本降低(商業(yè)壓力)-生物分離TheBiocatalysisCycle產物底物2.生物催化劑改造的方法學關鍵科學問題生物催化劑1.生物催化劑多樣性及其實現(xiàn)方法4.生物催化劑適應性原理5.重要催化反應體系3.生物系統(tǒng)催化的理論和方法初步建立生物催化和轉化的理論體系發(fā)展一批有自主知識產權的基礎技術發(fā)展數個重要合成途徑和相關專利技術多樣性（關鍵問題1）課題1：生物催化劑多樣性的研究及數據庫建設催化劑改造（關鍵問題2）課題2：生物催化劑改造方法學的基礎與應用研究系統(tǒng)催化(關鍵問題3)課題3：生物系統(tǒng)催化的理論和方法適應性原理(關鍵問題4)課題4：生物催化劑和人工環(huán)境互適應原理以及適于生物制造工程集成新方法的研究課題8：非水相不對稱催化特性課題6：糖苷酶及其催化反應特性課題5：腈水合反應和腈水解反應的方法學及催化機理課題7：生物催化氧化還原過程基本問題的研究生物制造(生物學、化學和工程學的交叉)關鍵理論和基本方法重要生物催化體系催化劑資源工程優(yōu)化催化劑改造生物催化劑工程的目標

開發(fā)生物催化劑：催化性能更好、更快，成本更低開發(fā)生物催化劑工具合：催化反應更廣泛，功能更多樣

改善性能:穩(wěn)定性,活性，溶劑兼容性開發(fā)分子模型:新酶的快速重新設計創(chuàng)造新技術:用于新生物催化劑的開發(fā)

生物催化劑發(fā)展的工業(yè)展望CompetitiveImperativeCurrentChemicalVarietiesCurrentBiocatalystsBiocatalystoftheFutureSpeedtoMarket2-5years10years2-3yearsCosttoManufacture$1-10/kg$10-100/kg$1-3/kgRangeofProductsBroadNarrowBroad生物催化劑工程技術瓶頸對生物催化劑作用機理缺乏深入的認識對次級代謝產物代謝途徑（包括途徑間相互關系）缺乏理解細胞工程化的方法十分有限（即代謝工程）生產酶和輔因子的成本過高當前生物催化的研究熱點新酶或已有酶的新功能的開發(fā)根據已有底物開發(fā)新的酶反應利用突變或定向進化技術改善生物催化劑性能利用重組DNA技術大規(guī)模生產生物催化劑利用有機溶劑或共溶劑開發(fā)新的反應體系體內或體外合成的多酶體系克服底物和產物抑制精細化工品或醫(yī)藥合成技術的放大輔因子再生生物催化劑的修飾生物催化劑的固定化生物催化劑高效生產與催化功能研究強化微生物細胞培養(yǎng)與發(fā)酵的調控措施，研究酶的誘導策略實現(xiàn)生物催化劑的自主和規(guī)模生產分析生物催化劑所催化的特定基團開辟全新的生物催化反應第二節(jié)研究內容一．概念：二．酶學研究簡史三．研究內容一．概念：酶工程（EnzymeEngineering）從應用目的出發(fā)研究酶，在一定的生物反應裝置中利用酶的催化性質，將相應原料轉化成有用的物質。是酶學和工程學相互滲透結合形成的一門新的技術科學，是酶學、微生物學的基本原理與化學工程有機結合而產生的邊緣科學。酶是生物細胞產生的、具有催化能力的生物催化劑。定義：酶是生物體內進行新陳代謝不可缺少的受多種因素調節(jié)控制的具有催化能力的生物催化劑。酶具有一般催化劑的特征：1.只能進行熱力學上允許進行的反應；2.可以縮短化學反應到達平衡的時間，而不改變反應的平衡點；3.通過降低活化能加快化學反應速度。酶的催化高效性通常要高出非生物催化劑催化活性的106~1013倍。2H2O22H2O+O21mol過氧化氫酶5×106molH2O21mol離子鐵6×10-4molH2O21.1酶的定義回本章目錄生物催化劑的發(fā)現(xiàn)微生物可培養(yǎng)微生物酶資源的開發(fā)利用不可培養(yǎng)微生物酶資源的開發(fā)利用基因已知基因的克隆未知基因的克隆二.酶學研究簡史1878德國的Kuhne

定義Enzyme原意為在酵母中1926美國的Sumner從刀豆中得到脲酶結晶（1947年諾貝爾獎）1970美國的Smith發(fā)現(xiàn)限制性內切酶（1979年諾貝爾獎）1969日本固定化氨基?；?，第一次將固定化酶成功地應用于工業(yè)生產?！腹こ陶Q生1986美國核酶發(fā)現(xiàn)獲得諾貝爾獎1.2酶的發(fā)現(xiàn)及研究歷史人們對酶的認識起源于生產與生活實踐。夏禹時代，人們掌握了釀酒技術。公元前12世紀周朝，人們釀酒，制作飴糖和醬。春秋戰(zhàn)國時期已知用麴(曲)治療消化不良的疾病。酶者，酒母也酶酒西方國家19世紀對釀酒發(fā)酵過程進行了大量研究。直到1897年，德國巴克納Buchner兄弟用石英砂磨碎酵母細胞，制備了不含酵母細胞的抽提液，并證明此不含細胞的酵母提取液也能使糖發(fā)酵，說明發(fā)酵與細胞的活動無關。從而說明了發(fā)酵是酶作用的化學本質，為此Buchner獲得了1911年諾貝爾化學獎。1896年,日本的高峰讓吉首先從米曲霉中制得高峰淀粉酶,用作消化劑,開創(chuàng)了有目的的進行酶生產和應用的先例。1878年,給酶一個統(tǒng)一的名詞，叫Enzyme，這個字來自希臘文，其意思“在酵母中”。后來對酶的作用機理及酶的本質做了深入研究，1930年，證實酶是一種蛋白質；80年代初發(fā)現(xiàn)了具有催化功能的RNA——核酶(ribozyme)，這一發(fā)現(xiàn)打破了酶是蛋白質的傳統(tǒng)觀念，開辟了酶學研究的新領域，現(xiàn)已鑒定出4000多種酶，數百種酶已得到結晶，而且每年都有新酶被發(fā)現(xiàn)。1908年,德國的羅姆制得胰酶,用于皮革的軟化。1908年,法國的波伊登(Boidin)制備了細菌淀粉酶,應用于紡織品的退漿。1911年,美國的華勒斯坦(Wallestein)制得木瓜蛋白酶,用于除去啤酒中的蛋白質渾濁。此后,酶的生產和應用逐步發(fā)展。然而在50年代以前停留在從微生物，動物或植物中提取酶,加以利用階段.由于當時生產力落后,生產工藝較繁雜,難以進行大規(guī)模工業(yè)化生產。酶的應用歷史1949年,用液體深層培養(yǎng)法進行細菌淀粉酶的發(fā)酵生產,揭開了近代酶工業(yè)的序幕。50年代以后,隨著生化工程的發(fā)展,大多數酶制劑的生產已轉向微生物流體深層發(fā)酵的方法。酶的應用越來越廣泛。50年代：開始了酶固定化研究。1953年德國科學家首先將聚氨基苯乙烯樹脂與淀粉酶,胃蛋白酶,羧肽酶和核糖核酸酶等結合,制成了固定化酶。60年代，是固定化酶技術迅速發(fā)展的時期。1969年,日本的千煙一郎首次在工業(yè)上應用固定化氨基酰化酶從DL-氨基酸生產L-氨基酸。出現(xiàn)了“酶工程”這個名詞來代表有效利用酶的科學技術領域。1971年第一屆國際酶工程學術會議在美國召開,當時的主題即是固定化酶，進一步開展了對微生物細胞固定化的研究。1973年,千煙一郎首次利用固定化的大腸桿菌細胞生產L-天冬氨酸。1978年,日本的鈴木等固定化細胞生產α-淀粉酶研究成功.所以說,70年代是固定化細胞技術取得進展的時期.80年代，固定化細胞已能用于生產胞外酶,因此,80年代又發(fā)展了固定化原生質體技術,排除了細胞壁這一障礙。在酶的固定化技術發(fā)展的同時,酶分子修飾技術也取得了進展。60年代，用小分子化合物修飾酶分子側鏈基團,使酶性質發(fā)生改變;70年代,修飾劑的選用、修飾方法上又有了新的發(fā)展。此外,對抗體酶,人工酶,模擬酶等方面,以及酶的應用技術研究,在近20年均取得了較大進展,使酶工程不斷向廣度和深度發(fā)展,顯示出廣闊而誘人的前景?；乇菊履夸?961年國際酶學委員會（EnzymeCommittee,EC）根據酶所催化的反應類型和機理，把酶分成6大類：1.3酶的分類與命名EC分類的六大類酶1.氧化還原酶類：催化氧化還原反應。2.轉移酶類：催化分子基團從一個分子轉移到另一個分子。3.水解酶類：催化水解反應。4.裂解酶類5.異構酶類6.連接酶類或合成酶類。Eachenzymeisnowclassifiedandnamedaccordingtothetypeofchemicalreactionitcatalyzes.Soanenzymeisassignedafour-numberclassificationandatwo-partname

calledasystematicname.InadditionrecommendednameissuggestedbyIUBforeverydayuse.E.C.X.X.X.X乳酸脫氫酶

EC1.1.1.27第1大類，氧化還原酶第1亞類，氧化基團CHOH第1亞亞類，H受體為NAD+該酶在亞亞類中的流水編號酶的命名有兩種方法：系統(tǒng)名、慣用名。系統(tǒng)名：包括所有底物的名稱和反應類型。乳酸+NAD+丙酮酸+NADH+H+乳酸：NAD+氧化還原酶慣用名：只取一個較重要的底物名稱和反應類型。乳酸：NAD+氧化還原酶乳酸脫氫酶對于催化水解反應的酶一般在酶的名稱上省去反應類型。氧化-還原酶催化氧化-還原反應。主要包括脫氫酶(dehydrogenase)和氧化酶(Oxidase)。如乳酸(Lactate)脫氫酶催化乳酸的脫氫反應。(1)氧化還原酶Oxidoreductase轉移酶催化基團轉移反應，即將一個底物分子的基團或原子轉移到另一個底物的分子上。

例如，谷丙轉氨酶催化的氨基轉移反應。(2)轉移酶Transferase水解酶催化底物的加水分解反應。主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。例如，脂肪酶(Lipase)催化的脂的水解反應：(3)水解酶hydrolase裂合酶催化從底物分子中移去一個基團或原子形成雙鍵的反應及其逆反應。主要包括醛縮酶、水化酶及脫氨酶等。例如，延胡索酸水合酶催化的反應。(4)裂合酶Lyase異構酶催化各種同分異構體的相互轉化，即底物分子內基團或原子的重排過程。

例如，6-磷酸葡萄糖異構酶催化的反應。(5)異構酶Isomerase合成酶，又稱為連接酶，能夠催化C-C、C-O、C-N以及C-S鍵的形成反應。這類反應必須與ATP分解反應相互偶聯(lián)。A+B+ATP+H-O-H===AB+ADP+Pi

例如，丙酮酸羧化酶催化的反應。丙酮酸+CO2草酰乙酸(6)合成酶LigaseorSynthetase（一）酶的化學本質1926年J.B.Sumner首次從刀豆制備出脲酶結晶，證明其為蛋白質，并提出酶的本質就是蛋白質的觀點。1982年T.Cech發(fā)現(xiàn)了第1個有催化活性的天然RNA——ribozyme（核酶），以后Altman和Pace等又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了真正的RNA催化劑。核酶的發(fā)現(xiàn)不僅表明酶不一定都是蛋白質，還促進了有關生命起源、生物進化等問題的進一步探討。酶的化學性質與催化特性（二）酶的組成酶單純酶結合酶（全酶）=酶蛋白+輔因子輔因子輔酶與酶蛋白結合得比較松的小分子有機物。輔基與膜蛋白結合得緊密的小分子有機物。金屬激活劑金屬離子作為輔助因子。酶的催化專一性主要決定于膜蛋白部分。輔因子通常是作為電子、原子或某些化學基團的載體。（三）單體酶、寡聚酶和多酶復合物1.單體酶（monomericenzyme)：僅有一條具有活性部位的多肽鏈，全部參與水解反應。2.寡聚酶(oligomericenzyme)：由幾個或多個亞基組成，亞基牢固地聯(lián)在一起，單個亞基沒有催化活性。亞基之間以非共價鍵結合。3.多酶復合物(multienzymesystem)：幾個酶鑲嵌而成的復合物。這些酶催化將底物轉化為產物的一系列順序反應。丙酮酸脫氫酶系（E.coli）：丙酮酸脫氫酶（EⅠ）、硫辛酰轉乙酰酶（EⅡ）和二氫硫辛酰脫氫酶（EⅢ）。EⅠEⅡEⅢ堿性EⅠEⅡEⅢ+EⅡEⅢ+脲(四)活性部位和必需基團必需基團：這些基團若經化學修飾使其改變，則酶的活性喪失?；钚圆课唬好阜肿又兄苯优c底物結合，并和酶催化作用直接有關的部位。必需基團活性部位維持酶的空間結構結合基團催化基團專一性催化性質酶作用的專一性結構專一性立體異構專一性族（基團）專一性絕對專一性(五)酶作用的專一性族專一性：可作用于一類或一些結構很相似的底物。絕對專一性：只能作用于某一底物。酶的催化作用受到底物濃度、酶濃度、溫度、pH值、激活劑濃度、抑制劑濃度等諸多因素的影響。在酶的應用過程中，必須控制好各種環(huán)境條件，以充分發(fā)揮酶的催化功能。(六)影響酶催化的各種因素1、酶活力與酶反應速度，比活力2、酶活力測定方法反應體系選擇/

反應條件確定反應物檢測/酶活力計算偶聯(lián)酶反應活力測定3、酶活力單位

1961年國際生物化學與分子生物學聯(lián)合會規(guī)定：在特定條件下（溫度可采用25℃或其它選用的溫度，pH等條件均采用最適條件），每1min催化1μmol的底物轉化為產物的酶量定義為1個酶活力單位。這個單位稱為國際單位。

(七)酶活力測定

dSdPu=-----=-----

dtdt回本章目錄（1）酶活性部位的化學鑒定鑒定酶分子的活性部位是研究酶催化功能的重要課題。分為四種方法：化學修飾；反應動力學；X-射線衍射以及蛋白質工程發(fā)展后基因核苷酸誘變法。.化學修飾：原則上講，酶分子的側鏈上的各種基團，羧基、羥基、氨基、吲哚基等均可作為化學修飾的對象，當其被一種化學試劑修飾后酶活力顯著下降甚至喪失則表明該基團為活性部位。分為a.非特異性修飾

b.差示標記

c.親和標記動力學分析法因酶蛋白是許多解離基團的兩性電解質。pH改變，必然影響解離基團的離解狀態(tài)。處于活性部位的離解基團的離解狀態(tài)變化，必然導致酶活變化，因此，研究pH與酶活的關系，可提供活性部位某些基團的pK值，進而推斷此基團的作用，通過動力學參數，如Vm和Km與pH的關系，可求解酶活性部位的離解基團。X-射線衍射化學標記和動力學分析可推斷酶活性部位的一級結構，酶活中心的空間結構信息需要用X-射線衍射分析。④定位誘變法。酶活的測定酶活力：在一定的條件下，酶所催化的反應速度。反應速度越大，意味酶活力越高。酶的反應速度，用單位時間內底物的減少量或產物的增加量來表示。

V=-ds/dt=dp/dt1.酶活力的測定方法步驟在酶活力測定過程中一定要選擇最合適的條件，使酶與作用底物反應一段時間后，再測定反應液中底物或產物的變化量。一般有如下步驟：（1）根據酶的專一性，選擇適宜的底物，并配制成一定濃度的底物濃度溶液。（2）根據資料或實驗結果，確定反應的溫度，pH等條件。（3）在一定的條件下，將一定量的酶液與底物溶液混合均勻，適時記錄反應開始時間。（4）反應一定的時間，取適量的反應液測定底物或產物的變化量。如不能立即測定結果，也應將酶反應終止。終止反應的方法：

a.反應時間一到，立即取出適量的反應液，置于沸水中，加熱使酶失活。

b.立即加入適宜的酶變性劑。

c.加入酸或堿，使體系pH迅速遠離反應的最佳pH。

d.將反應液置于冰水中，使反應溫度迅速降低至10°C以下。測定反應液中物質的變化量可采用光學檢測法，化學檢測法等生化檢測技術。2.酶活力單位酶火力的高低是以酶活力單位來表示的。為此酶活力單位需要一個確切的定義：1961年國際生化聯(lián)合會規(guī)定：在特定條件下，每1min催化1umol的底物轉化為產物的酶量定義為1個活力單位。這個單位稱為酶的國際單位（1U）。酶的比活力：在特定條件下，每1mg酶蛋白所具有的酶活單位數。有時也采用每1（m）l酶液或每g酶制劑的活力單位數來表示。酶的比活是為了比較酶制劑的純度和活力的高低。3.固定化酶活力的測定與水不溶性載體結合，在一定的空間范圍內起催化作用的酶稱為固定化酶。a.震蕩測定b.柱法測定c.連續(xù)測定d.固定化酶的比活力測定。在固定化酶的比活力測定中，一般采用每1mg干固定化酶所具有的酶活力單位數表示，即為[單位/mg干固定化酶]。為此在測量時，需要先測定濕固定化酶的酶活力，然后將固定化酶在一定條件下干燥，稱取固定化酶的干重，然后通過計算得出固定化酶的比活力。對于酶膜，酶板或酶管等固定化酶，其比活力則以單位面積的酶活力來表示，即[酶活力（單位）/cm2]e.酶結合效率與酶活力回收率的測定：將一定量的酶進行固定化時，不是全部酶都成為固定化酶，而總是有部分酶沒有與載體結合在一起。為了確定固定化效果，需要測定酶的結合效率或酶的活力回收率。酶的結合效率一般由加入的總酶活力減去未結合酶活力的差值與加入的總酶活力的百分比來表示。酶結合效率=加入的總酶活力-未結合酶活力加入的總酶活力×100%未結合酶活力，包括固定化后濾出的濾液以及洗滌固定化酶的洗滌液中所含有的酶活力和。酶活力回收率是指固定化酶的總活力與用于固定化的酶的總活力的百分比酶活力回收率=固定化酶總活力用于固定化的酶的總活力×100%當固定化方法對酶活力沒有明顯的影響時，酶結合率與酶活力回收率的數值相接近。然而固定化載體或固定化方法往往對酶活力有一定的影響，兩者的數值往往有很大的差別，所以通常都通過測定酶的結合效率來表示固定化的效果。f.相對酶活力的測定具有相同酶蛋白量的固定化酶活力與游離酶活力的比值稱為相對酶活力。固定化酶的相對酶活力與載體結構、顆粒大小、底物分子量大小以及酶結合效率等有密切的關系。相對酶活力的高低表明了固定化酶應用價值的大小，相對酶活力太低（<75%）的固定化酶，一般沒有實用價值。因此應重視固定化載體、固定化技術的研究改進。酶的結構和功能一.酶蛋白的結構特征酶蛋白和其他蛋白質一樣，由20種基本氨基酸按一定的順序排列，此即為酶蛋白的一級結構。具有一定結構的多肽鏈以一定規(guī)則的氫鍵形成-螺旋，-折疊，-轉角和自由盤繞等為二級結構。這些二級結構單元進一步盤曲折疊，形成環(huán)狀分子，即三級結構。若酶蛋白具有四級結構，則必須具有兩條或多條肽鏈。球狀分子表面以疏水作用力、范德華力、氫鍵等非共價鍵互相連接起來，形成完整的酶分子。這些組成四級結構最小單位的肽鍵稱為亞基，而把含亞基不太多的蛋白質稱為寡聚體蛋白酶。1.酶一級結構的特征a.氨基酸組成與酶功能的關系：酶蛋白中的氨基酸均為L-型氨基酸，其組成或多或少與所催化的反應性質和酶的來源有關。來源不同的同一酶或功能相似的酶，氨基酸組成相近，但不相同，存在生物種層間的差異，甚至存在個體、器官、組織間的差異。b.氨基酸的排列順序與酶的催化活性的關系。酶的一級結構與酶的催化活性有密切關系。酶的催化活性，取決于構成活性中心的少數氨基酸在整個肽鏈中的順序位置。同一酶和功能相近的酶，其活性中心附近的氨基酸序列具有驚人的相似性；序列間的差異一般發(fā)生在遠離活性中心的地方。C.主肽鏈結構特征及二硫鍵酶蛋白的主鏈不分支；同一肽鏈的不同位置點之間，或者不同肽鏈之間，可以通過胱氨酸的二硫鍵形成環(huán)，也可以通過輔基與肽鏈的不同位點之間以共價鍵或配位結合，形成一定的環(huán)狀結構，使分子結構相對穩(wěn)定。在酶分子中二硫鍵的位置和數目由整個一級結構決定了它的恒定性。二.酶蛋白的二級結構特征1.二級結構單元有-螺旋，-折疊，-轉角和無規(guī)則卷曲四種。它們是形成更高結構的基礎。2.-螺旋和結構的分布全-蛋白，即僅由-螺旋組成的蛋白質。全-蛋白，即僅由-折疊組成的蛋白質。+蛋白，由-螺旋和-折疊組成。/蛋白，-螺旋和-折疊交替出現(xiàn)。3.結構單元在酶結合配基過程中可以發(fā)生位移和轉變。三.酶蛋白的三級結構特征1.球形外貌X-射線衍射法分析酶亞基或多或少呈現(xiàn)球形外觀。2.三級結構的一般規(guī)律許多酶分子亞基自發(fā)形成特定三維結構時，-折疊總是沿主肽鏈方向呈右扭曲，構成圓桶形或馬鞍形結構骨架，而且平行的-折疊結構的實例居多。3.結構