液相色譜應用案例（二）廖杰liaojie301@163.com液相色譜應用案例在藥物研究開發(fā)中的應用質(zhì)量研究藥物代謝在生物標志物研究與分析中的應用DHPLC與基因診斷體液中氨基酸分析體液中兒茶酚胺的測定其它應用蛋白質(zhì)組研究中的色譜預分離藥物研究開發(fā)過程中的液相色譜靶標鑒定/確認生物標志物的分離/鑒定藥物發(fā)現(xiàn)藥物開發(fā)臨床研究生產(chǎn)銷售藥物設(shè)計/合成/鑒定/篩選/毒性評價確定候選藥物原料和制劑的臨床前研究藥學/藥理毒理純化/鑒定代謝組學研究確證結(jié)構(gòu)/質(zhì)量研究/制定質(zhì)量標準/穩(wěn)定性研究/動物體內(nèi)藥代申報檢驗療效和毒性質(zhì)量控制療效/毒性長期研究人體藥代/長期穩(wěn)定性研究/臨床用藥的質(zhì)量控制QA/QC批準上市疾病研究20年抗放藥物研究的基本情況———————————————————————

研究項目數(shù)量(X)(Xx100)/7000x%———————————————————————————

在小鼠上試驗過的化合物7000100.0

對小鼠有抗放作用的化合物>2303.3

在狗上試驗過的化合物>701.0

對狗有效的化合物>300.43

能上人進行研究的化合物140.2

臨床上進行擴大研究的藥物40.057———————————————————————應用實例：新型COX-2抑制劑的研制COX抑制劑NSAIDsCOX（環(huán)氧化酶）COX-1COX-2PGs合成調(diào)節(jié)外周血管阻力保護胃腸道粘膜調(diào)節(jié)血小板聚集PGs合成促進炎癥反應和組織損傷COX-2抑制劑AA→PGs化合物設(shè)計系列化合物合成化合物純化/鑒定活性篩選，確定候選藥物質(zhì)量研究，制定質(zhì)量標準影響因素試驗，加速試驗藥效學實驗穩(wěn)定性考察藥理毒理實驗制劑研究毒性實驗藥代動力學研究臨床前申報批準后進行I期、II期和III期臨床試驗毒性評價建立HPLC分析方法——確定應用目的純度檢查/質(zhì)量控制（鑒別/有關(guān)物質(zhì)檢查/含量測定）/代謝研究分離對象——原料/制劑/體液/組織定量分析/定性分析常量/痕量主成分/相關(guān)雜質(zhì)常規(guī)質(zhì)控/實驗室研究建立HPLC分析方法——了解中間體和副產(chǎn)物合成路線（略）建立HPLC分析方法——初步建立方法選擇色譜分離條件

確定檢測波長254nm

色譜圖（略）建立HPLC分析方法——方法優(yōu)化與驗證有關(guān)物質(zhì)檢查檢測波長的確定面積歸一化法/自身對照法（<0.5%）系統(tǒng)適用性試驗——理論塔板數(shù)、主峰與相鄰雜質(zhì)的分離度供試品溶液的穩(wěn)定性方法驗證——專屬性、精密度、最低檢出限色譜圖（略）主成分及相鄰雜質(zhì)的MS1圖（略）主要雜質(zhì)的LC-離子阱質(zhì)譜鑒定主成分及相鄰雜質(zhì)的MS2圖譜（略）建立HPLC分析方法——方法優(yōu)化與驗證原料與制劑的含量測定確定定量方法/含量限度系統(tǒng)適用性試驗——理論塔板數(shù)、主峰與相鄰雜質(zhì)的分離度供試品溶液的穩(wěn)定性方法驗證——專屬性、線性、精密度、回收率、耐用性各三批供試品測定批號￥￥￥片劑的溶出曲線建立HPLC分析方法——方法優(yōu)化/驗證/實施片劑溶出度的測定專屬性精密度線性回收率方法的耐用性與UV法比較建立HPLC分析方法——方法優(yōu)化與驗證強酸破壞強堿破壞氧化劑破壞原料和制劑穩(wěn)定性研究高溫/高濕/光照試驗加速試驗長期留樣品色譜圖（略）建立HPLC分析方法

——動物體內(nèi)代謝的研究選擇內(nèi)標化合物預處理方法的確定建立色譜分離和檢測方法分析方法的確證與實施主要代謝產(chǎn)物的鑒定血漿藥物濃度測定方法——內(nèi)標的選擇內(nèi)標的選擇：結(jié)構(gòu)類似；非內(nèi)源性物質(zhì)；穩(wěn)定性好目標化合物及內(nèi)標的結(jié)構(gòu)式（略）血漿藥物濃度測定方法——預處理方法血漿藥物濃度測定方法——分離檢測方法12色譜條件（略）熒光檢測紫外檢測ABCABC方法的專屬性——內(nèi)源性物質(zhì)、代謝產(chǎn)物不干擾分離線性——……定量限——……日內(nèi)和日間精密度——三個濃度（……

）準確度穩(wěn)定性——血漿室溫放置24hr、-20℃和室溫反復凍融血漿藥物濃度測定方法——方法的確證日期截距（×10-3）斜率(×10-3)相關(guān)系數(shù)r2005-5-238.426.360.99882005-6-4-1.417.290.99832005-7-2511.876.630.99812005-8-1614.267.020.99762005-8-1911.608.290.99632005-8-2023.847.610.9991血漿藥物濃度測定方法——實際樣品測定每一分析批建立一條標準曲線，同時攜帶QC樣品，分散在整個待測樣品分析過程的前、中、后進行測定，以保證每個分析批的準確性比格犬口服片劑顆粒血漿藥物濃度隨時間的變化血漿藥物濃度測定方法——實際樣品測定體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化研究——代謝物分離色譜圖（略）樣品前處理：……體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化研究——代謝物制備色譜條件：……1234色譜圖（略）體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化研究——代謝物鑒定ESI-MSn分析條件：電噴霧離子源（ESI），正離子方式檢測，噴射電壓6KV；毛細管溫度250℃；毛細管電壓21V；管透鏡補償電壓55V；碰撞氣為He；鞘氣（N2）流速為25流量單位（a.u.）；輔助氣（N2）流速為35流量單位（a.u.）；注射泵進樣速度5L·min-1；采集范圍：m/z50~800。M1M2M4化學結(jié)構(gòu)（略）BiomarkerAnalysis蛋白質(zhì)組研究中的色譜預分離蛋白質(zhì)組(proteome=protein

+

genome):

一種細胞、組織或生物體完整基因組所對應的全套蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)組學proteomics——研究細胞內(nèi)全部蛋白質(zhì)的組成及其活動規(guī)律的科學對照樣品疾病樣品疾病特異蛋白圖象處理蛋白質(zhì)分析蛋白質(zhì)切割酶切質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索疾病相關(guān)蛋白質(zhì)組研究流程圖溶液或膠上酶切溶液酶切全溶液酶切蛋白質(zhì)提取液超聲破碎、離心SDS-PGGE多肽混合物膠上酶切cLC-MS/MS2DE膠上酶切多肽混合物MSorcLC-MS/MS2DLC多肽混合物細胞、組織或體液cLC-MS/MSorMUPIT多肽混合物cLC-MS/MSorMUPITHPLC/ALIEFSDS/RPLCcLC-MS/MSorMUPIT生物信息學分析

蛋白質(zhì)組研究技術(shù)路線流程圖LoadingPump1or2EnrichmentColumnsWasteNanoLCPumpInjectorNanoboreColumnIonTrapanalysisSCXColumnSaltasgradientorsteps01020304050607080Time[min]20mMHCOONH440mMHCOONH460mMHCOONH480mMHCOONH4100mMHCOONH4150mMHCOONH4250mMHCOONH4CapillaryornanoLCPumpInjectorSCXColumnSaltgradientCollectedfractionsLoadingPumpInjector1or2EnrichmentColumnsWasteNanoLCPumpNanoboreColumnIonTrapanalysis1990’s2000FutureGene

DiscoveryDiscovery

of

VariationsVariationLinkage

toDiseaseDiagnostics

and

PharmacogeneticsDHPLC與基因診斷SubstitutionsACCGTCAAC...GCGACCTTGGCAGTTG…CGCTGGTACCGTCCAC...GCGACCTTGGCAGGTG…CGCTGGTTransversion:exchangeofapurineforapyrimidineA->CPurine->PyrimidineInsertions5’ACCGTCAACGACCT3’3’TGGCAGTTGCTGGT5’TCGGATAGCCTA5’ACCGTTCGGATCAACGACCT3’3’TGGCAAGCCTAGTTGCTGGT5’Deletions5’ACCGTCAAC...GCGACCT3’3’TGGCAGTTG…CGCTGGT5’5’ACCGTCAACGACCT3’3’TGGCAGTTGCTGGT5’C…GG…CDHPLC分離原理DHPLC的分離模式Nondenaturing:50C

(SizeDependent,SequenceIndependent)

High-Resolution

dsDNAFragmentSeparations

bp587458434298257+26717410280Partiallydenaturing:52-78C

(SizeandSequenceDependent)

dsDNAMutationDetectionbydHPLCPartiallydenaturing:52-78C

(SizeandSequenceDependent)

SNPDetectionEightdifferentpolymorphismsincludingadeletion,insertionandahomozygouschangeinoneamplicon.Heterozygous

7(SNP)Heterozygous

6(SNP)Heterozygous

5(1bpinsertion)Heterozygous

4(SNP)Heterozygous

3(1bpdeletion)Heterozygous

2(SNP)Heterozygous

1(SNP)WildtypemixedwithhomozygousmutantWild

type體液中氨基酸分析體液中游離氨基酸水平反映了機體的營養(yǎng)和代謝狀態(tài)，氨基酸的水平及改變，與某些疾病，如肝病、肝性腦病、腎病，以及某些先天性、代謝性疾病有關(guān)。特別是必需氨基酸與非必需氨基酸比值、支鏈氨基酸與芳香氨基酸比值的測定，在臨床上具有一定的診斷和判斷預后的意義。TheAminoAcidsCode氨基酸分析方法柱后衍生離子交換色譜-茚三酮-570nm/440nm柱前衍生衍生-反相色譜-熒光檢測或UV檢測色譜柱：WatersNovPakODS柱（3.9mmx150mm）及保護柱流動相：A0.05mol/L醋酸鹽緩沖液，pH6.8，含8%乙腈；B乙腈梯度洗脫熒光檢測：激發(fā)波長335nm，發(fā)射波長455nm樣品前處理：血漿—加入內(nèi)標（磺基同型半胱氨酸）—沉淀蛋白—衍生化血漿同型半胱氨酸

血漿中游離Hcy大約占總量的<2%以下。Hcy值可以作為一種疾病預警指標，即血液中同型半胱氨酸含量升高，標志著動脈粥樣硬化的發(fā)生，是動脈血栓形成的獨立危險因子。尿中三甲基組氨酸

3-甲基組氨酸是骨骼肌肌動蛋白和肌球蛋白的降解產(chǎn)物，測定尿中3-甲基組氨酸的排泄量，有助于了解肌組織收縮蛋白的降解情況，從而掌握肌肉所承受的運動負荷。色譜柱：Shim-ODS(4.6mmx250mm)柱，5μｍHypersil-C18流動相：A四氫呋喃：甲醇：磷酸鹽緩沖液5：95：900；B甲醇，梯度洗脫熒光檢測：激發(fā)波長260nm，發(fā)射波長455nm樣品前處理：收集尿液—加入內(nèi)標（乙醇胺）—衍生化LC/MS/MS用于氨基酸代謝紊亂的篩查PKU——一種常見的遺傳性氨基酸代謝疾病，因患者體內(nèi)缺乏苯丙氨酸羥化酶，苯丙氨酸不能正常代謝。中國PKU的發(fā)病率是1：11180MSUD——一種染色體隱性遺傳性疾病，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸這三種支鏈氨基酸的代謝受阻，導致BCAA及其衍生物α-酮酸在體內(nèi)聚積，對腦組織產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用。體液中兒茶酚胺的測定內(nèi)源性生物胺，由腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細胞中β-羥化酶催化合成，同時受多種酶活性的影響尿——原發(fā)性高血壓/嗜鉻細胞瘤血漿——帕金森病、心臟病、神經(jīng)脊瘤、甲亢腦脊液——研究生物胺在神經(jīng)系統(tǒng)的生理病理條件的作用樣品前處理：血漿—加入內(nèi)標（3，4-二羥基芐胺）—過氧化鋁柱提取—沉淀蛋白色譜柱：

Hypersil-C184.6mmx250mm，5μｍ流動相：0.1mmol/L磷酸二氫鈉水溶液（含辛烷磺酸鈉0.85mmol/L，0.5mmol/LEDTANa2）：甲醇89：11（用磷酸調(diào)pH至3.25）電化學檢測：工作電壓+0.85mV1去甲腎上腺素2腎上腺素3DHBA4多巴胺

血漿中兒茶酚胺最低檢出限：E:0.25ng；NE:0.3ng；DA:0.20ng樣品前處理：血漿—加入內(nèi)標（3，4-二羥基芐胺）—過氧化鋁柱提取—沉淀蛋白色譜柱：

Hypersil-C184.6mmx250mm，5μｍ流動相：0.1mmol/L磷酸二氫鈉水溶液（含辛烷磺酸鈉0.85mmol/L，0.5mmol/LEDTANa2）：甲醇89：11（用磷酸調(diào)pH至3.25）電化學檢測：工作電壓+0.85mV1去甲腎上腺素2腎上腺素3DHBA4多巴胺

血漿中兒茶酚胺最低檢出限：E:0.25ng；NE:0.3ng；DA:0.20ng樣品前處理：尿液（稀釋/過濾）—加入內(nèi)標（5-羥基吲哚-乙酰胺）—衍生化色譜柱：

Cosmosil5C18

4.6mmx250mm，5μｍ流動相：乙腈：10mmol/L醋酸緩沖液（pH6.0）35：65熒光檢測：λex345nm，λem480nm15-羥基吲哚胺2腎上腺素35-羥吲哚45-羥色胺5內(nèi)標尿中兒茶酚胺(熒光衍生化)最低檢出限：腎上腺素5.6fmol去甲腎上腺素4.8fmol5-羥色胺18.0fmol組織中腺嘌呤核苷酸的測定樣品前處理：組織—液氮凍結(jié)—高氯酸冰浴勻漿—調(diào)pH色譜柱：

ZorbaxSB-C184.6mmx150mm，5μｍ流動相：50mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH5.8）/甲醇：76/24（含離子對試劑A5mmol/L）紫外檢測：259nm腺嘌呤核苷酸（ATP、ADP、AMP）是生物