LOGOHPLC應用與操作技術藥物分析教研室鄭楓

樣品的性質和分離目的HPLC方法建立的步驟樣品前處理方法的選擇檢測器的選擇選擇、優(yōu)化色譜分離條件定量分析定性分析純化物質方法學確證常規(guī)樣品：色譜柱：正相、反相流動相：改變流動相組成：離子抑制、離子對

改變流動相洗脫方式：等度、梯度洗脫

樣品：衍生化對映異構體：手性高效液相色譜HPLC條件的選擇《PracticalHPLCMethodDevelopment》L.RSnyder，J.J.Kirkland《實用高效液相色譜方法建立》

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一、藥物衍生化的目的減小前處理難度或增加穩(wěn)定性；123改善色譜分離；提高檢測性能；改善色譜分離。有利于復雜樣品的衍生化分析。柱前衍生化柱后衍生化復雜樣品衍生化難度大。不改善色譜分離，反而可能造成峰展寬。特點限制二、衍生化方式1324反應定量迅速易于分離檢測反應選擇性高方便，通用性好三、衍生化反應的要求氨基酸的紫外衍生化試劑+異硫氰酸苯酯茚三酮+紫外衍生化反應熒光衍生化反應衍生化試劑的基本結構示意圖磺酰氯類試劑胺類和氨基酸的熒光衍生化試劑+丹酰氯，DNS-Cl激發(fā)波長：350-370nm發(fā)射波長：490-540nm含有羰基的試劑胺類和氨基酸的熒光衍生化試劑鄰苯二甲醛（OPA）

+特點：本身無熒光，產(chǎn)物有熒光；反應迅速，適合柱后衍生化。激發(fā)波長：340nm發(fā)射波長：455nm福多斯坦衍生化示例福多司坦半胱氨酸+++氨基酸常用衍生化試劑的比較衍生化試劑優(yōu)點缺點鄰苯二甲醛（OPA）反應迅速；可檢測形式多；試劑不發(fā)熒光。不能與二級氨基酸直接反應；衍生物不穩(wěn)定。異硫氰酸酯（PITC）與一、二級氨基酸都可以反應；穩(wěn)定，衍生副產(chǎn)物對測定無干擾；紫外檢測。需除去衍生試劑；樣品制備需較長時間；PITC毒性大；靈敏度較低丹酰氯（DNSCl）反應迅速；可檢測形式多；剩余衍生試劑不需除去；可與二級氨基酸反應；衍生物較穩(wěn)定。DNSCl水解產(chǎn)物也可發(fā)射強熒光，干擾測定；反應要在避光條件下進行；專屬性差定量限：300ng/ml質譜衍生化反應增加色譜保留定量限：50ng/ml福多司坦測定方法的比較方法一方法二方法三方法四固定相

C18C18C18NH2流動相乙腈-水(含0.02M戊烷磺酸鈉）乙腈-水甲醇-水甲醇-水檢測器紫外（210nm）直接測定熒光（FD）柱前衍生化質譜（MS）柱前衍生化串聯(lián)質譜（MS-MS）直接測定定量限10μg/mL300ng/ml50ng/ml10ng/ml文獻中國新藥雜志2004藥學學報2005J.MassSpectrom.2006尚未發(fā)表分離：色譜柱：正相、反相流動相：改變流動相組成：離子對

檢測：換用靈敏度更高的檢測器衍生化：同時改善分離和檢測

HPLC條件的選擇羰基化合物的熒光衍生化試劑丹酰肼（DNSH）+羧酸的熒光衍生化試劑香豆素類試劑+4-溴甲基-7-甲氧基香豆素（BrMMC）激發(fā)波長：325nm發(fā)射波長：400nm電化學衍生化標記反應還原衍生試劑電化學衍生化標記反應氧化衍生試劑衍生化反應選擇策略1.根據(jù)分析要求（基質復雜性、靈敏度等）選擇衍生化反應類別；靈敏度：質譜>熒光>紫外2.根據(jù)被分析物結構特點選擇相應類別的衍生物試劑；3.進一步優(yōu)化測定條件，進行方法學驗證。梯度洗脫技術（gradientelution）

等度定義：色譜分離過程中，流動相中有機相比例或離子強度、pH值不斷改變的洗脫方式。目的：適用于保留范圍寬的多組分復雜樣品。梯度流動相洗脫方式isocraticelution梯度洗脫的應用特點（1）解決組分k值差距過大對分離帶來的困難；（2）解決組分在色譜柱上殘留問題；（3）進樣量體積較大時產(chǎn)生峰展寬方式：在開始一段時間內，使用洗脫能力較弱的流動相，隨著流動相洗脫強度增加，色譜保留較強的組分較快被洗脫，縮短分析時間。

（4）改善峰型常見洗脫方式應用最多的是有機相比例隨著分離時間不斷發(fā)生變化，洗脫類型：方式選擇預實驗梯度范圍調整分離度1234梯度洗脫判斷各組分保留性質確定是否需要梯度確定流動相起始和最終比例改變流動相比例變化速率混合物分離的梯度洗脫方法建立步驟時間（min）20%甲醇（0.5%甲酸）80%甲醇（0.5%甲酸）010001.0001004.0001004.0110006.001000梯度洗脫的不足（1）方法建立更為復雜、困難；（