流式細胞術原理(yuánlǐ)及應用第一頁，共61頁。一、什么(shénme)是流式細胞術？流式細胞儀的構造二、怎樣設計流式實驗？三、流式實驗中涉及到的關鍵步驟四、常見流式細胞術應用第二頁，共61頁。一、流式細胞術基本概念流式細胞術（FlowCytometry）是對于處在快速直線流動中的細胞和生物顆粒進行多參數(shù)、快速的定量分析和分選技術.研究(yánjiū)對象為生物顆粒，如各種細胞、微生物及人工合成微球等。對生物顆粒的物理參數(shù)及生物學特性進行定性和定量分析。第三頁，共61頁。第四頁，共61頁。流式細胞儀構造(gòuzào)圖第五頁，共61頁。流式細胞儀五大(wǔdà)系統(tǒng)流動室與液流驅動系統(tǒng)(xìtǒng)激光光源及光束成形系統(tǒng)(xìtǒng)光學系統(tǒng)(xìtǒng)信號檢測與分析系統(tǒng)(xìtǒng)細胞分選系統(tǒng)(xìtǒng)第六頁，共61頁。流動室與液流驅動(qūdònɡ)系統(tǒng)InjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluid流動(liúdòng)室，430×180um,鞘液1.空氣(kōngqì)加壓進樣2.蠕動泵精確定量進樣第七頁，共61頁。激光光源(guāngyuán)與光束成形系統(tǒng)1.氬離子(lízǐ)氣體激光器，22×66um2.固體激光器405nm,488nm,561nm,635nm第八頁，共61頁。光學系統(tǒng)透鏡(tòujìng)、濾光片、小孔；LP：long-passfilterSP：short-passfilterBP：band-passfilter460500540SP500LP500BP500/50第九頁，共61頁。信號(xìnhào)檢測與分析系統(tǒng)物理參數(shù)(cānshù)FSC：前向角散色光，代表細胞大小SSC：側向角散色光，代表細胞顆粒度第十頁，共61頁。粒細胞單核細胞淋巴細胞紅細胞(xìbāo)、死細胞(xìbāo)和碎片實驗中，常利用FSC和SSC這兩種參數(shù)的組合，區(qū)分不同的細胞群體，去除(qùchú)碎片、死細胞和粘連細胞的干擾。第十一頁，共61頁。閾值：溶液中的雜質或者死細胞，很容易產生微小的干擾信號，所以必須設置閾值，排除雜質、細胞碎片或體積較小的死細胞。FSC反映(fǎnyìng)細胞體積的大小，F(xiàn)CM應用時常選取FSC設定閾值。5%32%默認(mòrèn)閾值升高(shēnɡɡāo)閾值后第十二頁，共61頁。熒光信號細胞自發(fā)熒光特異(tèyì)熒光素標記激發(fā)的熒光信號熒光信號的線性測量和對數(shù)測量---光電倍增管1）檢測光子，轉換成電信號2）將電信號等比例的放大熒光信號的面積、寬度和高度第十三頁，共61頁。由于光信號比較弱，需將其等比例放大，方便計算機分析處理，一般(yībān)信號的放大可以使用線性或對數(shù)兩種方式。一般(yībān)FSC和SSC變異范圍較小，故使用線性放大；熒光信號變異范圍較大，多使用對數(shù)放大。線性測量：DNA含量、RNA含量、總蛋白(dànbái)含量對數(shù)測量：細胞膜表面抗原檢測第十四頁，共61頁。直方圖（DistributionHistogram）橫坐標：道數(shù)縱坐標：細胞(xìbāo)數(shù)散點圖（DotPlot）橫坐標：某細胞參數(shù)相對(xiāngduì)含量縱坐標：該細胞另一參數(shù)含量等高線圖（ContourPlot）第十五頁，共61頁。細胞(xìbāo)分選系統(tǒng)MACS?技術(jìshù)：MageticActivatedCellSorting免疫學+細胞生物學+磁力學電荷式分選超聲振動器(15-100kHz)液流充電系統(tǒng)高壓(gāoyā)偏轉板收集裝置(流式管、離心管、培養(yǎng)板、載波片等)第十六頁，共61頁。第十七頁，共61頁。二、熒光(yíngguāng)素熒光(yíngguāng)的概念：

激發(fā)(jīfā)波長Excitationwavelength發(fā)射波長(熒光波長)Emissionwavelength＜第十八頁，共61頁。激發(fā)光譜：特異性地激發(fā)某種熒光素的一定波長范圍內的光發(fā)射光譜：某一波長激發(fā)光引起(yǐnqǐ)熒光素發(fā)射的熒光熒光素（FITC/PE/PerCP/APC等)抗體偶聯(lián)熒光素；分子探針結合熒光素AnnexinV-FITC；熒光染料(rǎnliào)/熒光化合物PI、7-AAD等插入核酸鏈中；CFSE和蛋白質共價結合；熒光蛋白-如GFP、RFP、YFP、CFP、mCherry、DsRed等，自身發(fā)熒光。第十九頁，共61頁。常用(chánɡyònɡ)熒光素第二十頁，共61頁。常用(chánɡyònɡ)熒光染料PI（碘化丙啶535,623）可選擇性的插入核酸雙螺旋堿基對中。常用于DNA分析，需要用RNase處理細胞排除RNA對DNA熒光(yíngguāng)定量的影響；PI不能透過活細胞膜，常用于鑒定死細胞。7-AAD（7-氨基放線菌素D545,647）以插入的方式與DNA鏈的G-C堿基對結合，不能透過活細胞膜，常用于鑒定死細胞。DAPI（4,4,6-二脒基二苯基吲哚358,456）可以非嵌入方式與DNA鏈上的A-T堿基對特異性結合。變異系數(shù)明顯小于其他染料，一種理想的DNA定量染料。Hoechst（343,450）常見為Hoechst33342和Hoechst33258，非嵌入的方式與DNA鏈上的A-T堿基對結合。能對活細胞染色，用于活細胞DNA定量分析，如精子分選；還用于側群細胞的分選。PY（派若寧560,573）RNA染料，能進入活細胞。AO（吖啶橙509,525）DNA、RNA染料，染色后DNA呈黃綠色熒光(yíngguāng)，RNA呈橙黃色熒光(yíngguāng)，可進行DNA/RNA雙參數(shù)分析。第二十一頁，共61頁。三、如何設計(shèjì)流式實驗確定實驗(shíyàn)要檢測的marker選擇合適的熒光素標記的抗體選擇合適的同型對照抗體細胞處理(chǔlǐ)（全血，培養(yǎng)的細胞）染色（室溫，20min）離心洗滌（全血裂紅）上機檢測準備工作：實驗步驟：第二十二頁，共61頁。A、根據(jù)機器配置選擇熒光素多色標記熒光素搭配原則：每個通道只能(zhīnénɡ)選擇一種熒光素；各個通道之間的熒光素可以隨意搭配。FACSCalibur常用四色搭配：FITC、PE、PerCP、APC。1)熒光(yíngguāng)素的選擇：第二十三頁，共61頁。B、根據(jù)抗原表達(biǎodá)強弱合理分配熒光素熒光素的強度：染色(rǎnsè)指數(shù)StainIndexStainIndex=D/WCD4第二十四頁，共61頁。高表達的抗原可用不太“亮”的染料，更“亮”的熒光(yíngguāng)素分配給表達低的抗原：CD4-FITC、CD25-APC、FoxP3-PEFSCSSCCD4FITCSSCCD25APCFoxp3PE第二十五頁，共61頁。盡量選擇(xuǎnzé)光譜重疊小的熒光素，如FITC/PE-Cy7；選擇(xuǎnzé)不同激光激發(fā)的熒光素，如FITC/APC，PE/APC；C、選擇(xuǎnzé)光譜重疊小的染料第二十六頁，共61頁。D、盡量避免偶聯(lián)染料使用(shǐyòng)帶來的假陽性0hour2hours22.5hoursPECD3PE-Cy5CD8PE-Cy7樣本(yàngběn)曝光時間第二十七頁，共61頁。3）流式試驗對照(duìzhào)設置A、空白對照NegativeControl細胞內物質自身也發(fā)出熒光，能被FCM靈敏的檢測到，這種未染色的細胞自身發(fā)出的一些熒光稱為自發(fā)熒光。設置空白對照（未染色的細胞），用以區(qū)分(qūfēn)細胞的自發(fā)熒光和特異性熒光，避免假陽性的結果。第二十八頁，共61頁。流式結果中熒光強弱是一個相對值，光電倍增管電壓越大，電子信號越強；電壓越小，信號越弱。通過調節(jié)電壓，使陰性對照管的熒光強度(qiángdù)處于陰性的位置，實驗組的熒光值都是相對對照組。001001002第二十九頁，共61頁。同型對照抗體：與實驗染色的單克隆抗體特異性無關的免疫球蛋白亞型（Fc段相同，F(xiàn)（ab’）2段不同）與染色的單克隆抗體：①相同種屬來源(láiyuán)②相同免疫球蛋白及亞型③相同熒光素標記④相同劑量和濃度⑤但由未免疫動物血清純化而來用此消除由于抗體非特異性結合到細胞表面Fc受體而產生的背景染色B、同型對照(duìzhào)IsotypeControl第三十頁，共61頁。C、陽性(yángxìng)對照PositiveControl設置陽性對照是為了檢測熒光抗體是否有效，并不是每次分析時都必須設置：使用新的熒光素抗體時；使用存儲時間較長的熒光素抗體時。設置陽性對照的方法：用肯定表達有該抗原的細胞來檢測；已經證明(zhèngmíng)有效的、偶聯(lián)其他熒光素的該抗原的抗體。第三十一頁，共61頁。什么是熒光補償(bǔcháng)？糾正熒光素發(fā)射光譜重疊為什么要進行補償(bǔcháng)調節(jié)？520400500600700575665FITCPEPC5laserD、單標對照(duìzhào)SingleStainingControl第三十二頁，共61頁。第三十三頁，共61頁。補償調節(jié)(tiáojié)方法：FL-1(FITC)FL-2(PE)FL-1(FITC)FL-2(PE)FL2-%FL1FL-1(FITC)FL-2(-)FL-1(-)FL-2(PE)FL1-%FL2BeforeCompensationAfterCompensationFITC單標PE

單標第三十四頁，共61頁。什么樣的補償(bǔcháng)最合適？單染管的陰性(yīnxìng)群體和陽性群體在所需調節(jié)通道的熒光Median值相等時為最合適的補償。UncompensatedCompensatedFL1-FITCstainFL2-nostainFL1-FITCstainPE-Medianneg<PE-MedianposPE-Medianneg=PE-MedianposPE-Medianneg>PE-MedianposFL1-FITCstainOvercompensated第三十五頁，共61頁。準確(zhǔnquè)補償?shù)闹匾缘谌?，?1頁。補償調節(jié)(tiáojié)要合適未補償(bǔcháng)正確(zhèngquè)補償FITC-PE補償太大PE-FITC補償太大第三十七頁，共61頁。使用(shǐyòng)單種熒光素標記的單克隆抗體和其余熒光素對應的同型對照抗體分別染色n色分析就要制備n個補償對照管舉例(jǔlì)：雙染實驗第三十八頁，共61頁。設門與數(shù)據(jù)分析門(Gate，簡寫G)是流式細胞術中的一個重要術語(shùyǔ)，F(xiàn)CM數(shù)據(jù)分析過程實際上就是選門和設門的過程。第三十九頁，共61頁。流式結果(jiēguǒ)十字(shízì)門線性門第四十頁，共61頁。黏附因子表面受體細胞因子分泌到胞外的細胞因子胞內抗原核酸含量核內抗原細胞功能細胞表面、胞漿、核的特異性抗原(kàngyuán)細胞活性細胞內細胞因子酶活性細胞受體細胞內鈣離子流式細胞儀檢測(jiǎncè)范圍第四十一頁，共61頁。HIV免疫分型，CD4絕對計數(shù)白血病和淋巴瘤的免疫分型腫瘤的細胞周期和倍體分析網織紅細胞計數(shù)細胞移植的交叉(jiāochā)配型和免疫狀態(tài)監(jiān)測干細胞計數(shù)殘量白血病細胞檢查HLA-B27檢查血小板功能及相關疾病醫(yī)學(yīxué)應用第四十二頁，共61頁。科研(kēyán)應用在免疫學研究中的應用:鑒定免疫細胞類型抗原特異性T細胞研究細胞因子分泌細胞研究全血細胞研究凋亡檢測細胞增殖(zēngzhí)檢測干細胞向免疫細胞分化的研究轉染熒光蛋白細胞系研究稀有細胞檢測。。。在神經生物學研究中的應用：神經干細胞和神經祖細胞的特性研究；不同類型的神經細胞的鑒定和功能研究；星形膠質細胞和膠質細胞的鑒定和功能研究；檢測細胞活性，細胞凋亡(diāowánɡ)和細胞周期；神經細胞發(fā)育過程研究干細胞向神經細胞分化研究。。。第四十三頁，共61頁。在腫瘤研究中的應用：細胞凋亡的檢測；細胞周期分析；細胞增殖研究；熒光蛋白(dànbái)分析；腫瘤干細胞的鑒定和功能分析；循環(huán)腫瘤細胞的鑒定和功能分析；實體瘤細胞的檢測分析（腫瘤組織解離成單細胞后）；腫瘤細胞系表型分析；細胞活性的檢測；。。。在細胞生物學和分子生物學研究中的應用：檢測細胞轉染效率；檢測轉導效率；分析細胞中熒光蛋白(dànbái)的表達；分析蛋白(dànbái)—蛋白(dànbái)之間的相互作用（FRET）分析細胞活性，細胞凋亡，和細胞周期；研究細胞的分化過程；研究細胞增殖；。。。第四十四頁，共61頁。在高通量檢測(jiǎncè)和新藥研發(fā)中的應用：細胞功能變化的研究；細胞周期和活性；細胞凋亡；細胞增殖；新藥研發(fā)；培養(yǎng)基研發(fā)；。。。海洋生物學富集和分析細菌，藻類，浮游植物等微生物學細菌和酵母檢測；熒光(yíngguāng)蛋白檢測。

生物燃料Bodipy?和/或NileRed中脂類的定量藻類，藍藻細菌，酵母和細菌等生物的富集第四十五頁，共61頁。4.1細胞周期檢測(jiǎncè)處于不同細胞周期的細胞DNA含量不同，G0/G1期細胞含有二倍體量的DNA，G2/M期細胞含有四倍體量的DNA，而S期細胞DNA含量處于二倍體和四倍體量之間。DNA熒光染料能與DNA結合，DNA含量的多少與熒光染料的結合量成正比，熒光強度反應了DNA吸收熒光分子的多少。通過(tōngguò)流式檢測就能反映細胞內DNA的含量，區(qū)分細胞周期的G0/G1期、S期和G2/M期細胞比例。四、常見(chánɡjiàn)流式細胞術應用第四十六頁，共61頁。細胞周期分析核酸染料細胞膜非通透性染料：PI(碘化丙啶)、EB(溴化乙啶)，不能進入完整細胞膜，標記時需要通過(tōngguò)固定等方法增加細胞膜的通透性。細胞膜通透性染料：Hoechst、DPAI等能染活細胞的DNA，但需紫外激光激發(fā)。PI標記法檢測細胞周期需要乙醇固定增加細胞膜的通透性；需要加RNase，去除RNA對DNA的干擾。第四十七頁，共61頁。PI法檢測細胞周期一般步驟：收集單細胞懸液(1×106個)，緩慢加入(jiārù)1ml預冷的70％乙醇，于4℃固定過夜，或-20℃長期固定。離心收集細胞，再以1mlPBS徹底洗去乙醇；去上清后加入(jiārù)染色液(包含50ug/mlPI，100ug/mlRNaseA，0.2%TritonX-100)，37℃染色30min后上機檢測。第四十八頁，共61頁。細胞周期檢測(jiǎncè)結果通過流式檢測(jiǎncè)，能得出G0/G1期、S期和G2/M期細胞比例。增殖指數(shù)(proliferousindex,PI)：指處于S期和G2/M期細胞之和占總細胞的比例，反映了細胞的增殖能力。CV值(變異系數(shù))：衡量儀器測量分辨率和精度的指標。脾臟(pízàng)細胞培養(yǎng)腫瘤細胞第四十九頁，共61頁。DNA倍體檢測(jiǎncè)病變腫瘤(zhǒngliú)細胞常出現(xiàn)結構和染色體異常，流式檢測DNA含量能反映異倍體情況。DNA指數(shù)(DNAindex,DI)：(樣本的G0/G1期峰平均熒光道數(shù))/(正常二倍體細胞G0/G1期峰平均熒光道數(shù))。倍體(ploidy)：染色體數(shù)目。二倍體DI=1；四倍體DI=2；二倍體四倍體之外統(tǒng)稱異倍體。二倍體四倍體異倍體第五十頁，共61頁。小鼠精子(jīngzǐ)單倍體細胞第五十一頁，共61頁。亞二倍體(Sub-G1)峰的檢測(jiǎncè)凋亡細胞核小體崩解，DNA含量減少，加之(jiāzhī)由于DNA的降解，與熒光染料的結合減少，因此DNA染料的著色能力下降，熒光強度降低，表現(xiàn)在G1峰前出現(xiàn)亞二倍體峰，即亞G1峰(凋亡峰)。細胞(xìbāo)凋亡峰Sub-G1四倍體峰二倍體峰PINumber第五十二頁，共61頁。4.2AnnexinV/PI雙染法檢測(jiǎncè)細胞凋亡正常(zhèngcháng)細胞膜是不對稱性的，胞漿面含有帶負電的磷脂(如磷脂酰絲氨酸,PS)。早期凋亡時，細胞表面不對稱性發(fā)生改變，PS外翻到胞外側AnnexinV是一種Ca2+依賴性的對PS有高度親和力的磷脂結合蛋白，可作為探針識別膜表面是否有PS，從而識別凋亡細胞。第五十三頁，共61頁。PI常用于鑒別死細胞。凋亡細胞的細胞膜仍然是完整的，所以PI不能進入(jìnrù)早期凋亡細胞核內。AnnexinV-FITCPI活細胞(xìbāo)早期(zǎoqī)凋亡晚期凋亡壞死細胞裸核第五十四頁，共61頁。免疫熒光圖第五十五頁，共61頁。ALA光敏劑(1mM/M)HL60氦氖激光(jīguāng)(18mj/cm2)C1h2h3h4h5h第五十六頁，共61頁。4.3淋巴細胞亞群分析(fēnxī)GranulocytesMonoc