PCR技術(shù)的原理、操作及應(yīng)用湖南省疾病預防控制中心微生物檢驗科什么是PCRPCR:Polymerasechainreaction，即聚合酶鏈反應(yīng)是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術(shù)

PCR技術(shù)的發(fā)展歷史關(guān)于PCR的文章首次由美國科學家KaryMullis等人在《Science》雜志上發(fā)表《Science》雜志報道了耐熱性DNA多聚酶Taq酶（生活在溫泉中的水生嗜熱桿菌內(nèi)提取到的一種耐熱的DNA聚合酶）的發(fā)現(xiàn),預示著分子時代的到來。12月《Science》雜志將PCR和它所使用的聚合酶命名為第一個“年度分子”。1993KaryMullis因PCR的發(fā)明獲得諾貝爾化學獎。PCR技術(shù)的原理2PCR反應(yīng)的基本成分包括7種基本成分：模板DNA、特異性引物、熱穩(wěn)定DNA聚合酶、脫氧核苷三磷酸（dNTP）、二價陽離子、緩沖液及一價陽離子基本反應(yīng)步驟：變性--退火--延伸最后通過染料如EB染色DNA后在紫外燈下顯色檢出PCR技術(shù)的原理31234522557294時間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復1~3步25~35輪目的DNA片段擴增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍RT-PCR的原理相對于PCR，在開始階段增加步驟：RNAcDNA合成，是單鏈到雙鏈的過程。實時熒光定量PCR的原理2基線（Baseline）是指在PCR擴增反應(yīng)的最初數(shù)個循環(huán)里，熒光信號變化不大，接近一條直線，這樣的直線即基線。光閾值threshold的設(shè)定一般將PCR反應(yīng)前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，熒光域值是PCR3-15個循環(huán)熒光信號標準差的10倍，熒光域值設(shè)定在PCR擴增的指數(shù)期。CT(Cyclethreshold)值表示每個PCR反應(yīng)管內(nèi)熒光信號到達設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。研究表明，各模板的CT值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，CT值越小，反之亦然。利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標代表CT值。因此，只要獲得未知樣品的CT值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。實時熒光定量PCR的原理3Ct與初始模板的關(guān)系固定循環(huán)數(shù)后，熒光信號與模板數(shù)成正比初始DNA量越多,熒光達到閾值時所需要的循環(huán)數(shù)(Ct值)越少起始模板的對數(shù)濃度與Ct呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品的Ct值就可計算出樣品中所含的模板量閾值104103102PCR技術(shù)的優(yōu)點優(yōu)點:

特異敏感快速、簡便易自動化等PCR技術(shù)的注意事項防止污染，建立良好的質(zhì)量控制。操作時避免氣溶膠產(chǎn)生，特別注意陽性樣品的拿放，使用一次性耗材，穿戴手套并經(jīng)常更換，永遠在最后一步才加核酸，液體分裝使用等。引物設(shè)計合理Taq酶擴增錯誤率較高，大約1/100對堿基/20個循環(huán)鎂離子濃度對反應(yīng)效率的影響儀器穩(wěn)定性，升降溫速率，管子的密合度等RT-PCR注意防止RNA降解PCR技術(shù)的操作1以流感病毒的RT-PCR和Real-timeRT-PCR檢測為例說明PCR技術(shù)的操作步驟主要儀器：PCR儀，Real-timePCR儀，微量移液器，高速冷凍離心機，電泳儀和電泳槽，凝膠電泳觀察儀或成像系統(tǒng)，生物安全柜等。PCR技術(shù)的操作21.病毒核酸RNA提取2.RT-PCR反應(yīng)或者Real-timeRT-PCR反應(yīng)3.UV紫外燈檢測或者電腦上直接讀取結(jié)果流感病毒核酸提取21、取采樣液（鼻拭子、咽拭子、胸水等）或病毒培養(yǎng)物（雞胚尿囊液或細胞培養(yǎng)液）200ul加在1.5mlEppendorf管中2、依次加入350ulRLT液、3.5ulβ-巰基乙醇和70%的乙醇550ul混勻3、將Rneasyminispin柱子置于干凈的2ml收集管上，將2步驟的混合液600ul吸出加入柱子中，12，000rpm，離心15秒，棄收集管中的離心液4、柱子仍放回收集管上，將2步驟剩余的混合液全部吸到柱子上，12，000rpm，離心15秒，棄離心液5、于柱子中加入700ulWashBufferRW1液，12，000rpm，離心15秒6、取一支干凈的2ml收集管，將離心后的柱子移到新的收集管上，于柱子中加入500ulWashBufferRPE液，12，000rpm，離心15秒

7、棄收集管中的離心液，再于柱子中加入500ulWashBufferRPE液，13，000-14，000rpm，離心2分鐘

8、將柱子移到一干凈的1.5ml的eppendrof管上，于柱子中加入20-50ul的Rnase-freeWater，室溫靜置1-3分鐘

9、12，000rpm，離心1分鐘，收集離心液即為提取的病毒RNA，立即做實驗或-20℃以下保存試劑盒為QIAGEN公司的RNeasyMiniKit（catalog#74104）注意：試劑盒中的RPE液用前需加44ml的無水乙醇，使終體積達到55ml。RT-PCR反應(yīng)1試驗材料QIAGENOneStepRT-PCRKit（CatNo210212）RNaseinhibitor40u/μl上游引物200ng/μl下游引物200ng/μl擴增H5亞型禽流感病毒的引物序列為：H5-1:5’-GCCATTCCACAACATACACCC-3’，H5-3:5’-CTCCCCTGCTCATTGCTATG-3’提取的RNART-PCR反應(yīng)21、分別標記好0.2ml的微量離心管。在每個管中加入如下內(nèi)容：

5ulQIAGENOneStepRT-PCRbuffer，5×1ul10mMdNTPs1ulEnzymeMix0.13ulRNaseinhibitor(40U/ul)14.3ulRnase-freewater

2、加1ul的引物加5ul未知RNA或5ul陽性對照或Rnase-freewater作為陰性對照。RT-PCR擴增產(chǎn)物檢測1凝膠電泳緩沖液配方10×TBE緩沖液(每升)：Tris107.8gBoricAcid55.0gEDTA(Na2)8.2g10×TAE緩沖液(每升)：Tris48.4g冰乙酸11.42g0.5mol/LEDTA20ml用電泳緩沖液制備1.5%瓊脂糖凝膠，按每孔8ulPCR產(chǎn)物上樣至膠中。100伏電泳30min，紫外觀察并拍照記錄。RT-PCR擴增產(chǎn)物檢測2RT-PCR擴增產(chǎn)物檢測及結(jié)果判定Real-timeRT-PCR的操作1病毒核酸RNA提?。和琑T-PCR

Real-timeRT-PCR：以匹基公司禽流感檢測試劑盒為例，按試劑盒操作說明，25μl反應(yīng)體系：RT-PCR反應(yīng)液15μl，Taq酶0.25μl，逆轉(zhuǎn)錄酶n/4顆（n為PCR管數(shù)），待檢RNA10μl，加好RNA后400g離心5sec，將PCR管排好放入熒光PCR檢測儀內(nèi)，記錄樣本擺放順序。反應(yīng)條件為：42℃30min；92℃3min；92℃10sec,45℃30sec72℃1min5個循環(huán)；92℃10sec,60℃30sec40個循環(huán)，60℃時設(shè)置收集熒光。Real-timePCR的操作3結(jié)果判定1、質(zhì)控標準1.1陰性對照的檢測結(jié)果為陰性。1.2陽性對照的Ct值應(yīng)小于等于28.0。否則，此次實驗視為無效。2、結(jié)果判斷2.1Ct值無數(shù)值的樣本為陰性樣本。2.2Ct值≤30.0的樣本為陽性。2.3Ct值大于30.0的樣本建議重做。重做結(jié)果無數(shù)值者為陰性，否則為陽性。PCR技術(shù)的應(yīng)用基因克隆、測序和表達等法醫(yī)學個體識別和親子鑒定遺傳性疾病檢測、腫瘤診斷、病原體檢測等DNA指紋技術(shù)2采集血樣（毛發(fā)、精液、口腔粘膜細胞），分離DNA，用PCR將選定的DNA片段放大，并進行對比，統(tǒng)計分析，便可得出是否為作案兇手或是否有血緣關(guān)系。分子診斷學分子診斷學是以分子生物學理論為基礎(chǔ)，利用分子生物學的技術(shù)和方法研究人體內(nèi)源性或外源性生物大分子和大分子體系的存在、結(jié)構(gòu)或表達調(diào)控的變化，為疾病的預防、預測、診斷、治療和轉(zhuǎn)歸提供信息和決策依據(jù)。分子診斷學的發(fā)展階段分子診斷學大致經(jīng)歷了3個階段：（1）利用DNA分子雜交技術(shù)進行遺傳病的基因診斷；（2）以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的DNA診斷，特別是定量PCR和實時PCR的應(yīng)用，不僅可以檢測存在于宿主的多種DNA和RNA病原體載量，還可檢測多基因遺傳病細胞中mRNA的表達量（3）以生物芯片（biochip）技術(shù)為代表的高通量密集型檢測技術(shù)，生物芯片技術(shù)包括基因芯片，蛋白質(zhì)芯片，組織芯片等。分子診斷學的發(fā)展方向分子診斷學的發(fā)展方向：（1）分子診斷的內(nèi)容從傳統(tǒng)的DNA診斷發(fā)展到核酸及其表達產(chǎn)物（mRNA、蛋白質(zhì)）的全面診斷；（2）分子診斷的策略從利用分子雜交、PCR等單一技術(shù)的診斷發(fā)展到有機組合多項技術(shù)的聯(lián)合診斷；（3）分子診斷