實驗四血清蛋白的醋酸纖維薄膜電泳4/20/20231第1頁，共39頁，2023年，2月20日，星期六【實驗目的】掌握電泳法分離血清蛋白質的原理掌握血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳的操作方法及臨床意義4/20/20232第2頁，共39頁，2023年，2月20日，星期六電泳：帶電粒子在電場的作用下，向著與其電性相反的電極移動的現(xiàn)象電泳技術：利用電泳現(xiàn)象對混合物進行分離分析的技術【實驗原理】4/20/20233第3頁，共39頁，2023年，2月20日，星期六H＋OH－H＋OH－pH>pIpH=pIpH<pI4/20/20234第4頁，共39頁，2023年，2月20日，星期六電泳速度:帶電粒子在電場中運動時，單位電場強度內粒子運動的速度，以u表示，即

V—粒子運動的速度X—電場強度Q—粒子所帶電荷r—粒子的半徑η—介質的粘度4/20/20235第5頁，共39頁，2023年，2月20日，星期六影響電泳速度的因素1.樣品本身：分子形狀：形狀越小，與支持物介質摩擦越小，u越大。球形分子>纖維狀分子Q越多，u越大；分子小，r越小，u越大；4/20/20236第6頁，共39頁，2023年，2月20日，星期六2.緩沖溶液：pH值：(pH-pI)越大，Q越多，u越大離子強度(I)：I越大，電動電勢越小，u越?。籌越小，電動電勢越大，u越大，但樣品易擴散。離子強度如果過低，緩沖液的緩沖容量小，不易維持pH恒定選擇離子強度時要兩者兼顧，一般離子強度的選擇范圍在0.02～0.2之間。4/20/20237第7頁，共39頁，2023年，2月20日，星期六電場強度：電泳支持物上每厘米的電位降，也稱電勢梯度。3.電場強度(X)X越大，u越快。支持物越短，X越大，u越快。電場強度越大或支持物越短，電流將隨之增加，產熱也增加，影響分離效果。在進行高壓電泳的時候必須用冷卻裝置，否則可引起蛋白質等樣品發(fā)生熱變性而無法分離4/20/20238第8頁，共39頁，2023年，2月20日，星期六4.支持介質：①纖維薄膜(玻璃纖維薄膜，醋酸纖維薄膜)②凝膠(瓊脂糖凝膠，聚丙烯酰胺凝膠)4/20/20239第9頁，共39頁，2023年，2月20日，星期六負極正極－－－－－－－－表面帶負電荷帶正電荷的水層攜帶粒子向負極移動

如果樣品原本是移向負極的，則泳動的速度加快；如果樣品原本是移向正極的，則泳動的速度減慢。電滲作用：電滲：在電場作用下液體對固體支持物相對移動的現(xiàn)象。＋＋＋＋＋＋＋＋以紙電泳為例:4/20/202310第10頁，共39頁，2023年，2月20日，星期六區(qū)帶電泳的分類（一）支持物物理性狀1．濾紙及其它纖維(如玻璃纖維、醋酸纖維、聚氯乙烯纖維薄膜)電泳2．粉末電泳：如纖維素粉、淀粉電泳；3．凝膠電泳：如瓊脂、瓊脂糖、聚丙烯酰胺凝膠電泳；4．絲線電泳：尼龍絲、人造絲電泳。4/20/202311第11頁，共39頁，2023年，2月20日，星期六（二）支持物裝置形式：1．平板式電泳：支持物水平放置；2．垂直板式電泳：聚丙烯酰胺凝膠可做成垂直板式電泳；3．垂直柱式電泳：聚丙烯酰胺盤狀電泳4/20/202312第12頁，共39頁，2023年，2月20日，星期六(三)pH連續(xù)性：1．連續(xù)pH電泳：即整個電泳過程pH保持不變，如常用的紙電泳、醋酸纖維薄膜電泳等。2．非連續(xù)pH電泳：緩沖液和電泳支持物間有不同的pH的電泳，如聚丙烯酰胺凝膠盤狀電脈，等電聚焦電泳等4/20/202313第13頁，共39頁，2023年，2月20日，星期六醋酸纖維薄膜為支持物pH=8.6的巴比妥緩沖液血清蛋白的pI均小于8.6負電荷電泳時向正極移動由于遷移率不同而被分離4/20/202314第14頁，共39頁，2023年，2月20日，星期六γβα2α1清蛋白分子越小，泳動速度越快帶電量越多，泳動速度越快4/20/202315第15頁，共39頁，2023年，2月20日，星期六膜條經過氨基黑10B染色后顯出清晰色帶。2.定性,定量各色帶蛋白質含量與染料結合量基本成正比?？蓪⒏魃珟Ъ糸_，分別溶于堿性溶液中。用分光光度法計算各種蛋白質的百分數(shù)。4/20/202316第16頁，共39頁，2023年，2月20日，星期六醋酸纖維薄膜：醋酸纖維加工的細密且薄的微孔膜廣泛應用醫(yī)學臨床各種生物分子的分離分析血清蛋白、血紅蛋白、球蛋白脂蛋白、糖蛋白甲胎蛋白、類固醇及同工酶等4/20/202317第17頁，共39頁，2023年，2月20日，星期六優(yōu)點：簡單快速缺點分辨率較低（聚丙烯酰胺凝膠電泳，PAGE）不適于制備（薄膜厚度約10～100μm，樣品用量很少）4/20/202318第18頁，共39頁，2023年，2月20日，星期六【器材及試劑】1、器材：醋酸纖維薄膜（2×8cm）常壓電泳儀竹鑷點樣器人血清或雞血清粗濾紙2、試劑：巴比妥緩沖液氨基黑10B0.25染色液漂洗液透明液4/20/202319第19頁，共39頁，2023年，2月20日，星期六[操作]（一）儀器與薄膜的準備1、醋酸纖維素薄膜的潤濕與選擇2.電泳槽的準備3、電極槽的平衡4/20/202320第20頁，共39頁，2023年，2月20日，星期六（二）點樣取出薄膜，無光澤面向上平放在濾紙上點樣區(qū)距陰極端1.5cm血清均勻涂在點樣器表面將點樣器輕輕印在點樣區(qū)內，使血清完全滲透至薄膜內形成一定寬度、粗細均勻的直線

實驗的關鍵，是獲得具有清晰區(qū)帶的電泳圖譜的重要環(huán)節(jié)4/20/202321第21頁，共39頁，2023年，2月20日，星期六（三）電泳點樣端薄膜平貼陰極電泳槽支架濾紙橋(點樣面朝下)

另一端平貼在陽極端支架

要求：薄膜緊貼濾紙橋并繃直，薄膜之間相隔幾毫米蓋電泳槽蓋，平衡10min打開電源開關，調節(jié)電流強度為0.3mA/片，通電10min調節(jié)電流強度為0.5mA/片，電泳60~90min

電泳后調節(jié)旋鈕電流為O，關閉電泳儀切斷電源4/20/202322第22頁，共39頁，2023年，2月20日，星期六DYY-5型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀DYY-Ⅲ型電泳槽4/20/202323第23頁，共39頁，2023年，2月20日，星期六4/20/202324第24頁，共39頁，2023年，2月20日，星期六4/20/202325第25頁，共39頁，2023年，2月20日，星期六【實驗注意事項】不要用手觸摸纖維素膜注意區(qū)分醋酸纖維素薄膜的光面和毛面點樣位置要在1.5厘米以內，不要距邊緣太近不要重復點樣膜放進電泳槽時，將點樣面向下，點樣端靠近陰極4/20/202326第26頁，共39頁，2023年，2月20日，星期六用點樣器點樣時不要點的太多，但也不能太少線條均勻，用力水平。電泳槽放膜條支架上盡量不要有緩沖液4/20/202327第27頁，共39頁，2023年，2月20日，星期六（四）染色和漂洗取出薄膜，直接浸入染色液中，染色5min自來水沖洗，漂洗液漂洗更換3次漂洗液，脫去顏色，得到色帶清晰的電泳圖譜4/20/202328第28頁，共39頁，2023年，2月20日，星期六【實驗結果】繪出電泳圖譜并標明各條帶含義4/20/202329第29頁，共39頁，2023年，2月20日，星期六4/20/202330第30頁，共39頁，2023年，2月20日，星期六臨床意義血漿蛋白是血漿最主要的固體成分，含量60～80g/L絕大部分由肝臟合成，僅γ球蛋白由漿細胞合成

正常值： 白蛋白57％~72％，α1球蛋白2％~5％α2球蛋白4％~9％，β球蛋白6.5％~12％γ球蛋白12％—20％4/20/202331第31頁，共39頁，2023年，2月20日，星期六可能相關疾病清蛋白α1球蛋白α2球蛋白β球蛋白γ球蛋白骨髓瘤↑*腎病綜合癥↓↑*↑*腎炎↑*↑肝硬化↓↑*急性肝壞死↓*↑↑↑↑傳染性肝炎↓↑*↑*急性感染初期↑*↑*↑*慢性炎癥/感染后期↑*低球蛋白血癥↓*臨床上還可用A/G比來表示清球蛋白的量的關系：正常人A/G＝1.5～2.54/20/202332第32頁，共39頁，2023年，2月20日，星期六血漿蛋白的主要功能維持血漿膠體滲透壓調節(jié)血漿pH值，維持酸堿平衡運輸營養(yǎng)物質、代謝物、激素、藥物及金屬離子等免疫作用4/20/202333第33頁，共39頁，2023年，2月20日，星期六白蛋白降低：

合成能力不足：肝功能下降

合成原料不足：饑餓，腹瀉，腫瘤晚期

去路增加：腎病綜合癥，嚴重燒傷，大出血等

消耗過多：糖尿病，甲亢等4/20/202334第34頁，共39頁，2023年，2月20日，星期六球蛋白增加：感染，多發(fā)性骨髓瘤，自身免疫性疾病等球蛋白降低：皮質功能亢進，免疫缺陷病4/20/202335第35頁，共39頁，2023年，2月20日，星期六肝?。篈,α2-G,β-G,α1-G,γ-G，A/G下降甚至倒置腎?。涸缙冢哼x擇性蛋白尿，Mw較小蛋白質丟失，含量下降。如白蛋白后期：非選擇性蛋白尿，Mw較小的蛋白質丟失，含量下降分子量較大的蛋白質（如γ-球蛋白）丟失，含量下降4/20/202336第36頁，共39頁，2023年，2月20日，星期六【實驗思考】1．電泳時，點樣端置于電場的正極還是負極？為什么？2．電泳后，泳動在最前面的是何種蛋白質？各譜帶為何種成分？請分析原因4/20/202337第37頁，共39頁，2023年，2月20日，星期六【常見問題及原因】1.電泳圖譜不齊：點樣時血清滴加不均2.電泳圖譜出現(xiàn)條痕：點樣后薄膜過干，或電泳槽密閉性不