常見肝病病理形態(tài)特點及免疫組化染色幾點體會

復(fù)旦大學(xué)病理學(xué)系張錦生肝病的病理形態(tài)特點和免疫組化染色體會專家講座第1頁肝穿刺標(biāo)本檢驗和處理標(biāo)準(zhǔn)1.肉眼觀察肝穿刺標(biāo)本呈完整園柱狀，長度1－3cm經(jīng)典慢性肝炎肝纖維化標(biāo)本呈竹節(jié)狀外觀肝硬化穿刺標(biāo)本，呈不規(guī)則碎塊肝病的病理形態(tài)特點和免疫組化染色體會專家講座第2頁2.石蠟切片每張玻片上應(yīng)放置超出6個連續(xù)組織切片，有利于肝纖維化病理診療。肝病的病理形態(tài)特點和免疫組化染色體會專家講座第3頁3.染色除常規(guī)ＨＥ染色供病理診療用之外，依據(jù)條件和需要作以下特殊染色：

①網(wǎng)狀纖維染色，

②Masson三色染色，

③膠原纖維染色(Siriusred或免疫組化)

肝病的病理形態(tài)特點和免疫組化染色體會專家講座第4頁④Dm-HSC⑤α-SMA-MFb

Dmα-SMA肝病的病理形態(tài)特點和免疫組化染色體會專家講座第5頁S1S2S3S4各種病因引發(fā)肝纖維病理學(xué)特點及分期1.慢性肝炎肝纖維化(Dr.Scheuer方案）肝病的病理形態(tài)特點和免疫組化染色體會專家講座第6頁活動性纖維間隔靜止性纖維間隔肝病的病理形態(tài)特點和免疫組化染色體會專家講座第7頁脂肪性肝病肝纖維化穿刺肝組織呈淡黃色，標(biāo)本懸浮于固定液

小葉中央?yún)^(qū)纖維化竇周纖維化肝病的病理形態(tài)特點和免疫組化染色體會專家講座第8頁3.肝糖原累積病肝纖維

肝病的病理形態(tài)特點和免疫組化染色體會專家講座第9頁4.Wilson病紅氨酸(Rubeanicacid)染色,銅被染成深綠色肝病的病理形態(tài)特點和免疫組化染色體會專家講座第10頁5.血色病

穿刺肝組織因含有大量含鐵血黃素從容呈火焰紅色肝細(xì)胞普魯氏藍(lán)染色陽性肝病的病理形態(tài)特點和免疫組化染色體會專家講座第11頁6.本身免疫性肝炎肝纖維化（AIH）

門管區(qū)肝細(xì)胞呈花環(huán)狀排列HepaticRosette，表現(xiàn)為數(shù)個水樣變性肝細(xì)胞被炎癥細(xì)胞和塌陷網(wǎng)狀支架包繞成花環(huán)狀結(jié)構(gòu)。肝病的病理形態(tài)特點和免疫組化染色體會專家講座第12頁7.原發(fā)性膽汁性肝硬化（PBC）

3期（間隔期）90%出現(xiàn)本身抗體(A-Mit)，F(xiàn)loridductlesion+BiliaryPN，

纖維間隔形成，肝細(xì)胞羽毛狀變性4期（肝硬化）靜止-纖維間隔內(nèi)無炎癥或輕度炎癥活動–FibrousPN.肝病的病理形態(tài)特點和免疫組化染色體會專家講座第13頁8.血吸蟲性肝纖維化

肝病的病理形態(tài)特點和免疫組化染色體會專家講座第14頁肝癌(LIVERCANCER)HCCICCCombinedhepatocellularandcholangiocarcinoma肝病的病理形態(tài)特點和免疫組化染色體會專家講座第15頁肝癌病理診療慣用免疫組化和特染HepPar1線粒體相關(guān)抗原，與AFP無關(guān)對胎兒和成人肝細(xì)胞高度特異(HCC:陽性率82-97%）

肝病的病理形態(tài)特點和免疫組化染色體會專家講座第16頁AFPHCC陽性率：15-82%肝病的病理形態(tài)特點和免疫組化染色體會專家講座第17頁CD34:HCC型染色長條分枝，管壁纖細(xì)，管腔狹窄，分布均勻彌漫.而非癌肝組織內(nèi)極少見.肝病的病理形態(tài)特點和免疫組化染色體會專家講座第18頁CK18:HCC,ICC,Metastaticcarcinoma:100%+上皮性腫瘤標(biāo)志物肝病的病理形態(tài)特點和免疫組化染色體會專家講座第19頁CK19:膽管型CK:CK19,CK7肝細(xì)胞－膽管上皮，ICC：77-100%ICC最好標(biāo)志物肝病的病理形態(tài)特點和免疫組化染色體會專家講座第20頁CEA：monoclonalCEA:毛細(xì)膽管－ICC，轉(zhuǎn)移性肝癌：60-75%+HCC:0-11%+polyclonalCEA:毛細(xì)膽管＋HCC特異標(biāo)志物之一

肝病的病理形態(tài)特點和免疫組化染色體會專家講座第21頁CK20:胃腸道腺癌主要標(biāo)志物轉(zhuǎn)移性腺癌：74-100%+ICC:10%+HCC:0%+肝病的病理形態(tài)特點和免疫組化染色體會專家講座第22頁MOC31:抗人上皮相關(guān)抗原

轉(zhuǎn)移性腺癌：100%+ICC:92.9%+HCC:0%+胃癌肝轉(zhuǎn)移肝病的病理形態(tài)特點和免疫組化染色體會專家講座第23頁HBsAg:HCC:70-80%+胞質(zhì)型，胞核型陽性胞質(zhì)型，核周型陽性肝病的病理形態(tài)特點和免疫組化染色體會專家講座第24頁黏液染色：AB/PAS

酸性黏多糖：蘭色（膽管腺瘤,ICC腔內(nèi)黏液）中性黏多糖,糖原：紅色（假腺管型HCC)

肝病的病理形態(tài)特點和免疫組化染色體會專家講座第25頁免疫組織化學(xué)染色幾點體會一、組織和細(xì)胞標(biāo)本制備目標(biāo)：(1)最大程度地保留組織結(jié)構(gòu)。(2)最大程度地保留抗原性。注意事項：在選擇組織處理方法前，先依據(jù)試驗?zāi)繕?biāo)，參考抗體說明，確定組織處理方式(冰凍?石蠟?)。肝病的病理形態(tài)特點和免疫組化染色體會專家講座第26頁1.取材（1）標(biāo)準(zhǔn)：盡可能新鮮，動物標(biāo)本可選用動脈灌注固定。（2）取材部位：盡可能包含病灶和正常組織交界處，防止選擇壞死組織。（3）防止擠壓：受擠壓組織不但影響HE切片觀察，還造成非特異性免疫組化組織著色。肝病的病理形態(tài)特點和免疫組化染色體會專家講座第27頁2.固定依據(jù)不一樣染色目標(biāo)，選擇不一樣固定液，固定時組織越新鮮越好。組織塊厚薄大小要適當(dāng)。容器要大,固定液要寬余.固定時間既要考慮充分固定,又不能太長(依組織塊厚薄大小從24hr至3～5天,太長可溶性抗原會滲漏,陽性會減弱甚至轉(zhuǎn)陰.選擇最適當(dāng)固定劑,如用福爾馬林,必須用緩沖福爾馬林肝病的病理形態(tài)特點和免疫組化染色體會專家講座第28頁3.制備蠟塊沖水、脫水、透明、包埋。盡可能采取低溫石蠟包埋,如無低溫石蠟,可將組織塊盡可能修薄,以縮短脫水、透明、包埋時間,盡可能保留組織內(nèi)抗原穩(wěn)定。肝病的病理形態(tài)特點和免疫組化染色體會專家講座第29頁4.制備冰凍切片冷凍包埋能很好保留抗原,新鮮及已固定材料均適合于冷凍包埋、切片?！镱A(yù)防冰結(jié)晶!!!預(yù)處理:目標(biāo)是降低組織中水分以降低冰結(jié)晶產(chǎn)生,方法是將已固定、沖洗組織塊放入20～30%蔗糖緩沖液內(nèi),4℃冰箱過夜,再將組織塊埋于OCT包埋劑速凍:目標(biāo)是使溫度很快下降快速經(jīng)過冰點,預(yù)防冰結(jié)晶產(chǎn)生。肝病的病理形態(tài)特點和免疫組化染色體會專家講座第30頁速凍方法液氮法:將OCT包埋組織塊投入液氮數(shù)秒,等組織塊凍結(jié)后,馬上移入低溫冰箱(裝入封口塑料袋內(nèi)密封)或放入恒冷切片機恒冷箱內(nèi)以備切片;干冰-丙酮法:將200ml丙酮注入小型廣口保溫瓶或保溫杯內(nèi),逐步加入干冰至飽和不再冒泡為止,溫度可達(dá)-70℃;將裝有50ml異戊烷小燒杯遲緩置入干冰-丙酮飽和液中;然后將OCT包埋組織塊投入異戊烷內(nèi)速凍半分至一分鐘。肝病的病理形態(tài)特點和免疫組化染色體會專家講座第31頁免疫組化染色后襯染慣用蘇木精或甲基綠襯染細(xì)胞核。但假如陽性信號在細(xì)胞核,切勿襯染細(xì)胞核!!!細(xì)胞質(zhì)襯染:1%亮綠,但退色較快,可改用堅固綠(FASTBLUE)染,則保留時間較長肝病的病理形態(tài)特點和免疫組化染色體會專家講座第32頁封固和保留絕大多數(shù)免疫酶染色后都可用樹膠封固，但如用DAB以外底物應(yīng)注意有色沉淀物如為脂溶性，應(yīng)改用水溶性封固物如明膠、甘油緩沖液等。酶免疫染色切片可保留數(shù)周甚至數(shù)月。免疫熒光染色后應(yīng)盡快觀察、拍照。肝病的病理形態(tài)特點和免疫組化染色體會專家講座第33頁一.慣用免疫組織化學(xué)方法免疫熒光:

用于培養(yǎng)細(xì)胞效果很好,石蠟切片因常有自發(fā)熒光,背景熒光較強,用時要注意

FITC(異硫氰酸熒光素)用450～490nm光激發(fā),515nm濾片觀察,呈翠綠色

RB200(四乙基羅達(dá)明B200)用570nm光激發(fā),596～600nm濾片觀察,呈橘紅色

TRITC(四甲基異硫氰酸羅達(dá)明)用530～560nm光激發(fā),580nm濾片觀察,呈紅色

Texasred用595nm光激發(fā),615nm濾片觀察,呈紅色直接免疫熒光法:間接免疫熒光法雙重?zé)晒馊旧尾〉牟±硇螒B(tài)特點和免疫組化染色體會專家講座第34頁2.免疫組織化學(xué)慣用方法:PAPABC或LSABELPS(二步法)肝病的病理形態(tài)特點和免疫組化染色體會專家講座第35頁20世紀(jì)70年（1970）SternbergPeroxidase-anti-Peroxidase(PAP)肝病的病理形態(tài)特點和免疫組化染色體會專家講座第36頁20世紀(jì)80年代（1981）許世民ABC（親和免疫組化）Avidin-Biotin-PeroxidaseComplex肝病的病理形態(tài)特點和免疫組化染色體會專家講座第37頁90年代中期：EnhancedPolymerOneStep(EPOS)EnVision(EnhancedLabelledPolymerSystem,ELPS)簡稱二步法1mol含70molHRP+10molAB肝病的病理形態(tài)特點和免疫組化染色體會專家講座第38頁怎樣做好免疫組化染色?什么才是高質(zhì)量免疫組化染色?陽性信號突出無背景染色切片平整無破裂/碎,無污穢肝病的病理形態(tài)特點和免疫組化染色體會專家講座第39頁做好免疫組化染色幾點體會1.組織細(xì)胞處理:

固定劑固定時間速凍防冰結(jié)晶白片質(zhì)量好:平整,無破裂/碎,無污穢防脫片:玻片絕對潔凈涂粘合劑:

白膠多聚賴氨酸鉻明礬明膠液甲醛明膠液

貼片后冷風(fēng)吹干或37℃/60℃烘干

肝病的病理形態(tài)特點和免疫組化染色體會專家講座第40頁2.抗體:特異性,高效價,親協(xié)力,適度稀釋度3.石蠟切片-抗原修復(fù)

(1)蛋白酶消化:胰蛋白酶胰糜蛋白酶鏈霉蛋白酶蛋白酶K胃蛋白酶

消化不足-修復(fù)失敗,假陰性或信號弱消化過分-結(jié)構(gòu)破環(huán),脫片(2)熱修復(fù):微波照射高壓加熱水浴加熱

(3)微波+蛋白酶消化注意點:★固定時間長,消化時間或熱修復(fù)時間適當(dāng)延長★酶生產(chǎn)廠家不一,或批號不一,消化時間可能