藥物分離與純化技術(shù)課程

項目2藥物分離純化前的預(yù)處理技術(shù)

——沉淀法去除雜質(zhì)（鹽析法）大綱1.沉淀法概述2.鹽析法分離蛋白質(zhì)3.鹽析法的應(yīng)用沉淀法去除雜質(zhì)（鹽析法）一、沉淀法概述

1.固相析出技術(shù)

生物工業(yè)的最終產(chǎn)品許多是以固體形態(tài)出現(xiàn)的。通過加入某種試劑或改變?nèi)芤簵l件，使生化產(chǎn)物以固體形式從溶液中沉淀析出的分離純化技術(shù)稱為固相析出技術(shù)。固相析出技術(shù)操作簡單、成本低、濃縮倍數(shù)高，廣泛應(yīng)用于生物產(chǎn)品的分離純化過程中。

在固相析出過程中，析出物為晶體時稱為結(jié)晶法，析出物為無定形固體時稱為沉淀法。沉淀結(jié)晶沉淀法去除雜質(zhì)（鹽析法）

2.

常用的沉淀法：鹽析法、有機溶劑沉淀法和等電點沉淀法等。沉淀和結(jié)晶在本質(zhì)上同屬于一種過程，都是新相析出的過程。

3.沉淀和結(jié)晶區(qū)別：構(gòu)成單位(原子、分子或離子)的排列方式不同。

沉淀法：具有濃縮與分離的雙重效果，但所得的沉淀物可能聚集有多種物質(zhì)，或含有大量的鹽類或包裹著溶劑。

結(jié)晶法：由于只有同類原子、分子或離子才能排列成晶體，所以結(jié)晶法析出的晶體純度比較高。沉淀法去除雜質(zhì)（鹽析法）4.沉淀法的原理：

生物分子在水中形成穩(wěn)定的溶液是有條件的，這些就是溶液的各種理化參數(shù)。任何能夠影響這些條件的因素都會破壞溶液的穩(wěn)定性。溶劑組分的改變或加入某些沉淀劑以及改變?nèi)芤旱膒H值、離子強度和極性都會使溶質(zhì)的溶解度產(chǎn)生明顯的改變。

沉淀操作常在發(fā)酵液經(jīng)過過濾和離心以后進行，得到的沉析物可直接干燥制得成品或經(jīng)進一步提純，如透析、超濾、層析或結(jié)晶制得高純度生化產(chǎn)品。沉淀法去除雜質(zhì)（鹽析法）沉淀法不僅用于實驗室中，也廣泛用于生產(chǎn)的制備過程，是分離純化生物大分子，特別是制備蛋白質(zhì)和酶時最常用的方法。優(yōu)點：操作簡單、經(jīng)濟、濃縮倍數(shù)高缺點：針對復(fù)雜體系而言，分離度不高、選擇性不強沉淀法去除雜質(zhì)（鹽析法）根據(jù)所加入的沉淀劑的不同，沉淀法可以分為：（1）鹽析法；（2）等電點沉淀法；（3）有機溶劑沉淀法；（4）非離子型聚合物沉淀法；（5）聚電解質(zhì)沉淀法；（6）復(fù)合鹽沉淀法等（7）結(jié)晶法5.沉淀法分類沉淀法去除雜質(zhì)（鹽析法）二、鹽析法分離蛋白質(zhì)鹽析：在高濃度的中性鹽存在下，蛋白質(zhì)（酶）等生物大分子物質(zhì)在水溶液中的溶解度降低，產(chǎn)生沉淀的過程。

鹽析不同于變性，鹽析是可逆的，而變性是不可逆的。高級脂肪酸鈉的鹽析沉淀法去除雜質(zhì)（鹽析法）鹽析法特點：優(yōu)點：成本低，操作簡單、安全、不會引起蛋白質(zhì)變性。缺點：分辨率不高，分離效果不理想，通常只是作為初步的分離純化，還需要結(jié)合其它的純化方法。蛋白質(zhì)的鹽析沉淀法去除雜質(zhì)（鹽析法）（一）鹽析法原理

（1）破壞水化膜，分子間易碰撞聚集（2）破壞水化膜，暴露出憎水區(qū)域，由于憎水區(qū)域間作用使蛋白質(zhì)聚集而沉淀，憎水區(qū)域越多，越易沉淀。（3）中和電荷，減少靜電斥力，中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液后，蛋白質(zhì)表面電荷大量被中和，靜電斥力降低，導(dǎo)致蛋白溶解度降低，使蛋白質(zhì)分子之間聚集而沉淀。沉淀法去除雜質(zhì)（鹽析法）（二）中性鹽的選擇1.選用中性鹽2.鹽析作用強3.鹽析用鹽需有較大的溶解度4.鹽析用鹽必須是惰性的5.來源豐富、經(jīng)濟鹽析中常用的鹽：硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉硫酸銨是最常用的蛋白質(zhì)鹽析沉淀劑沉淀法去除雜質(zhì)（鹽析法）（三）影響鹽析的因素（1）蛋白質(zhì)性質(zhì)各種蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)不同，鹽析沉淀要求的離子強度也不同。（2）蛋白質(zhì)濃度一般認為2.5%-3.0%的蛋白質(zhì)濃度比較適中。（3）離子強度和類型離子強度越大，蛋白質(zhì)的溶解度越低。離子種類對蛋白質(zhì)的溶解度也有一定影響，一般陰離子的鹽析效果比陽離子好，尤其以高價陰離子更為明顯。離子半徑小而很高電荷的離子在鹽析方面影響較強。（4）pH值：一般來說，蛋白質(zhì)所帶凈電荷越多溶解度越大，凈電荷越少溶解度越小，在等電點時蛋白質(zhì)溶解度最小。為提高鹽析效率，多將溶液pH值調(diào)到目的蛋白的等電點處。（5）溫度：在一般情況下，蛋白質(zhì)對鹽析溫度無特殊要求，可在室溫下進行，只有某些對溫度比較敏感的酶要求在0-4℃進行。沉淀法去除雜質(zhì)（鹽析法）（五）鹽析的應(yīng)用鹽析廣泛應(yīng)