無菌檢查操作指導(dǎo)書無菌檢查操作指導(dǎo)書/無菌檢查操作指導(dǎo)書無菌檢查操作指導(dǎo)書1.0目的建立無菌檢查標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，規(guī)范無菌檢查操作過程，保證檢查結(jié)果的正確性。2.0適用范圍適用于公司無菌檢查操作過程。3.0職責(zé)相關(guān)操作人員負(fù)責(zé)本規(guī)程的詳盡推行，質(zhì)檢部負(fù)責(zé)對(duì)本規(guī)程的推行過程進(jìn)行監(jiān)督。4.0作業(yè)內(nèi)容4.1培養(yǎng)基的制備及培養(yǎng)條件培養(yǎng)基可按以下給出的處方制備，也可使用按處方生產(chǎn)的吻合規(guī)定的脫水培養(yǎng)基或成品培養(yǎng)基。配制后應(yīng)采用考據(jù)合格的滅菌程序滅菌。制備好的培養(yǎng)基應(yīng)保存在2～25℃、避光環(huán)境下，三周內(nèi)使用。硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基主要用于厭氧菌的培養(yǎng)，也可用于需氧菌的培養(yǎng)。配方以下：名稱數(shù)量名稱數(shù)量胰酪胨15.0g氯化鈉2.5g酵母浸出粉5.0g新配制得0.1％刃天青溶液1.0ml無水葡萄糖5.0g瓊脂0.75gL-胱氨酸0.5g水1000ml硫乙醇酸鈉0.5g除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混雜，微溫溶解，調(diào)治pH為弱堿性，煮沸，濾清，加入葡萄糖和刃天青溶液，搖勻，調(diào)治pH,使滅菌后在25℃的pH值為7.1土0.2。分裝至合適的容器中，其裝量與容器高度的比率應(yīng)吻合培養(yǎng)結(jié)束后培養(yǎng)基氧化層（粉紅色)不高出培養(yǎng)基深度的1/2。滅菌。在供試品接種前，培養(yǎng)基氧化層的高度不得高出培養(yǎng)基深度的1/5，否則，須經(jīng)100°C水浴加熱至粉紅色消失（不釋過20分鐘），迅速冷卻，只限加熱一次，并防范被污染。除還有規(guī)定外，硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基置30?35℃培養(yǎng)。胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基用于真菌和需氧菌的培養(yǎng)。配方以下：名稱數(shù)量名稱數(shù)量胰酪胨17.0g氯化鈉5.0g大豆木瓜蛋白酶水解物3.0g磷酸氫二鉀2.5g葡萄糖/無水葡萄糖2.5g/2.3g水1000ml除葡萄糖外，取上述成分，混雜，微溫溶解，濾過，調(diào)治pH使滅菌后在25℃的pH值為7.3±0.2，加入葡萄糖，分裝，滅菌。胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基置20?25℃培養(yǎng)。胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基配制方法以下：名稱數(shù)量名稱數(shù)量胰酪胨15.0g瓊脂15.0g大豆木瓜蛋白酶水解物5.0g水1000ml氯化鈉5.0g除瓊脂外，取上述成分，混雜，微溫溶解，調(diào)治pH使滅菌后在25℃的pH值為7.3±0.2，加人瓊脂，加熱溶化后，搖勻，分裝，滅菌。沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基用于黑曲霉的培養(yǎng)。培養(yǎng)以下：名稱數(shù)量動(dòng)物組織胃蛋白酶水解物和胰酪胨等量混雜物10.0g葡萄糖40.0g瓊脂15.0g水1000ml除葡萄糖、瓊脂外，取上述成分，混雜，微溫溶解，調(diào)治pH使滅菌后在25℃的pH值為5.6士0.2，加入瓊脂，加熱溶化后，再加入葡萄糖，搖勻，分裝，滅菌。4.2培養(yǎng)基的無菌性檢查每批培養(yǎng)基隨機(jī)取很多于5支（瓶），置各培養(yǎng)基規(guī)定的溫度培養(yǎng)14天，應(yīng)無菌生長。4.3培養(yǎng)基的矯捷度檢查4.3.1菌種培養(yǎng)基矯捷度檢查所用的菌株傳代次數(shù)不得高出5代(從菌種保存中心獲得的干燥菌種為第0代），并采用合適的菌種珍藏技術(shù)進(jìn)行保存，以保證試驗(yàn)菌株的生物學(xué)特點(diǎn)。金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus)銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa)

〔CMCC(B)26003〕〔CMCC(B)10104〕枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis)

〔CMCC(B)63501〕白色念珠菌

(Candidaalbicans)

〔CMCC(F)98001〕黑曲霉（

Aspergillus

niger)

〔CMCC(F)98003〕菌液的制備接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中或胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上，接種生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，30?35℃培養(yǎng)18?24小時(shí)；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，20?25℃培養(yǎng)24?48小時(shí)，上述培養(yǎng)物用PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無菌氯化鈉溶液制成每lml含菌數(shù)小于100cfu的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上，20?25℃培養(yǎng)5?7天，加入3?5ml含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。爾后，采用合適的方法吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用含0.05%(ml/ml)聚山梨醋80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無菌氯化鈉溶液制成每

lml

含孢子數(shù)小于

100cfu

的孢子懸液。菌懸液若在室溫下放置，應(yīng)在

2小時(shí)內(nèi)使用；若保存在

2?8°C可在

24小時(shí)內(nèi)使用。黑曲霉孢子懸液可保存在2?8°C，在考據(jù)過的儲(chǔ)藏期內(nèi)使用。培養(yǎng)基的接種取每管裝量為12ml的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基7支，分別接種小于100cfu的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、生孢梭菌各2支，另1支不接種作為空白比較，培養(yǎng)3天；取每管裝量為9ml的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基7支，分別接種小于100cfu的枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接種作為空白比較，培養(yǎng)5天。每天觀察結(jié)果。結(jié)果判斷空白比較管應(yīng)無菌生長，若加菌的培養(yǎng)基管均生長優(yōu)異，判該培養(yǎng)基的矯捷度檢查吻合規(guī)定。4.4方法適應(yīng)性試驗(yàn)菌種及菌液制備除大腸埃希菌（Escherichiacoli)（CMCC(B)44102〕外，金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌株及菌液制備同培養(yǎng)基靈敏度檢查。大腸埃希菌的菌液制備同金黃色葡萄球菌。膜過濾法取每種培養(yǎng)基規(guī)定接種的供試品總量按薄膜過濾法過濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加入小于100cfu的試驗(yàn)菌，過濾。加硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基至濾筒內(nèi)。另取一裝有同體積培養(yǎng)基的容器，加入等量試驗(yàn)菌，作為比較。置規(guī)定溫度培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間不得高出5天，各試驗(yàn)菌同法操作。直接接種法取吻合直接接種法培養(yǎng)基用量要求的硫乙酵酸鹽流體培養(yǎng)基

6管，分別接入小于

100cfu

的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、生孢梭菌各

2管，取吻合直接接種法培養(yǎng)基用量要求的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基

6管，分別接入小于

100cfu

的枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉各2管。其中1管接入每支培養(yǎng)基規(guī)定的供試品接種量，另1管作為比較，置規(guī)定的溫度培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間不得高出5天。結(jié)果判斷與比較管比較，如含供試品各容器中的試驗(yàn)菌均生長優(yōu)異，則說明供試品的該檢驗(yàn)量在該檢驗(yàn)條件下無抑菌作用或其抑菌作用能夠忽略不計(jì)，照此檢査方法和檢查條件進(jìn)行供試品的無菌檢查。如含供試品的任一容器中的試驗(yàn)菌生長微弱、緩慢或不生長，則說明供試品的該檢驗(yàn)量在該檢驗(yàn)條件下有抑菌作用，應(yīng)采用增加沖洗量、增加培養(yǎng)基的用量、使用中和劑或滅活劑、更換濾膜品種等方法，除掉供試品的抑菌作用，并重新進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)。方法適用性試驗(yàn)也可與供試品的無菌檢查同時(shí)進(jìn)行。4.5供試品的無菌檢查無菌檢査法包括薄膜過濾法和直接接種法。只要供試品性質(zhì)贊同，應(yīng)采用薄膜過濾法。供試品無菌檢查所采用的檢查方法和檢驗(yàn)條件應(yīng)與方法適用性試驗(yàn)確認(rèn)的方法相同。無菌試驗(yàn)過程中，若需使用表面活性劑、滅活劑、中和劑等試劑，應(yīng)證明其有效性，且對(duì)微生物無毒性。陽性比較應(yīng)依照供試品特點(diǎn)選擇陽性比較菌：無抑菌作用及抗革蘭陽性菌為主的供試品，以金黃色葡萄球菌為比較菌；抗革蘭陰性菌為主的供試品以大腸埃希菌為比較菌；抗厭氧菌的供試品，以生孢梭菌為比較菌；抗真菌的供試品，以白色念珠菌為比較菌。陽性比較試驗(yàn)的菌液制備同方法適用性試驗(yàn)，加菌量小于100cfu，供試品用量同供試品無菌檢查時(shí)每份培養(yǎng)基接種的樣品量。陽性比較管培養(yǎng)72小時(shí)內(nèi)應(yīng)生長優(yōu)異。陰性比較供試品無菌檢查時(shí)，應(yīng)取相應(yīng)溶劑和稀釋液、沖洗液同法操作，作為陰性比較。陰性比較不得有菌生長。供試品辦理及接種培養(yǎng)基操作時(shí)，用合適的消毒液對(duì)供試品容器表面進(jìn)行完整消毒，若是供試品容器內(nèi)有必然的真空度，可用合適的無菌器材(如帶有除菌過濾器的針頭）向容器內(nèi)導(dǎo)人無菌空氣，再按無菌操作啟開容器取出內(nèi)容物。薄膜過濾法薄膜過濾法一般應(yīng)采用封閉式薄膜過濾器。無菌檢査用的濾膜孔徑應(yīng)不大于0.45μm，直徑約為50mm。依照供試品及其溶劑的特點(diǎn)選擇濾膜材質(zhì)。使用時(shí)，應(yīng)保證濾膜在過濾前后的完滿性。水溶性供試液過濾前應(yīng)先將少量的沖洗液過濾，以潤濕濾膜。油類供試品，其濾膜和過濾器在使用前應(yīng)充分干燥。為發(fā)揮濾膜的最大過濾效率，應(yīng)注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個(gè)濾膜表面。供試液經(jīng)薄膜過濾后，若需要用沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量一般為100ml，且總沖洗量不得高出1000ml，以防范濾膜上的微生物受傷害。水溶性供試品的制備取規(guī)定量，直接過濾，或混雜至含很多于100ml合適稀釋液的無菌容器中，混勻，馬上過濾。如供試品擁有抑菌作用，須用沖洗液沖洗濾膜，沖洗次數(shù)一般很多于三次，所用的沖洗量、沖洗方法同方法適用性試驗(yàn)。除生物制品外，一般樣品沖洗后，1份濾器中加入100ml硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基，1份濾器中加入100ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基。生物制品樣品沖洗后，2份濾器中加入100ml硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基，1份濾器中加人100ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基。水溶性固體供試品的制備取規(guī)定量，加合適的稀釋液溶解或按標(biāo)簽說明復(fù)溶，爾后照水溶液供試品項(xiàng)下的方法操作。直接接種法直接接種法適用于無法用薄膜過濾法進(jìn)行無菌檢査的供試品，即取規(guī)定量供試品分別等量接種至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中。除生物制品外，一般樣品無菌檢查時(shí)兩種培養(yǎng)基接種的瓶或支數(shù)相等；生物制品無菌檢査時(shí)硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基接種的瓶或支數(shù)為2：1。除還有規(guī)定外，每個(gè)容器中培養(yǎng)基的用量應(yīng)吻合接種的供試品體積不得大于培養(yǎng)基體積的10%，同時(shí)，硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基每管裝量很多于15ml，胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基每管裝量很多于10ml。供試品檢査時(shí)，培養(yǎng)基的用量和髙度同方法適用性試驗(yàn)。固體供試品的制備取規(guī)定量，直接等量接種至各管培養(yǎng)基中?；蚣尤牒线m的溶劑溶解，或按標(biāo)簽說明復(fù)溶后，取規(guī)定童等量接種至各管培養(yǎng)基中。培養(yǎng)及觀察將上述接種供試品后的培養(yǎng)基容器分別按各培養(yǎng)基規(guī)定的溫度培養(yǎng)14天；接種生物制品供試品的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基的容器應(yīng)分成兩等份，一份置3035℃培養(yǎng)，一份置20?25℃培養(yǎng)。培養(yǎng)時(shí)期應(yīng)每天觀察并記錄可否有菌生長。如在加入供試品后或在培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁，培養(yǎng)14天后，不能夠從外觀上判斷有無微生物生長，可取該培養(yǎng)液合適轉(zhuǎn)種至同種新鮮培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3天，觀察接種的同種新鮮培養(yǎng)基可否再出現(xiàn)渾濁；或取培養(yǎng)液涂片，染色，鏡檢，判斷可否有菌。結(jié)果判斷陽性比較管應(yīng)生長優(yōu)異，陰性比較管不得有菌生長。否則，試驗(yàn)無效。若供試品管均澄清，或雖顯渾濁但經(jīng)確證無菌生長，判供試品吻合規(guī)定；若供試品管中任何一管顯渾濁并確證有菌生長，判供試品不吻合規(guī)定，除非能充分證明試驗(yàn)結(jié)果無效，即生長的微生物非供試品所含。當(dāng)吻合以下最少一個(gè)條件時(shí)方可判試驗(yàn)結(jié)果無效：無菌檢查試驗(yàn)所用的設(shè)備及環(huán)境的微生物監(jiān)控結(jié)果不吻合無菌檢查法的要求?；仡櫉o菌試驗(yàn)過程，發(fā)現(xiàn)有可能引起微生物污染的因素。供試品管中生長的微生物經(jīng)判斷后，確證是因無菌試驗(yàn)中所使用的物品和（或)無菌操作技術(shù)不當(dāng)引起的。試驗(yàn)若經(jīng)確認(rèn)無效，應(yīng)重試。重試時(shí)，重新取同量供試品，依法檢查，若無菌生長，判供試品吻合規(guī)定；若有菌生長，判供試品不吻合規(guī)定。5.0參照文件《中國藥典》2015版6.0記錄表格無菌檢查記錄無菌檢查記錄供試品名稱：批號(hào)：檢驗(yàn)日期：

規(guī)格：送檢數(shù)量：完成日期：檢驗(yàn)依照：《中國藥典》2015版第四部公則1101“無菌檢查法”培養(yǎng)基硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基配制批號(hào)：胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基配制批號(hào)：稀釋液、緩沖液□pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液配制批號(hào)：□0.9%無菌氯化鈉溶液陽性菌取陽性菌新鮮培養(yǎng)物培養(yǎng)后所得的菌體，用稀釋液制成