高通量測序技術(shù)及其在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用第一頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期二一、高通量測序簡介二、高通量測序平臺(tái)的介紹三、高通量測序技術(shù)在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用第二頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期二1.1什么是高通量測序技術(shù)高通量序技術(shù)（next-generationsequencing）是對傳統(tǒng)Sanger法測序的一次革命性的改變，是一次可對幾十萬到幾百萬條DNA分子進(jìn)行序列測定的高通量的測序技術(shù)，同時(shí)高通量測序使得對一個(gè)物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行細(xì)致全貌的分析成為可能，所以又被稱為深度測序(deepsequencing)。

一.高通量測序技術(shù)第三頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期二1.2為什么要發(fā)展高通量測序技術(shù)快速和準(zhǔn)確地獲取生物體的遺傳信息對于生命科學(xué)研究一直具有十分重要的意義。對于每個(gè)生物體來說，基因組包含了整個(gè)生物體的遺傳信息。測序技術(shù)能夠真實(shí)地反映基因組DNA上的遺傳信息，進(jìn)而比較全面地揭示基因組的復(fù)雜性和多樣性，因而在生命科學(xué)研究中扮演了十分重要的角色。第四頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期二1977年Sanger等發(fā)明的雙脫氧核苷酸末端終止法和Gilbert等發(fā)明的化學(xué)降解法，標(biāo)志著第一代測序技術(shù)的誕生。盡管第一代測序技術(shù)已經(jīng)幫助人們完成了從噬菌體基因組到人類基因組草圖等大量的測序工作，但由于其存在成本高、速度慢等方面的不足，并不是最理想的測序方法。經(jīng)過不斷的開發(fā)和測試，進(jìn)入21世紀(jì)后，以Roche公司的454技術(shù)、Illumina公司的Solexa技術(shù)和ABI公司的SOLiD技術(shù)為標(biāo)志的第二代測序技術(shù)誕生了。第五頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期二1.3高通量測序技術(shù)的特點(diǎn)速度快準(zhǔn)確度高成本低覆蓋度深產(chǎn)出巨大第六頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期二二

高通量測序技術(shù)的原理高通量測序技術(shù)包括Roche公司的454技術(shù)、Illumina公司的Solexa技術(shù)和ABI公司的SOLiD技術(shù)。下面對三種高通量測序技術(shù)的原理和特點(diǎn)分別進(jìn)行具體介紹。第七頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期二454Pyrosequencing基于磁珠的焦磷酸測序：A磁珠制備設(shè)備B454測序儀C454測序原理第八頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期二第九頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期二第十頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期二454測序流程與BaseCalling每次加入一種堿基然后再對熒光強(qiáng)度進(jìn)行讀取。堿基聚合反應(yīng)產(chǎn)生焦磷酸ppi，ppi在硫化酶催化下生成ATP，ATP在熒光酶催化下激發(fā)熒光，熒光強(qiáng)度和焦磷酸的量成正比。第十一頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期二454技術(shù)的主要缺點(diǎn)是無法準(zhǔn)確測量同聚物(homopolymer)的長度。例如當(dāng)待測序列中出現(xiàn)Poly(A)的情況下，測序反應(yīng)中會(huì)一次加上多個(gè)T，而加入T的數(shù)目只能從熒光信號(hào)的強(qiáng)度來推測，有可能造成結(jié)果不準(zhǔn)確。也正是因?yàn)檫@個(gè)原因，454技術(shù)主要的錯(cuò)誤不是來自核苷酸的替換，而是來自插入或缺失。454技術(shù)最大的優(yōu)勢在于較長的讀取長度，使得后繼的序列拼接工作更加高效、準(zhǔn)確。第十二頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期二IlluminaSolexa簡介橋式PCR邊合成邊測序可逆終止物HiSeq2000第十三頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期二第十四頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期二第十五頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期二Solexa的特點(diǎn)與主要應(yīng)用讀長較短，100－150bp通量高，25G每天，120-150G每Run主要應(yīng)用：RNA測序、表觀遺傳學(xué)研究第十六頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期二ABISOLiD簡介SOLiD

SequencingbyOligoLigation/DetectionOligo連接測序：通過連接酶連接，再對oligo上熒光基團(tuán)進(jìn)行檢測SOLiD5500xl第十七頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期二ABISOLiD測序前期制備A樣品片段化磁珠連接B乳化PCR3‘末端修飾C磁珠富集轉(zhuǎn)到測序玻片第十八頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期二ABISOLiD測序原理測序流程依次加入五種引物進(jìn)行五次測序。加入測序引物及加入oligo連接酶連接，激發(fā)熒光檢測，循環(huán)一個(gè)流程，換一種引物再循環(huán)一個(gè)流程，五個(gè)流程結(jié)果疊加分析出序列。第十九頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期二SOLiD的特點(diǎn)與主要應(yīng)用讀長較短，50-75bp精度高，可達(dá)Q40通量高，20-30G每天，1Run可達(dá)120G主要應(yīng)用：基因組重測序、SNP檢測等第二十頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期二三種平臺(tái)的技術(shù)差異平臺(tái)454SolexaSOLiDPCR磁珠乳化PCR橋式PCR磁珠乳化PCR測序載體磁珠玻片玻片測序方式焦磷酸、熒光可逆終止物、熒光連接酶、熒光結(jié)果序列FastQFastQCSFastQ第二十一頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期二三、高通量測序技術(shù)在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用目前，高通量測序技術(shù)已廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物全基因組測序、基因組重測序、轉(zhuǎn)錄組測序、小RNAs測序和表觀基因組測序等方面。下面對高通量測序技術(shù)在農(nóng)業(yè)研究中的一些具體應(yīng)作以介紹。第二十二頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期二3.1全基因組重測序全基因組重測序是對已知基因組序列的物種進(jìn)行不同個(gè)體的基因組測序，并在此基礎(chǔ)上對個(gè)體或群體進(jìn)行差異性分析。全基因組重測序的個(gè)體，通過序列比對，可以找到大量的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(SNP)、插入缺失位點(diǎn)(InDel，Insertion/Deletion)、結(jié)構(gòu)變異位點(diǎn)(SV，StructureVariation)，通過生物信息學(xué)手段，分析不同個(gè)體基因組間的結(jié)構(gòu)差異，同時(shí)完成注釋。

第二十三頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期二3.1.1利用重測序進(jìn)行進(jìn)化分析及SNP篩選

Lai等(2010)對6個(gè)玉米(Zeamays)骨干自交系進(jìn)行了全基因組重測序，共發(fā)現(xiàn)

1273124個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(SNPs)，得到30178個(gè)1～6bp的插入缺失位點(diǎn)(InDels)，新發(fā)現(xiàn)的這些SNPs和InDels提供了1個(gè)高密度的全基因組標(biāo)記信息，同時(shí)也鑒定出數(shù)百個(gè)基因獲得與丟失變異(Presence/AbsenceVariations，PAVs)。第二十四頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期二3.1.2利用重測序技術(shù)鑒定突變體突變基因Ashelford等(2011)對一個(gè)擬南芥突變體ebi－1的回交系進(jìn)行基因組重測序，隨后又通過對突變體的表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行調(diào)查使得候選SNPs數(shù)目得以有效縮小，最終成功鑒定出1個(gè)在AtNFXL－2基因中引起ebi－1突變表型的SNPs位點(diǎn)該研究證實(shí)利用回交系材料可以降低遺傳背景噪音，對其進(jìn)行測序分析可有效減少候選SNPs數(shù)目。第二十五頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期二3.2全基因組denovo測序

全基因組denovo測序也稱為從頭測序，是直接對某個(gè)物種進(jìn)行基因組全測序，然后利用生物信息學(xué)方法對序列進(jìn)行拼接和組裝，得到完整的物種基因組序列、基因組測序?qū)ρ芯课锓N的基因組和功能基因信息、闡明物種的進(jìn)化及其生長發(fā)育具有重要的意義。

Huang等(2009)完成的黃瓜(CucumissativusL.)全基因組測序是世界上第一個(gè)完成全基因組測序的蔬菜作物，該工作的完成對黃瓜及其他近緣物種的遺傳、改良基礎(chǔ)生物學(xué)研究等具有重要的意義。第二十六頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期二3.3轉(zhuǎn)錄組測序研究

轉(zhuǎn)錄組是指特定組織或細(xì)胞在某一功能狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄出來的所有RNA的總和，包括mRNA和非

編碼RNA。轉(zhuǎn)錄組測序是指通過新一代高通量測序技術(shù)對cDNA測序，利用統(tǒng)計(jì)相關(guān)reads數(shù)計(jì)算出不同mRNA的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄水平的SNP新的mRNA等，該技術(shù)可以從表達(dá)水平、等位基因特異性表達(dá)RNA編輯、含有重要信息的融合基因轉(zhuǎn)錄子差異剪接等方面展開相關(guān)研究。第二十七頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期二Zhang等(2010)用8種不同水稻(OryzasativaL.)樣品的不同組織于不同時(shí)期混合建庫，通過轉(zhuǎn)錄組技術(shù)分析了栽培稻的第1張轉(zhuǎn)錄組圖譜，結(jié)果在水稻8種組織樣品中檢測到大約27000個(gè)基因的表達(dá)和38000個(gè)轉(zhuǎn)錄單元，證實(shí)了約9000個(gè)基因發(fā)生可變