基因工程技術(shù)：按照人們的愿望，進行嚴(yán)密的設(shè)計，通過體外DNA重組和轉(zhuǎn)移等技術(shù)，有目的地改造生物種性，使現(xiàn)有物種在較短的時間內(nèi)趨于完善，創(chuàng)造出新的生物類型。質(zhì)粒是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子，大小從1-200kb不等，為雙鏈、共價閉合環(huán)狀DNA分子cccDNA，并以超螺旋狀態(tài)存在于宿主細(xì)胞中，它具有自主的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制一般有二種：緊密控制型（stringentcontrol）和松弛控制型（relaxedcontrol）。前者只在細(xì)胞周期的一定階段進行復(fù)制，通常每個細(xì)胞內(nèi)只含有一個或幾個質(zhì)粒分子；后者在整個細(xì)胞周期中隨時可以復(fù)制，在每個細(xì)胞中有許多拷貝。質(zhì)粒的不相容性：利用共同復(fù)制系統(tǒng)的不同質(zhì)粒不能在同一宿主細(xì)胞中共存。從細(xì)胞中分離質(zhì)粒DNA的方法都包括3個基本步驟：培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴增；收集和裂解細(xì)胞；分離和純化質(zhì)粒DNA。溶菌酶：破壞菌體細(xì)胞壁；SDS和TritonX-100：使細(xì)胞膜裂解。染色體DNA通常用于構(gòu)建基因組文庫和Southern雜交等?；蚪MDNA的提取植物基因組DNA提?。禾崛【彌_液（Tris.Cl—保持pH,EDTA,NaCl,SDS），氯仿/戊醇/乙醇溶液—沉淀和抽提DNA，異丙醇—沉淀DNA（提染色體），TE（Tris.Cl,EDTA）--溶解DNA，RNase—保存液，降解RNA，NaAC—加鹽，70%乙醇—漂洗。細(xì)菌基因組DNA提?。篠DS，蛋白酶K，氯仿：異戊醇（24：1）--沉淀DNA，苯酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）--抽提，70%乙醇—漂洗，TE,NaCl—調(diào)節(jié)離子強度，RNaseA，CTAB/NaCl溶液—CTAB--一種陽離子去污劑，具有從低離子強度溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，異丙醇/無水乙醇—沉淀上清液。總RNA制備mRNA的分子結(jié)構(gòu)容易受到RNA酶的攻擊反應(yīng)而降解，加上RNA酶極為穩(wěn)定而且廣泛存在，因此，在提取過程中應(yīng)嚴(yán)格防止RNA酶的污染并設(shè)法抑制其活性，這是實驗成敗的關(guān)鍵。儀器—玻璃器皿：200℃烘2h，塑料器皿：DEPC水液處理—所有器皿最后硅烷化處理。RNA酶抑制劑：DEPC--強烈但不徹底，與氨水溶液混合會產(chǎn)生致癌物；異硫氰酸胍--最有效，使RNA酶失活；其他--RNA酶蛋白抑制劑（RNasin）SDS,尿素等。細(xì)胞內(nèi)總RNA制備方法：異硫氰酸胍熱苯酚法、酚/SDS法、Trizol法。（均先將組織在液氮中研磨成粉末）異硫氰酸胍熱苯酚法：異硫氰酸胍(GIT)與β－巰基乙醇共同作用抑制RNase的活性，GIT與十二烷基肌氨酸鈉(Sarcosyl)作用使蛋白質(zhì)變性。酚/SDS法：用酚和SDS破碎細(xì)胞和去除蛋白質(zhì)，用LiCl選擇沉淀RNA以去除DNA和其它不純物。Trizol法：Trizol試劑（含酚、異硫氰酸胍和溶解劑等）。mRNA提取制備mRNA原理：分離的總RNA可利用mRNA3’端含有poly(A)的特點，用oligo(dT)纖維素柱分離，當(dāng)RNA流經(jīng)oligo(dT)纖維素柱時，在高鹽緩沖液作用下，mRNA被特異的吸附在oligo(dT)纖維素上，然后逐漸降低鹽濃度洗脫，在低鹽溶液或蒸餾水中，mRNA被洗下。然后經(jīng)過兩次oligo（dT）纖維素柱，可得到較純的mRNA。純化的mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。（上樣buffer和洗脫buffer）。溶液中無鹽時要沉淀RNA，必須加鹽NaAC。講瓊脂烘糖凝摧膠電呆泳默DN喚A凝扮膠電結(jié)泳：慢瓊脂爬糖鳥--夸有分離掘DN盆A片立段大俯小范衫圍廣滿；聚糖丙烯烈酰胺識--鞋城小片猾段，惰分辨稅力高螞。辮瓊脂危糖凝突膠電圾泳特菌性粥：1廁.D腦NA枝分子放大小隔：D炭NA單分子寺在一庭定瓊應(yīng)脂糖贏濃度喬下的摘遷移療率；訂2.延瓊脂鑄糖濃澤度：暴1.環(huán)0-本1.捧2%夕；3和.D宇NA丹分子惑構(gòu)象占：超揚螺旋飄DN逢A最慈快，監(jiān)線狀改雙鏈濟最慢診；4娛.電狡源電勵壓：禁不大戒于5傭V/膠cm略，負(fù)澆—吐正；堪5.董染料凳：溴邊化乙掃錠（爭EB王）-懷-強吃誘變置劑；貌6.個離子墻強度兄：0壟.5造*T命BE帆（不穗能過親高，尾避免球bu引ff蠢er島發(fā)燙膊）索。階RN泛A凝宇膠電肌泳逢：霧RN道A分射子有聲很多析二級徑結(jié)構(gòu)中，需裂經(jīng)變買性劑張?zhí)幚砼悖膳c以破駝壞R虜NA疊中的趙二級肥結(jié)構(gòu)禿。然呈后，餃用瓊啦脂糖然凝膠嫌電泳新可分軍級分槽離不梯同大份小的踢mR笨NA鞭分子碎。透RN規(guī)A瓊亞脂糖行凝膠獄電泳勒方法農(nóng)有三繳種率：安乙二壩醛變串性電查泳、失甲醛周變性懲電泳菊和羥井甲基恐汞（勝劇毒膜）瓊匪脂檔變性蠻電泳奸。龍DN踏A限東制性免內(nèi)切顏酶倒限制未性內(nèi)泉切酶兩：箭限制醉性內(nèi)返切酶襲是指切能特接異性監(jiān)結(jié)合壤于一池段被痰稱為繼限制笑性識偵別序塔列的吵DN燥A走序列匆之內(nèi)閉或其鴿附近行的特東異性礙位點博上，申并切助割雙字鏈潛DN六A碼。延I叉類酶雕：炮結(jié)合虛于識辰別位屑點并各隨機夏切割擾識別斷位點樂不遠(yuǎn)暑處的靠DN遭A窯；噴II斑類酶惜：應(yīng)由二抽種酶型分子廚組成化的二述元系繩統(tǒng)樣（核慢酸酶廈—僵切割暢、甲留基化慰酶庫—豐修飾估）罵，其牧識別保位點機和切涂割位望點是蝦同一糾位置志；膀II召I摘類酶追：舍在識扶別位俊點之季外切認(rèn)割傳DN產(chǎn)A畝分子樹，然煤后從婦底物釣上解拌離。誓甲基古化：取保護艘DN支A分疊子，鄙越活詳躍的頁地方上，甲谷基化刑程度板越低趴。彼切割側(cè)性能衫：什回文苦對稱妄特異夏核苷齒酸序幸列、絕平末烈端D足NA團片段商、粘嘆性末跟端。挺酶單皺位：味在合延適緩墾沖液倚和反夕應(yīng)溫諷度下?lián)?，在況20趨ul幻反應(yīng)智體積以中一輪小時谷內(nèi)完秧全降供解早1騰m暖g炭DN允A畫所需脫要的埋量癢。舒載體?。好绨岩还詡€有仆用的姑目的擦D匪NA專片段對通過物重組充DN默A維技術(shù)絕，送刑進受棋體細(xì)宋胞中衡去進評行繁辨殖和歇表達工的工強具。拒常見飾載體冬：質(zhì)球粒、嗚λ踩噬菌遵體、蒜粘粒譯、B謎AC晝、Y錘AC結(jié)等很。陰質(zhì)粒骨載體垃的特托性六：蓋分子饒量小謠、多些拷貝展、松械弛控掉制型腐；肆具有缸多種矛常用蔥的限硬制性坦內(nèi)切挎酶的盤單切肉點流；允能插次入較陪大的笑外源似DN辨A片欠段齊；禾具有稀容易攝操作他的檢怎測表額型勤。蔑pB搏R3級22屬、在pU賞C1震8/兆19鹿（分引子量倍更小跳、酒α奪-互票補原膽理變—樸藍(lán)白酷篩選步、多士克隆填位點歸區(qū)M止CS熊）騰、瓶pB躲lu援es賺cr肥ip到t俗SK觀(+媽/-算)檔（M冒CS勁）膊。株乳糖些操縱汽子：之α?xí)?互旦補原友理：漆la束cZ鈴（徒β溫-林半乳像糖苷移酶漆基因報）善基因外上缺隱失近肆操縱旗基因喚區(qū)段興的突若變體象與帶徒有完費整的擊近操蒼縱基東因區(qū)葉段的齊β及-蝴半乳炭糖苷嘗酶陰僅性突叉變體喇之間臭可以陰實現(xiàn)磚互補漠的現(xiàn)喜象評。節(jié)藍(lán)白揭斑篩活選焦：X安-g戚al榆--壟--前-I初PT惡G（僻乳糖搬類似脫物盜—騙誘導(dǎo)艙劑）樸--替--霉--植--顫藍(lán)色掀吲哚身產(chǎn)物后（當(dāng)夏外源略片段紐插入幣后，雹失去蟻α任-磨互補四能力曉，因盛而不直產(chǎn)生鑄β古-寨半乳磁糖苷鍬酶，表無法共分解語培養(yǎng)親基中芝的乳蹦糖，鴉菌落枯呈白奇色）難。羊λ走噬菌銜體留：侵宴染細(xì)紗菌的鉛病毒它（裂鍛解性蔽侵染獵、溶異源性波侵染舍）。丟【堿怕性磷星酸酶收--碧活性暫好,拼但較搶抗熱拜和去購污劑巴,在凍去磷樣酸化佩反應(yīng)燙后很烤難去猜除】縫細(xì)胞己轉(zhuǎn)化圾（t閑ra衡ns顆fo己rm讓at環(huán)io考n）熔是將膚外源坊DN悼A分邀子引琴入受敗體細(xì)毅胞，升使之云獲得導(dǎo)新的躺遺傳弓性狀萬的一迅種手扛段笨（E伙.c味ol洲i）悶。區(qū)【財如需揮將質(zhì)豪粒載廳體轉(zhuǎn)號移進嗚受體帶細(xì)胞刺，需想誘導(dǎo)紐受體捎細(xì)胞季產(chǎn)生研一種逆短暫義的感馬受態(tài)幕以攝汗取外輪源D食NA韻.存】膚感受墳態(tài)細(xì)睛胞：乘受體躺細(xì)胞江經(jīng)一憂些特碑殊方錯法（要如史Ca冊Cl好2腳、R削bC陪l（里KC干l）晝等化蠶學(xué)試蠟劑）營處理鹿后，蹤細(xì)胞塞膜的劉通透倒性發(fā)澆生了機暫時勸性改憶變，露成為鑼能允摧許外塵源D賞NA因分子困進入護的細(xì)華胞狀赤態(tài)。圈【L蹄B培托養(yǎng)基慎不含逢Am酷p，擾設(shè)2喝個對估照（捎防污卸染）費】候提高請轉(zhuǎn)化流效率睜的因慨素額：煤細(xì)胞廢生長鉆狀態(tài)獸和密哲度效（剛續(xù)進入拍對數(shù)情生長議期）器、診質(zhì)粒叢的質(zhì)除量和歪濃度挺（D添NA磨溶液舊體積使不超驅(qū)過感彎受態(tài)叫細(xì)胞窮體積抄的5駛%）呈、你試劑決質(zhì)量轎（最榴高純棍度）嶄、防宗止雜拆菌和顯雜D下NA坊污染敵（無遞菌器穴皿）絨。挪PC績R集技術(shù)隙的3意個步孤驟：烤變性芝：肢目的兇雙鏈伴DN嫩A在扒94區(qū)℃節(jié)下解孩鏈；均退火曲：兩鉛種寡醬核苷跨酸引狠物在釋適當(dāng)且溫度拘（5版0洞℃述左右倚）下探雨模掏板上哄的目攤的序蚊列通皇過氫幕鍵配強對；銹延伸智：T怕aq頂DN喜A聚丸合酶繪合成蝦DN逢A的埋最適麻溫度嗚下，孫以目微的D善NA掘為模好板進預(yù)行合蕉成。廉PC俗R反旋應(yīng)5放要素紗：引奸物、婦模板誓、酶耽、d羽NT光Ps走和M碼g平2+悔引物吃設(shè)計鄙原則取：喪1.紅引物職長度捎：（運20事bp畢）；薦2.狼引物彩擴增喝跨度團：2康kb精左右愁最有臺效；順3.脅引物吉堿基低：G失+C儀含量族40赤-6圍0%鈔為宜削，A秀TG怪C分若布均歐勻，序不要被集中瓶；4貍、避拐免引起物內(nèi)家部出沸現(xiàn)二蛾級結(jié)斥構(gòu)，幫避免能兩條成引物湖間互偏補；斥5.坊引物丘3溪’很端的與堿基始：嚴(yán)恨格要贈求配燕對；差6.但引物材中有俯或能拋加上極合適毀的酶驅(qū)切位樓點；餓7.碌引物痛的特休異性醒：與也其他土序列變無明屋顯同喂源性刊；8書.擴傭增產(chǎn)畏物本虹身無禮穩(wěn)定蘿二級拜結(jié)構(gòu)遲（以疼免產(chǎn)運生非蔽特異洽性）哄；9殖.引良物量速：濃宰度要鋪控制姓。彈模板道：可轉(zhuǎn)以是桃DN育A或笑RN昨A，賊可以懼是線焰狀或骨環(huán)狀名。陪Ta狀qD臣NA臺聚合德酶：票活性倡半衰雖期為疤92墻.5梅℃春（最胡后加仿入）開。桐dN紗TP立s：分質(zhì)量拌、濃燈度與懇PC機R擴汗增效文率有胳關(guān)，抵應(yīng)保獵存得醒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