腸球菌溶血素在臨床感染中的作用

腸球菌已成為院內(nèi)感染的第二位主要原因[13],其致病因子的研究十分迫切與重要。有研究表明,腸球菌溶血素在眼內(nèi)炎、心內(nèi)膜炎、腹膜炎等動(dòng)物模型中有致病作用[46]。筆者比較溶血性腸球菌、非溶血性腸球菌對(duì)小鼠的LD50及其對(duì)抗生素的敏感性,通過醫(yī)院臨床標(biāo)本以及健康人群糞便標(biāo)本腸球菌溶血素的檢出率調(diào)查,探討溶血性、非溶血性腸球菌的毒力差異以及溶血素在腸球菌的毒力作用。

1材料與方法

材料

菌株

腸球菌菌株

臨床菌株分離自福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院及福建省立醫(yī)院就診患者的尿液、膽汁、腹腔液和心瓣膜、白帶、前列腺等臨床標(biāo)本,健康人群菌株分離自某宿舍區(qū)健康自愿者、福建醫(yī)科大學(xué)教職工、學(xué)生等糞便標(biāo)本。

質(zhì)控菌株

藥敏質(zhì)控菌:腸球菌ATCC29212、腸球菌ATCC51299、金黃色葡萄球菌ATCC25923、大腸埃希氏菌ATCC25922。溶血對(duì)照乙型鏈球菌Bd1、甲型鏈球菌Bc3為福建醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)系保存菌株。

動(dòng)物

出生4周昆明種小鼠,體質(zhì)量g,雄性,清潔級(jí),福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

培養(yǎng)基

腸球菌培養(yǎng)基ELB1

LB培養(yǎng)基添加%Na2HPO4,%葡萄糖,%枸櫞酸鈉,~。

糞便分離腸球菌選擇培養(yǎng)基ELB2ELB1培養(yǎng)基添加5%NaCl,%結(jié)晶紫,20U/mL卡那霉素,~。

引物

擴(kuò)增片段范圍544~1024bp。

方法

腸球菌鑒定

參照文獻(xiàn)[7]方法。

腸球菌溶血素檢測(cè)

表型測(cè)定:待測(cè)菌接種于ELB1肉湯,37℃培養(yǎng)過夜,將培養(yǎng)液劃線分離接種到5%兔血平板,37℃培養(yǎng)36h,出現(xiàn)透明β溶血環(huán)為溶血表型陽性,并用甲型鏈球菌Bc3、乙型鏈球菌Bd1做а、β溶血對(duì)照?；蛐蜏y(cè)定:以cylA引物擴(kuò)增544~1024bp的cylA片段,PCR產(chǎn)物經(jīng)％瓊脂糖凝膠電泳,溴化乙啶染色,480bp位置出現(xiàn)相應(yīng)條帶為基因型陽性。表型及基因型均陽性為溶血性腸球菌,表型及基因型均陰性為非溶血性腸球菌。

PCR反應(yīng)體系:ExTaq預(yù)混液;上游引物;下游引物;菌液上清;高壓滅菌水;總計(jì)。PCR反應(yīng)程序:94℃3min→×30→72℃7min。

測(cè)定

選取溶血性、非溶血性腸球菌各8株,分別接種于ELB肉湯,37℃培養(yǎng)48h,取培養(yǎng)物5000r/min離心5min,PBS洗3次,用無菌生理鹽水調(diào)節(jié)濃度至1×1011,1×1010,1×109,1×108和1×107cfu/mL5個(gè)稀釋度。腹腔注射小鼠,每種濃度5只,每只。連續(xù)觀察7d,記錄死亡情況。Karber法計(jì)算LD50[8]。

抗生素藥敏實(shí)驗(yàn)

美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)推薦的常規(guī)藥物紙片擴(kuò)散法,并用質(zhì)控菌為對(duì)照。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

臨床標(biāo)本、健康人群糞便標(biāo)本的腸球菌溶血素檢出率的比較、溶血性腸球菌、非溶血性腸球菌的耐藥性分析均采用χ2檢驗(yàn),溶血性腸球菌、非溶血性腸球菌對(duì)小鼠的LD50分析采用t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

腸球菌溶血素的檢出率

對(duì)90株臨床標(biāo)本、40株健康人標(biāo)本的腸球菌同時(shí)進(jìn)行溶血素表型及基因型的檢測(cè),對(duì)其中表型與基因型相符合的116株腸球菌進(jìn)行溶血素檢出率統(tǒng)計(jì),結(jié)果見表1。表1臨床及健康人標(biāo)本來源的腸球菌溶血素檢出率

溶血性、非溶血性腸球菌對(duì)小鼠的LD50

8株溶血性腸球菌的LD50×108cfu/mL,8株非溶血性腸球菌中6株LD50×1010cfu/mL,2株>10×1010cfu/mL。非溶血性腸球菌的LD50比溶血性腸球菌至少高10倍,溶血性腸球菌的毒力比非溶血性腸球菌強(qiáng)。

溶血性、非溶血性腸球菌對(duì)抗生素的敏感性

紙片法檢測(cè)44株溶血性、40株非溶血性腸球菌對(duì)9種抗生素的敏感性。除丁胺卡那、萬古霉素外,溶血性腸球菌對(duì)其他幾種抗生素的耐藥性均高于非溶血性腸球菌,經(jīng)χ2檢驗(yàn),差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表2溶血性腸球菌、非溶血性腸球菌對(duì)抗生素的耐藥率

3討論

腸球菌溶血素的檢測(cè)

腸球菌溶血素表型的檢測(cè)可因紅細(xì)胞來源、紅細(xì)胞新鮮度、紅細(xì)胞濃度、血平板厚度以及培養(yǎng)時(shí)間等因素的影響,結(jié)果差異較大,α、β溶血有時(shí)并不好區(qū)分。為提高溶血素檢出的準(zhǔn)確性,筆者同時(shí)檢測(cè)腸球菌溶血素基因。腸球菌溶血素基因大約7kb,由cylA、B、L、M、I、R等組分組成。其中cylA片段高度保守,因此選用該基因片段進(jìn)行PCR檢測(cè)診斷,發(fā)現(xiàn)部分?jǐn)y帶cylA基因的腸球菌并未出現(xiàn)相應(yīng)的β溶血素表型,提示致病基因可能在某些條件下處于沉默狀態(tài)。Eaton等認(rèn)為這可能是由于基因操縱子部分缺失,或者致病基因只在體內(nèi)環(huán)境表達(dá)[910]。筆者對(duì)腸球菌溶血素同時(shí)進(jìn)行表型及基因型檢測(cè),對(duì)二者相符的菌株進(jìn)行溶血素檢出率統(tǒng)計(jì),提高腸球菌溶血素檢出的準(zhǔn)確性。

溶血性、非溶血性腸球菌的毒力差異

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,臨床標(biāo)本中腸球菌溶血素的檢出率高于健康人群糞便標(biāo)本,說明腸球菌溶血素在臨床感染中起一定作用,具備毒力因子的特征。進(jìn)一步比較溶血性腸球菌與非溶血性腸球菌對(duì)小鼠的LD50,由于腸球菌是正常菌群,毒力較弱,LD50值較高,但是二者對(duì)小鼠LD50有差別,所有溶血性腸球菌的LD50比非溶血性腸球菌至少低10倍,說明溶血素在腸球菌中具有毒力作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明溶血性菌對(duì)抗生素的耐藥率高于非溶血性菌,這也從一定程度體現(xiàn)了腸球菌溶血素的毒力作用。因?yàn)槎玖χ瓿Ｔ诳股氐闹委煭h(huán)境中,承受更大的抗生素選擇壓力,導(dǎo)致耐藥率更高。也有人認(rèn)為腸球菌的溶血素對(duì)細(xì)胞壁的降解作用可使抑制細(xì)胞壁生長(zhǎng)的抗菌素失去作用,引起耐藥[11]。

腸球菌的毒力與耐藥性

溶血性菌株、非溶血性菌株對(duì)丁胺卡那霉素、萬古霉素耐藥率沒有明顯差別,可能原因:有些腸球菌對(duì)磺胺、卡那霉素等抗生素呈現(xiàn)固有耐藥;目前福州地區(qū)腸球菌菌株對(duì)萬古霉素耐藥率還較低,導(dǎo)致統(tǒng)計(jì)學(xué)處理無顯著性。

本研究中腸球菌溶血性菌株的耐藥性比非溶血性溶血菌株嚴(yán)重,這一現(xiàn)