5種大黃蒽醌類衍生物的同時測定及應用

作者：呂慧英，趙晨曦，梁逸曾，吳海

【摘要】目的建立同時測定大黃藥材中5種蒽醌類衍生物含量的方法，優(yōu)化大黃蒽醌的超聲提取工藝。方法采用反相高效液相法，色譜柱：WatersC18柱；流動相：甲醇-乙腈-%磷酸溶液(3∶5∶2)；柱溫：25℃；流速：ml/min；檢測波長：225nm。結(jié)果5種游離蒽醌均具有較寬的線性范圍且呈良好的線性關系，平均回收率為%～%，日內(nèi)精密度為%～%，日間精密度為%～%。結(jié)論該方法成功于大黃活性物質(zhì)的提取工藝優(yōu)化，根據(jù)所建立的方法測得的5種游離蒽醌含量，確定了大黃蒽醌的最佳超聲提取工藝為：以70％乙醇為溶劑、料液比為1∶30(g∶ml)、超聲提取2次、每次提取20min。

【關鍵詞】超聲提??；大黃；RP-HPLC；蒽醌

Abstract：ObjectiveTodevelopamethodforthesimultaneousdeterminationoffiveanthraquinonederivatives(aloe-emodin,rhn,emodin,chrysophanolandphyscion)inrhubarb,andtooptimizetheultrasonicextractiononaWatersC18column(250mm×mm,5μm)wasused.Themobilephasewas%phosphoricacidsolution(3:5:2),ataflowrateofml/min,andthedetectionwavelengthwas225nm.ResultsThelinearrangesofthefivefreeanthraquinoneswerewide,showinggoodlinearcorrelationswithcorrelationcoefficients(R2)oftoTheaveragerecoverieswerefrom%to%.Whiletheintra-dayandinter-dayprecisionwere%～%and%～%,thecontentsoffiveanthraquinonederivativesobtainedbythedevelopedRP-HPLCmethod,theoptimumultrasonicextractionconditionsaredeterminedasfollows:using70%EtOHasextractingsolvent,thesampleisextractedtwotimesandeachtimefor20minbyaultrasonicprocessor,whenthesolidtoliquidratiois1:30(g/ml).

Keywords：Ultrasonicextraction;Rhubarb;RP-HPLC;Anthraquinones

大黃RadixetRhizomaRh為蓼科植物掌葉大黃RheumPalmatumL.，唐古特大黃RheumtanguticumMaxim.exBalf或藥用大黃RheumofficinaleBaill的干燥根和根莖，味苦、性寒。研究證實，大黃具有抗衰老、降血脂、抗腫瘤和抗炎、瀉下作用及抗菌性、止血性等多種生物學活性［1］。其主要有效成分為蒽醌類衍生物,包括蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚以及與葡萄糖結(jié)合成苷。5種蒽醌是大黃以及衍生中藥大黃屬［2］質(zhì)量控制的基礎。

大黃中蒽醌的分離和測定方法有薄層色譜法(TLC)［3］，高速逆流色譜法(HSCCC)［4，5］，膠束電動毛細管色譜法(MEKC)［6］，毛細管區(qū)帶電泳法(CZE)［7］，高效液相色譜法(HPLC)［8］，加壓毛細管電色譜(pCEC)［9］。高效液相色譜正是以其穩(wěn)定、可靠、高效的特點成為中藥研究的最普遍和常用的分析方法。本文建立了同時測定大黃藥材中5種蒽醌衍生物含量的RP-HPLC法，旨在確定大黃蒽醌的最佳超聲提取工藝，同時可應用于大黃藥材及其制劑質(zhì)量的定量評價，為大黃藥材的有效開發(fā)和利用提供依據(jù)。

1儀器與材料

Agilent1100型高效液相色譜儀，上海BRANSONSB2200超聲波發(fā)生器，D1810C型電子分析天平，R-201型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，萬能粉碎機(天津泰斯特儀器有限公司)。

蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚對照品購自中國藥品生物制品檢定所；四川產(chǎn)大黃藥材購于湖南國杏中藥飲片有限責任公司，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學藥學院中藥鑒定教研室鑒定為正品。藥材于40℃干燥、粉碎過40目篩，貯于干燥器中置暗處保存?zhèn)溆?；甲醇、乙腈、磷酸均為江蘇漢邦科技有限公司生產(chǎn)的色譜純，二次蒸餾水，乙醇、醋酸乙酯、石油醚、正己烷等均為北京化工廠生產(chǎn)的分析純試劑。

2方法與結(jié)果

HPLC-DAD分析條件色譜柱為WatersPAHC18色譜柱；柱溫：25℃；進樣量：20μl；流速：ml/min；檢測波長225nm。流動相為甲醇-乙腈-%磷酸溶液(3∶5∶2)。試樣過μm的微孔濾膜后進行HPLC分析。

標準溶液的配制

標準儲備液精密稱取5種對照品適量，加甲醇配制成含蘆薈大黃素，大黃酸，大黃素，大黃酚，大黃素甲醚(75μg/ml)的標準混合儲備液。于4℃下冷藏，備用。

工作標準液臨用前精密吸取適量加甲醇配制成每1ml分別含蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚為，，9，9，μg的工作標準液。

樣品溶液制備稱取g大黃細粉，用15ml溶劑進行超聲提取,抽濾，濾液于40℃下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，后用甲醇溶解定容于10ml容量瓶中，于4℃下冷藏，備用。

方實驗

色譜分離在擬定的色譜條件下，得到蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚及大黃素甲醚的標準色譜(圖1a)以及大黃藥材樣品的色譜圖(圖1b)。由圖1可知，樣品中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚與相鄰組分的分離度,達到基線分離。

線性關系取混合標準儲備液適量，用甲醇稀釋成一系列不同濃度的標準溶液，分別進樣3次，以標準溶液濃度X對峰面積Y進行線性回歸，各組分在各自濃度范圍內(nèi)線性關系良好。結(jié)果見表1。表15種標準品線性范圍，線性方程和回歸系數(shù)

精密度考察精密度分為日內(nèi)精密度和日間精密度。對同一工作標準液在日內(nèi)連續(xù)進樣5次，得日內(nèi)精密度，結(jié)果測得峰面積的RSD為蘆薈大黃素%，大黃酸%，大黃素%，大黃酚%，大黃素甲醚%；在連續(xù)3d內(nèi)分別測定5次得日間精密度，結(jié)果測得峰面積的RSD為蘆薈大黃素%，大黃酸%，大黃素%，大黃酚%，大黃素甲醚%。

重復性考察在上述色譜條件下，對同一批樣品按樣品溶液的制備方法平行制備6份，分別進樣20μl，進樣測定，按外標法測定含量并計算RSD，蘆薈大黃素%，大黃酸%，大黃素%，大黃酚%，大黃素甲醚%。

準確性取已知含量的大黃藥材細粉適量，精密加入對照品適量，振搖，其余按樣品溶液的制備方法，在上述相同色譜條件下分別進樣，按外標法測定其含量,計算加樣回收率和RSD。結(jié)果見表2。表2測定方法回收率結(jié)果

方法的－最適超聲提取工藝的確定稱取g大黃細粉，用50ml溶劑進行超聲提取30min,抽濾，濾液于40℃下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，后用甲醇溶解定容于10ml容量瓶中，于4℃下冷藏，備用。在上述色譜條件下對各提取液進行HPLC分析，測定其中5種游離蒽醌含量。結(jié)果見表3。表3溶劑對游離蒽醌提取率的影響

表3結(jié)果表明，正己烷等低極性溶劑提取大黃游離蒽醌效率低，而甲醇，乙醇提取率高，在水中提取效率很低，且提不出大黃酸，這是因為其在水中溶解性小。大黃游離蒽醌中的蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素在以80%甲醇作為提取溶劑時，提取率最高；大黃酚、大黃素甲醚在以甲醇作為提取溶劑時，提取率最高；游離蒽醌提取效率次高的為70%乙醇。考慮到甲醇有毒，不宜用于食品和藥物的加工，而乙醇從自然得來，成本低等諸因素，我們認為70%乙醇最合適。

以70%乙醇為提取溶劑，其他條件不變，考察不同超聲提取時間對5種游離蒽醌提取率的影響：蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素在20min時提取率最高，大黃酚、大黃素甲醚在40min提取率最高，在20min時次之，綜合考察選擇20min為提取時間。

以同樣的方法，分別考察了不同料液比以及超聲提取次數(shù)對提取效率的影響。結(jié)果顯示，5種大黃游離蒽醌在1∶30料液比時提取效率最高；超聲提取兩次最為合適。

3結(jié)論

本文建立了同時測定大黃藥材中5種蒽醌類衍生物含量的RP-HPLC法，該方法測定5種游離蒽醌的日內(nèi)和日間精密度RSD分別在%～%和%～%之間，準確度高；回收率在%～%之間；具有寬線性范圍和良好的線性關系。所建立的方法應用于大黃活性物質(zhì)的提取工藝優(yōu)化，確定了大黃蒽醌的最佳超聲提取工藝為：以70％乙醇為溶劑、料液比為1∶30(g∶ml)、超聲提取2次、每次提取20min。本實驗為大黃的進一步研究和開發(fā)奠定了良好的基礎。

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