第五章酶分子的化學(xué)修飾

1酶分子化學(xué)修飾——在體外將酶分子通過(guò)人工的方法與一些化學(xué)物質(zhì)，特別是一些有生物相容性的物質(zhì)進(jìn)行共價(jià)連接，從而改變酶的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。這些化學(xué)物質(zhì)稱(chēng)為修飾試劑，酶化學(xué)修飾主要用于基礎(chǔ)酶學(xué)的研究和疾病治療。2酶化學(xué)修飾的應(yīng)用領(lǐng)域在基礎(chǔ)酶學(xué)研究上探測(cè)酶活性必需氨基酸的性質(zhì)和數(shù)目酶蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定酶蛋白的結(jié)構(gòu)變化與運(yùn)動(dòng)酶蛋白部分區(qū)域的構(gòu)象狀態(tài)酶的作用機(jī)理與催化反應(yīng)歷程酶分子的拓?fù)鋵W(xué)以及寡聚酶的亞基結(jié)合狀態(tài)酶的固定化技術(shù)酶純度的分析與檢測(cè)3在疾病治療上—克服酶在體內(nèi)的不穩(wěn)定性—消除或降低酶的抗原性—有助于酶分子到達(dá)并集中于病灶部位在工業(yè)上的應(yīng)用—酶穩(wěn)定性提高，使生產(chǎn)成本降低—反應(yīng)條件的改善和酶壽命的延長(zhǎng)導(dǎo)致生產(chǎn)工藝的技術(shù)革新和改進(jìn)。4——大多數(shù)的化學(xué)修飾的目的在于人為地改變天然酶的某些性質(zhì)，創(chuàng)造天然酶所不具備的某些優(yōu)良特性甚創(chuàng)造出新的活性，擴(kuò)大酶的應(yīng)用范圍。5——酶經(jīng)過(guò)修飾后，會(huì)產(chǎn)生各種各樣的變化，概括起來(lái)有：

—１提高生物活性（包括某些在修

飾后對(duì)效應(yīng)物的反應(yīng)性能改變）

—２增強(qiáng)在不良環(huán)境中的穩(wěn)定性；

—３針對(duì)特異性反應(yīng)降低生物識(shí)別能

力，解除免疫原性；

—４產(chǎn)生新的催化能力。

6主要內(nèi)容第一節(jié)酶分子的化學(xué)修飾方法第二節(jié)酶化學(xué)修飾的基本要求第三節(jié)修飾酶的化學(xué)性質(zhì)7

酶的化學(xué)修飾的基本原理8大家有疑問(wèn)的，可以詢(xún)問(wèn)和交流可以互相討論下，但要小聲點(diǎn)9——大量研究表明，酶分子表面外形的不規(guī)則、各原子間極性和電荷的不同、各氨基酸殘基間相互作用等使酶分子結(jié)構(gòu)的局部形成了一種包含了酶活性部位的微環(huán)境，不管這種微環(huán)境是極性的還是非極性的，都直接影響到酶活性部位氨基酸殘基的電離狀態(tài)，并為活性部位發(fā)揮催化作用提供合適的條件。10——但天然酶分子中的這種微環(huán)境是可以通過(guò)人為的方法進(jìn)行適當(dāng)?shù)母脑欤ㄟ^(guò)對(duì)酶分子的側(cè)鏈基團(tuán)、酶分子的功能基團(tuán)等進(jìn)行化學(xué)修飾或改造，就可以獲得結(jié)構(gòu)或性能更合理的修飾酶。11——酶經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾后，除了能減少由于內(nèi)部平衡力被破壞而引起的酶分子伸展打開(kāi)外，還可能會(huì)在酶分子的表面形成一層“緩沖外殼”，能在一定程度上抵御外界環(huán)境的電荷、極性等變化對(duì)酶分子的影響，進(jìn)而維持酶活性部位微環(huán)境的相對(duì)穩(wěn)定，使酶分子能在更廣泛的條件下發(fā)揮作用。12——酶化學(xué)修飾的基本原則都是充分利用化學(xué)修飾劑所具有的各類(lèi)化學(xué)基團(tuán)的特性，或直接或間接地經(jīng)過(guò)一定的活化過(guò)程與酶分子中的某種氨基酸殘基（通常選擇非酶活必需基團(tuán)）產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)，從而對(duì)酶分子的結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造。13——在酶的化學(xué)修飾過(guò)程中需要涉及被修飾酶、修飾劑的性質(zhì)以及修飾反應(yīng)條件的選擇。14一般在開(kāi)始設(shè)計(jì)酶化學(xué)修飾反應(yīng)時(shí)須對(duì)被修飾酶的活性部位、穩(wěn)定條件、側(cè)鏈基團(tuán)性質(zhì)等應(yīng)盡可能全面掌握。

在此基礎(chǔ)上選擇合適的化學(xué)修飾劑進(jìn)行化學(xué)修飾，在選擇化學(xué)修飾劑時(shí)，除了需要考慮修飾劑的種類(lèi)、修飾劑上的反應(yīng)基團(tuán)的數(shù)目和位置以及修飾劑上反應(yīng)基團(tuán)的活化方法和條件以外，還需要考慮修飾劑的分子量等其它可能會(huì)影響修飾反應(yīng)的因素。15值得注意的是酶的修飾反應(yīng)一般總是盡可能在酶穩(wěn)定的條件下進(jìn)行，需要盡可能少破壞酶活性功能的必需基團(tuán)，以提高酶和修飾劑的結(jié)合率和酶活回收率。16酶的化學(xué)修飾反應(yīng)條件主要包括

——體系中酶與修飾劑的分子比例、

——反應(yīng)體系（包括溶劑性質(zhì)、鹽濃

度以及pH等）

——反應(yīng)溫度和時(shí)間等

一般來(lái)說(shuō)，修飾反應(yīng)條件隨酶的性質(zhì)、修飾劑的種類(lèi)、修飾反應(yīng)的類(lèi)型等的不同而不同，一個(gè)合適的修飾反應(yīng)需要由大量的實(shí)驗(yàn)來(lái)予以確定。17第一節(jié)酶分子的化學(xué)修飾方法18酶分子的化學(xué)修飾方法

——酶的表面修飾

——酶分子的內(nèi)部修飾

——與輔因子相關(guān)的修飾

——金屬酶的金屬取代19酶的表面修飾

——化學(xué)固定化

——酶的小分子修飾作用

——酶的大分子修飾作用

——大分子非共價(jià)修飾

——大分子共價(jià)修飾

——分子內(nèi)交聯(lián)

——分子間交聯(lián)

——脂質(zhì)體包埋

——反相膠團(tuán)微囊化：20酶的表面修飾（一）化學(xué)固定化

——一般是直接通過(guò)酶表面的氨基酸殘基將酶分子共價(jià)連接到惰性載體上；由于載體的引入，使酶所處的微環(huán)境發(fā)生改變，進(jìn)而改變了酶的性質(zhì)，特別是動(dòng)力學(xué)性質(zhì)發(fā)生了改變。21（二）酶的小分子修飾作用

——主要是利用一些小分子修飾試劑，通過(guò)共價(jià)結(jié)合來(lái)修飾酶的一些基團(tuán)（如-COO-、-NH3+、-SH、-OH、咪唑基等），提高酶的穩(wěn)定性。常用的小分子修飾試劑有乙基、糖基和甲基等。酶的表面修飾22（三）酶的大分子修飾作用

——非共價(jià)修飾

——共價(jià)修飾23大分子非共價(jià)修飾

——利用一些大分子試劑通過(guò)與酶非共價(jià)相互作用，對(duì)酶進(jìn)行有效的保護(hù)

——例如聚乙二醇、右旋糖苷等通過(guò)氫鍵固定于酶分子的表面，同時(shí)又有效地與外部水相連，從而保護(hù)酶的活力；一些多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能通過(guò)調(diào)節(jié)酶的微環(huán)境來(lái)保護(hù)酶活力；另外一些蛋白質(zhì)可以通過(guò)相互作用，排除分子表面的水分子，降低介電常數(shù)，使酶的穩(wěn)定性增加。24大分子共價(jià)修飾：

——利用一些可溶性大分子，通過(guò)共價(jià)鍵連接于酶分子的表面，形成一層覆蓋層，形成的可溶性酶具有許多有用的性質(zhì)。例如用聚乙二醇共價(jià)修飾超氧化物歧化酶（SOD），不僅可以降低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延長(zhǎng)了半衰期，從而提高了藥效。25（四）分子內(nèi)交聯(lián)

——增加酶分子表面的交聯(lián)鍵數(shù)目是提高酶穩(wěn)定性的有效方法之一，例如胰凝乳蛋白酶上的羧基經(jīng)過(guò)羰二亞胺活化后，可以與一系列二胺發(fā)生作用，使酶的穩(wěn)定性得到改善。26（五）分子間交聯(lián)—利用一些雙功能或多功能試劑將不同的酶交聯(lián)在一起形成雜化酶。例如用戊二醛把胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶交聯(lián)在一起，可以降低胰凝乳蛋白酶的自溶性；將胰蛋白酶與堿性磷酸脂酶交聯(lián)形成的雜化酶可作為部分代謝途徑的模型。27（六）脂質(zhì)體包埋

——一些醫(yī)藥用酶，如SOD、溶菌酶等，由于分子量較大，不易進(jìn)入人體細(xì)胞內(nèi)，而且在體內(nèi)半衰期短，產(chǎn)生免疫原性反應(yīng)；用脂質(zhì)體包埋法紀(jì)可解決這些問(wèn)題。脂質(zhì)體是天然脂類(lèi)或類(lèi)固醇組成的微球體，酶分子包埋在其內(nèi)部，可以通過(guò)與細(xì)胞膜的融合或內(nèi)吞作用而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。28（七）反相膠團(tuán)微囊化—近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的酶在有劑相中進(jìn)行催化的技術(shù)，反相膠團(tuán)中酶的穩(wěn)定性大大提高。—一些表面活性劑溶解在非極性有機(jī)溶劑中時(shí)可自發(fā)地形成近似球狀的反相膠團(tuán)，反相膠團(tuán)是表面活性劑的疏水尾部朝外而極性頭部朝內(nèi)的微膠團(tuán)，其內(nèi)部可容納一定量的水，酶溶解在其中避免變性。29

加H2O

疏水尾部

親水頭部

加酶液

SPEEE

圖：反相膠團(tuán)的結(jié)構(gòu)和酶的分布30——酶分子的內(nèi)部修飾

—非催化活性基團(tuán)的修飾

—酶蛋白主鏈的修飾

—催化活性基團(tuán)的修飾

—肽鏈伸展后的修飾31（一）非催化活性基團(tuán)的修飾

——通過(guò)對(duì)非催化殘基的修飾可以改變酶的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，改變酶對(duì)特殊底物的親和力；通?？杀恍揎椀陌被釟埢瓤梢允怯H核的，也可以是親電子的，還可以是可氧化殘基。32（二）酶蛋白主鏈的修飾

——主要是靠酶法進(jìn)行修飾，用蛋白酶對(duì)主聯(lián)進(jìn)行部分水解，可以改變酶的催化特性。33（三）催化活性基團(tuán)的修飾

——通過(guò)選擇性修飾催化活性氨基酸的側(cè)鏈來(lái)實(shí)現(xiàn)氨基酸殘基的取代，使一種氨基酸側(cè)鏈轉(zhuǎn)化為另一種氨基酸側(cè)鏈，這種方法又稱(chēng)為化學(xué)突變法。34（四）肽鏈伸展后的修飾

——酶蛋白經(jīng)過(guò)脲、鹽酸胍處理，使肽鏈充分伸展，對(duì)酶分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)進(jìn)行修飾，然后在適當(dāng)條件下，重新進(jìn)行折疊。35三、與輔因子相關(guān)的修飾

對(duì)依賴(lài)輔因子的酶可用兩種方法進(jìn)行修飾：

——如果輔因子與酶是非共價(jià)結(jié)合的

,可以將輔因子共價(jià)結(jié)合于酶分

子上；

——引入新的具有更強(qiáng)反應(yīng)的輔因子36四、金屬酶的金屬取代

——酶分子中的金屬離子可以被其他金屬離子取代，可以改變酶的專(zhuān)一性、穩(wěn)定性等。37第二節(jié)酶化學(xué)修飾的基本要求一、被修飾酶的性質(zhì)（一）酶的穩(wěn)定性：（二）酶活性中心的狀況：（三）酶?jìng)?cè)鏈基團(tuán)的性質(zhì)與反應(yīng)性二、修飾反應(yīng)的條件：（一）pH與離子強(qiáng)度（二）修飾反應(yīng)的溫度與時(shí)間（三）反應(yīng)體系中酶與修飾劑的比例38一、被修飾酶的性質(zhì)（一）酶的穩(wěn)定性—包括熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性，作用溫度以及pH，酶蛋白解離時(shí)的電化學(xué)性質(zhì)，抑制劑的性質(zhì)等。（二）酶活性中心的狀況—包括酶分子活性中心的組成，如參與活性中心的氨基酸殘基、輔因子等。酶分子的形狀、大小以及寡聚酶的亞基組成。39（三）酶?jìng)?cè)鏈基團(tuán)的性質(zhì)與反應(yīng)性1、對(duì)巰基的化學(xué)修飾：—常用的修飾試劑有烷化劑、汞試劑和Ellman試劑等。2、氨基的化學(xué)修飾：—常用的修飾試劑有乙酸酐、2，4，6-三硝基苯磺酸、2，4-二硝基氟苯、烷基化試劑、丹磺酰氯(DNS)和苯異硫氰酸酯（PITC)等。3、羧基的化學(xué)修飾：—水溶性羰二亞胺或氨化反應(yīng)、硼氟化三甲鋅鹽反應(yīng)、甲醇-鹽酸酯化反應(yīng)等。4、咪唑基的修飾反應(yīng)：—焦碳酸二乙酯反應(yīng)、碘代反應(yīng)、碘化反應(yīng)等。405、吲哚基的化學(xué)修飾：—2-羥基-5-硝基芐溴、光敏試劑、4-硝基苯硫氯等。6、甲硫氨酸側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾：—H2O2、光敏試劑、碘代乙酰胺等7、二硫鍵的化學(xué)修飾：—2-巰基乙醇、二硫蘇糖醇、過(guò)甲酸等。8、酚基的化學(xué)修飾：—N-乙酰咪唑、碘化反應(yīng)、四硝基甲烷、偶氮化試劑、二異丙基氟磷酸。9、胍基的化學(xué)修飾：—丁二酮、1，2-環(huán)己二酮、苯乙二醛等。41二、修飾反應(yīng)的條件

——修飾反應(yīng)應(yīng)盡量在酶穩(wěn)定條件下進(jìn)行，并盡量不破壞酶活性必需基團(tuán)，修飾率高，活力回收要高42（一）pH與離子強(qiáng)度：

——pH決定了酶分子中反應(yīng)基團(tuán)的解離狀態(tài)，酶的解離狀態(tài)不同，其反應(yīng)性能也不同；另一方面，有些修飾試劑在不同pH下，與同一種基團(tuán)反應(yīng)可以形成不同的產(chǎn)物。離子強(qiáng)度對(duì)修飾反應(yīng)也有重要影響。43（二）修飾反應(yīng)的溫度與時(shí)間

——嚴(yán)格控制反應(yīng)溫度和時(shí)間可以減少或消除一些非專(zhuān)一性的修飾反應(yīng)。44（三）反應(yīng)體系中酶與修飾劑的比例

——酶與修飾試劑的比例可以控制酶分子的修飾程度。45第三節(jié)修飾酶的性質(zhì)

迄今，已有100多種蛋白質(zhì)（其中許多是酶）被修飾后在很多領(lǐng)域中顯出許多優(yōu)良特性。46修飾酶的性質(zhì)改變主要表現(xiàn)為

——穩(wěn)定性提高

——體內(nèi)半衰期延長(zhǎng)

——免疫原性和毒性降低或消除

——膜滲透性提高

——在體內(nèi)的生物分布與代謝行

為和藥用酶的療效得以改善

——在有機(jī)溶劑中的溶解度

——耐有機(jī)溶劑變性的能力提高等

47例：

大腸桿菌L-天冬酰胺酶作為治療淋巴性白血病、惡性淋巴腫瘤的酶制劑已在國(guó)外應(yīng)用于臨床，并且是治療急性淋巴性白血病治療指數(shù)最高的藥物。48缺點(diǎn)：

由于它來(lái)源于微生物，對(duì)人而言是一種外源性蛋白，有較強(qiáng)的免疫原性，臨床上常見(jiàn)進(jìn)行性免疫反應(yīng)和全身性過(guò)敏反應(yīng)，而限制了其臨床應(yīng)用。49改進(jìn)方法

——利用聚乙二醇修飾后的天冬酰胺酶不僅可降低或消除酶的抗原性，而且可以提高酶的抗蛋白水解的能力，延長(zhǎng)酶在體內(nèi)半衰期，提高藥效。50結(jié)果

美國(guó)FDA正式批準(zhǔn)的用于治療急性淋巴細(xì)胞白血病的培門(mén)冬酶（Pegaspargase,商品名為Oncaspar）即為L(zhǎng)-天冬酰胺酶的聚乙二醇螯合物，該產(chǎn)品已于1994年首先在美國(guó)上市。51①熱穩(wěn)定性——一般來(lái)說(shuō)，經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾的酶，熱穩(wěn)定性有較大的提高?！饕怯捎谛揎椩噭┑亩鄠€(gè)功能基團(tuán)與酶分子的多個(gè)功能基團(tuán)相互交聯(lián)增加了酶分子構(gòu)象的穩(wěn)定性。52天然酶和修飾酶的熱穩(wěn)定性比較

酶

修飾劑

修飾酶

天然酶

處理?xiàng)l件(℃/時(shí)間)

殘留酶活(%)腺苷脫氫酶

胰蛋白酶

過(guò)氧化氫酶

溶菌酶

尿激酶糜蛋白酶

右旋糖苷

右旋糖苷

右旋糖苷

右旋糖苷

人血清白蛋白

肝素37/100min100/30min50/10min100/30min37/48h37/24h70100466440902099800955053②體內(nèi)半衰期

——經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾后很多酶的抗蛋白水解酶、抗抑制劑和抗失活因子的能力以及對(duì)熱穩(wěn)定性都有增加和提高，也就相應(yīng)提高了酶在生物體內(nèi)的半衰期，這一點(diǎn)對(duì)提高藥用酶的療效至關(guān)重要。54天然酶與修飾酶在生物體內(nèi)半衰期的比較55③修飾酶的抗原性

——由于酶分子結(jié)構(gòu)上除了有蛋白水解酶的作用位點(diǎn)（蛋白水解酶“切點(diǎn)”）外，還有一些可以組成抗原決定簇的氨基酸殘基，當(dāng)酶作為異源蛋白進(jìn)入機(jī)體后就會(huì)誘發(fā)產(chǎn)生抗體，產(chǎn)生抗體與抗原之間的反應(yīng)，這一反應(yīng)不但能使酶失活，而且還會(huì)對(duì)機(jī)體造成嚴(yán)重的傷害，甚至?xí)＜鄙?6解決的方法

——有抗原性的天然酶可以通過(guò)化學(xué)修飾使酶分子中的一些組成抗原決定簇的基團(tuán)與修飾劑之間通過(guò)共價(jià)鍵相互結(jié)合，從而破壞了酶分子中抗原決定簇的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而使天然酶的抗原性降低，甚至完全消除。57原理

——大分子的修飾劑還有可能起到“遮蓋”天然酶上的抗原決定簇以阻礙抗原與抗體之間的結(jié)合反應(yīng)。58通過(guò)化學(xué)修飾后修飾酶的抗原性變化59

值得指出的是，并不是所有的修飾劑都能在對(duì)酶進(jìn)行修飾后就消除或降低天然酶的抗原性，有些修飾劑在降低和消除天然酶的抗原性上并沒(méi)有作用。60

例如，包括右旋糖酐在內(nèi)的多糖類(lèi)物質(zhì)就不容易消除或降低天然酶的抗原性。61

目前比較公認(rèn)的在消除或降低天然酶抗原性的修飾劑主要有PEG和人血清白蛋白。62④最適pH

——部分酶經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾后，其催化的最適pH會(huì)發(fā)生變化，修飾酶的最適pH與天然酶的最適pH相比往往不同，且有些酶的最適pH會(huì)有一定的范圍，更適合于酶的應(yīng)用，尤其是在生理或臨床應(yīng)用上有較大的意義。

63天然酶與修飾酶的最適pH酶修飾酶天然酶修飾劑糜蛋白酶豬肝尿酸酶吲哚-3-鏈烷羥化酶豬肝尿酸酶產(chǎn)朊假絲酵母尿酸酶白蛋白PEGPEG