培養(yǎng)基的制備實驗二培養(yǎng)基的制備一、 目的要求掌握一般培養(yǎng)基制備的原則和要求。熟悉一般培養(yǎng)基制備的過程。二、 實驗器材藥品或試劑：1mol/LNaOH,1mol/LHCl;蛋白腺0.2、牛肉膏0.6、瓊脂，氯化鈉1,蒸餾水200。儀器或其他用具：試管，三角瓶，燒杯，量筒，玻璃棒，培養(yǎng)基分裝器，天平，藥匙，高壓蒸氣滅菌鍋，pH測定儀或pH試紙(pH5.5?9.0)，棉花，濾紙，記號筆，麻繩，紗布等。實驗方法：1稱量：準確稱量所需藥品或試劑2溶解：將以上成分加溫溶于蒸餾水中3調節(jié)PH:用酸度計測定溶液PH并用1mol/LNaOH,1mol/LHCl調節(jié)PH7.4?7.64過濾：用濾紙過濾后取出50ML進行封裝，每支試管裝入5ML5加塞：塞好棉塞用紙包好，準備滅菌6滅菌：培養(yǎng)基的滅菌，高壓蒸汽滅菌，一般采用15磅/平方(即1.05kg/cm2)壓力，此時的溫度是121.3°C。滅菌20?30分鐘后。7無菌檢驗：將滅菌的培養(yǎng)基放入37C的恒溫箱中培養(yǎng)24?48h,以檢查滅菌是否徹底。二)普通瓊脂培養(yǎng)基1將以上過濾封裝后剩余的溶液加瓊脂溶解，補足水分2分裝于中三角瓶中。3加塞4高壓滅菌20?30分鐘后，制平板。5無菌檢驗將滅菌的培養(yǎng)基放入371的恒溫箱中培養(yǎng)24?48h，以檢查滅菌是否徹底。保存?zhèn)溆?。思考題培養(yǎng)基配好后，為什么必須立即滅菌？如何檢查滅菌后的培養(yǎng)基是無菌的？在配制培養(yǎng)基的操作過程中應注意些什么問題？管口、瓶口為什么要用棉塞？能否用橡皮塞代替？為什么？實驗三理化因素對微生物的影響一、 目的要求掌握對微生物影響的因素熟悉溫度、紫外線對微生物的影響二、 實驗器材普通肉湯培養(yǎng)基、普通瓊脂培養(yǎng)基大腸桿菌、金黃色葡萄球菌儀器或其他用具：超凈工作臺，培養(yǎng)箱、接種環(huán)，鑷子，酒精燈、吸管、試管，記號筆等。三、 方法紫外線殺菌試驗用接種環(huán)沾取大腸桿菌在瓊脂平板培養(yǎng)基表面來回密密涂滿整個平板。打開平板蓋，蓋上中空紙片，使其半暴露于紫外線燈下20-30cm處，照射30分鐘，取出紙片，蓋上蓋，置37^溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h,觀察平板表面細菌生長的情況。溫度試驗用接種環(huán)沾取大腸桿菌分別接種于4支裝有普通肉湯培養(yǎng)基的試管中，1支作為對照，1支不接入任何菌也作為對照，其余3支置于80^水浴鍋中，分別放置5分、10分、20分鐘，取出后，置37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，觀察細菌生長的情況。實驗四自然界中微生物的分布一、 實驗目的認識微生物在自然界存在的普遍性了解細菌在自然界和人體的分布情況二、 實驗器材普通瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱，接種環(huán)，鑷子，酒精燈、吸管、試管，記號筆等。三、方法1、 空氣中細菌的檢查（采用沉降法）取無菌普通平板1只，置一處，啟蓋10分，再蓋上蓋,"C培養(yǎng)24h，取出觀察有無細菌生長。2、 咽喉部細菌檢查用無菌方法，向普通平板里吹氣2-3次，371培養(yǎng)24h后觀察結果。觀察有無細菌生長。3、 皮膚表面細菌的檢查（采用涂抹法）在普通培養(yǎng)基上分區(qū)后，直接用手指在無菌平板表面輕輕涂按1處，之后用自來水洗手指在平板表面2處輕輕涂按，371培養(yǎng)24h后，取出觀察有無細菌生長。實驗五細菌分離技術一、 實驗目的掌握微生物的分離與接種技術學會用平板劃線法分離微生物二、 實驗器材樣品；MRS分離培養(yǎng)基;乳酸菌，大腸桿菌培養(yǎng)箱，搖床0.9%，接種環(huán)，記號筆，酒精燈，試管架，無菌生理鹽水等五、實驗步驟采樣:無菌采集樣品，要有針對性分離：用乳酸菌分離培養(yǎng)基（MRS）采用劃線法進行培養(yǎng)：平板倒置于37°C培養(yǎng)箱24h?48h，觀察菌落特征制備純培養(yǎng)：將培養(yǎng)后單個菌落釣出，劃線與平板上，37C培養(yǎng)48小時檢查菌落是否單純，也可用顯微鏡檢查是否是純的微生物2）釋液傾注平皿稱取樣1.0g，放入盛99mL無菌水并帶有玻璃珠的三角瓶中，振蕩使樣品均勻分散成為懸液（10-2）。用1mL的無菌吸頭從中吸取0.5ml樣品懸液，注入分裝有4.5ml無菌水的試管中，吹吸3次，振蕩均勻(10-3)。同樣方法，配置成稀釋度為10-4，10-5，10-6的樣品溶液，各樣取ImL加在平皿中，傾注培養(yǎng)基.(3)涂布用一支新的無菌吸頭，分別由各濃度樣品稀釋液中各吸取100ul,對號較均勻地放入已寫好稀釋度的牛肉蛋白胨培養(yǎng)基平板上，用無菌玻璃涂棒涂勻。每個濃度做2個平板4.制備純培養(yǎng)：將培養(yǎng)后單個菌落釣出，劃線與平板上，371培養(yǎng)48小時檢查菌落是否單純，也可用顯微鏡檢查是否是純的微生物細菌的生理生化反應一、 實驗目的了解細菌生理生化反應原理掌握細菌鑒定中常用的生理生化反應的測定方法二、 實驗器材37°C恒溫培養(yǎng)箱、接種環(huán)、酒精燈、試管架、記號筆等待測菌甲基紅試劑、V.P試劑、吲噪試劑。培養(yǎng)基：糖發(fā)酵培養(yǎng)基，用于糖類發(fā)酵試驗葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基，用于甲基紅和V.P試驗蛋白胨水培養(yǎng)基，用于吲噪試驗檸檬酸鐵銨或醋酸鉛的半固體培養(yǎng)基，用于硫化氫試驗檸檬酸鈉培養(yǎng)基，用于檸檬酸鹽利用試驗三、 實驗方法方法(1)編號在各試管上分別標明各種糖名稱，所接種的菌名和組號，下同。(2)接種（3）培養(yǎng)將已接種好的培養(yǎng)基置"C溫箱中培養(yǎng)24h。（4）觀察結果2甲基紅（Methylred）試驗（簡稱MR試驗）某些細菌分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸再被分解，產(chǎn)生甲酸、乙酸、乳酸等，使培養(yǎng)基的pH降低到4.2以下，這時若加甲基紅指示劑呈現(xiàn)紅色。因甲基紅指示劑變色范圍是pH4.4（紅色）?pH6.2（黃色）方法將待檢菌分別接種到葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中，371培養(yǎng)48h,加甲基紅指示劑數(shù)滴，觀察結果，呈現(xiàn)紅色者為陽性，呈現(xiàn)黃色者為陰性3伏一普二氏試驗（V.P.試驗某些細菌分解葡萄糖為丙酮酸，丙酮酸再被分解，變?yōu)橐阴＜谆状?；乙酰甲基甲醇，其在堿性條件下氧化成為二乙酰，二乙酰和蛋白胨中精氨酸胍基起作用產(chǎn)生粉紅色的化合物，此為VP試驗4靛基質（吲噪）試驗某些細菌能分解蛋白質中的色氨酸，產(chǎn)生靛基質（吲噪），靛基質與對二甲基氨基苯甲醛結合，形成玫瑰色靛基質（紅色化合物）方法：將被檢菌接種到胰蛋白胨水培養(yǎng)基中，371培養(yǎng)24h?48h后，沿試管壁滴加數(shù)滴吲噪試劑于培養(yǎng)物液面，觀察結果結果：出現(xiàn)紅色者為陽性出現(xiàn)黃色者為陰性。硫化氫試驗某些細菌能分解含硫的氨基酸（胱氨酸、半胱氨酸等），產(chǎn)生硫化氫，硫化氫與培養(yǎng)基中的鉛鹽或鐵鹽，形成黑色沉淀硫化鉛或硫化鐵，為硫化氫試驗陽性，可借以鑒別細菌方