HeatShockProteinsandDiseasesDept.ofPathophysiology,XiangyaSchoolofMedicine,CSUKangkaiWang09-026-2012CHANGSHAContentsI.IntroductionofHSPs

1.DefinitionofHSPs2.Characteristic3.Classficationanddistributionwithincell4.Functions5.Regulationofexpression

II.HSPsandheartdisease

III.HSPsandatherosclerosis

IV.HSPsandinflammation

V.HSPsandtumor

VI.HSPsandaging

VII.Perspectiveontranslationmedicine

1、對環(huán)境變化做出反應是生物細胞的基本特征及生存的必要條件。2、生物細胞在高溫環(huán)境下所表現的以基因表達變化為特征的反應稱熱休克反應（heatshockresponse,HSR），所產生的一組蛋白質叫熱休克蛋白（heatshockprotein,HSP）。3、除了熱休克外，許多其它理化及生物刺激都可誘導HSP的產生，故HSP又稱為應激蛋白（stressprotein,SP）。

一、基本概念Ritossa’spuffs,19621、廣泛存在2、結構保守3、在細胞正常生命活動中發(fā)揮重要作用4、應激狀態(tài)下表達增多，發(fā)揮細胞保護作用

二、HSP的特點

三、HSP的分類及細胞內分布

主要HSP家族成員

分子量細胞內定位可能的生物學功能HSP110亞家族～110000

HSP110

核仁,胞漿熱耐受,交叉耐受HSP105

胞漿蛋白質折疊HSP90亞家族～90000

HSP90α(HSP86)

胞漿與類固醇激素受體結合,熱耐受HSP90β(HSP84)

胞漿與類固醇激素受體結合,熱耐受Grp94

內質網分泌蛋白質的折疊HSP70亞家族～70000

HSC70(組成型)

胞漿蛋白質折疊及移位HSP70(誘導型)

胞漿,核蛋白質折疊,細胞保護作用HSP75

線粒體蛋白質折疊及移位GRP78(Bip)

內質網新生蛋白質折疊HSP60亞家族～60000

HSP60

線粒體蛋白質的折疊TriC

胞漿蛋白質的折疊

HSP47～47000

內質網膠原合成的質量控制HSP40(hdj-1)

胞漿蛋白質折疊小分子HSP亞家族20000～30000

HSP32(HO-1)

胞漿HSP27

胞漿,核肌動蛋白的動力學變化

αB-晶狀體蛋白

胞漿細胞骨架的穩(wěn)定HSP10～10000線粒體為HSP60的輔因子

泛素(ubiquitin)～8000胞漿,核蛋白質的非溶酶體降解四、HSP的功能—分子伴侶（molecularchaperone）

1、幫助新合成蛋白質的折疊，防止其互相聚集2、幫助蛋白質的細胞內移位3、幫助變性蛋白質的復性4、清除嚴重受損的蛋白質SubstrateloadingcomplexfortheHSP90system[HSP90(orange),HSP70(lightorange),HSP40(yellow),HOP(blue),andclientsubstrate(red)

泛素-蛋白酶體通路（ubiquitin-proteasomepathway）

泛素為分子量～8kd的HSP，促進異常蛋白質在蛋白酶體中降解。包括：不完全的蛋白質，誤折疊的蛋白質（由于基因突變等），變性的蛋白質，多亞基復合物的游離亞基，不能結合輔因子的蛋白質，氧化損傷的蛋白質，不能在ER中折疊的膜蛋白或分泌蛋白，錯誤導向的蛋白質。

正常蛋白質氧化應激羰基化蛋白質蛋白質混合二硫化物(PrSSG)

變性蛋白質

泛素化堆積、聚集

蛋白酶體多肽碎片，氨基酸細胞凋亡五、HSP表達的調控

1、組成型表達(constitutiveexpression):涉及HSP基因5’端調控區(qū)的普通啟動子及組織特異性啟動子等，其調控機制至今仍不十分清楚。2、誘導表達(inducibleexpression):主要通過熱休克因子（HSF）調控。

一）、轉錄水平調控3、HSF家族

酵母——HSF（為存活所必須）果蠅——HSF（與存活及生長無關，但為卵細胞發(fā)生及幼蟲發(fā)育所必須）雞——HSF1~3

小鼠——HSF1～2,HSF4

人——HSF1～2，HSF4

脊椎動物HSF家族的主要功能

HSF1——調控HSR，受精卵早期發(fā)育、胎盤發(fā)育等

HSF2——胚胎發(fā)育?HSF3——僅在禽類發(fā)現，與HSF1有協(xié)同作用

HSF4——(4a,4b)功能不明，與白內障的發(fā)生密切相關Growthretrdation;FemaleinfertilityHSF1-/-二）、轉錄后水平調控1、mRNA穩(wěn)定性Protein-RNAinteraction:nucleolinRNAbindingelement:(T/G)CCCG(A/G)withinthe5’or3’

UTRortheORFregionofthetargetgenes.AA1-309AA310-713MethodsforDetectingtheexpressionoftargetgenesandtheinteractionbetweennucleolinandmRNA:AfterinhibitionoftranscriptionwithactinomycinDWesternblotRT-PCRORrealtimePCRInteractionassayRNA-EMSARNA-IPandRT-PCRReportergeneanalysisSanguptaTK:JBC,2004,

279(12):10855-63RNA-EMSARNA-IPandIBCancio-LonchesC:JVirol.2011;85(16):8056–8068.GenesC23-bindingsequenceSitesHsp70(U/G)CCCG(A/G)5’－UTR及3'－UTRBcl-2(U/G)CCCG(A/G)5’－UTR及3'－UTRHsp32(HOX1)(U/G)CCCG(A/G)5’－UTR及3'－UTRHsf1GCCCGG編碼區(qū)Bmp4(U/G)CCCG(A/G)3'－UTRHSP90(U/G)CCCG(A/G)5’－UTR及編碼區(qū)COX-2GCCCGG編碼區(qū)及3'－UTRNAIP/BIRC1GCCCGG3'－UTRMCL1GCCCGG/GCCCGA編碼區(qū)BioinformaticsanalysisforthegenescontainingthenucleolinbindingmotifwithinthemRNAmoleculesNucleolin與HSP70

mRNA

3’-UTR直接結合，增加其穩(wěn)定性RNA-RNAinteraction:microRNA2、mRNA翻譯受抑microRNA完全互補

植物miRNA部分哺乳類miRNA

不完全互補

哺乳類miRNA

Western

Blot，RT-PCRWestern

BlotmicroRNA

increasesexpressionoftargetgenesChangY,CirculationRes.2009,104(5):572-5.3、翻譯后修飾磷酸化泛素化Ischemia30’/Reperfusion24hareaatrisk(AAR);

infarct-to-riskregionratioQianJ.CircRes.2009;105(12):1223-31nucleolinmicroRNAExpressionofHSPsmRNAstabilityTranslationrepressiontranscriptionPhosphorylationUbiquitinationHSFmRNAstabilityProteinstabilityandactivationstatusSummaryonregulationofHSPsexpressionContentsI.IntroductionofHSPs1.DefinitionofHSPs2.Characteristic3.Classficationanddistributionwithincell4.Functions5.Regulationofexpression

II.HSPsandheartdisease

III.HSPsandatherosclerosis

IV.HSPsandinflammation

V.HSPsandtumor

VI.HSPsandaging

熱休克蛋白與心臟疾病細胞保護心肌保護：外源性保護內源性保護：缺血預適應熱休克蛋白心肌內源性保護概念的提出：

1986，Murry發(fā)現缺血預適應（ischemicpreconditioning）；

1988，Currie發(fā)現經熱休克預處理后，大鼠心肌缺血-再灌注損傷減輕。

改變HSP70水平的方法心肌損傷模型保護作用參考文獻熱休克大鼠離體心I/R超微結構,心功能,酶釋放CurrieRW,1988心肌缺血,熱休克大鼠在體心I/R心肌力學,梗塞面積DonnellyTJ,1992基因轉染小鼠心肌細胞,缺氧細胞膜損傷,酶釋放WilliamsRS,1993基因轉染H9C2細胞,缺氧細胞存活率,LDH釋放MestrilR,1994轉基因小鼠離體心I/R心肌力學,PlumierJC,1995

能量代謝RadfordNB,1996

梗塞面積HatterJJ,1996基因轉染(HSC70)H9C2,氧化應激膜脂質過氧化,酶釋放ChongKY,1998腺病毒心肌內注射家兔在體心I/R梗塞面積OkuboS,2001病毒脂質體,冠脈內大鼠離體心I/R心肌力學,酶釋放JayakumarJ,2000

凋亡SuzukiK,2000HSP70的心肌保護作用研究

HSP70對H2O2

所致心肌細胞核仁損傷的保護作用HSR+H2O2CtrlHSRFig2-7.EffectsofHSRonnucleolarsegregationinducedbyoxidativestress(10×20).H2O2CtrlH2O23hHSR+H2O23hHSRFig2-11.EffectofHSRonthenucleolarsegregationinHSF1+/+MEFs.Fig2-12.EffectofHSRonthenucleolarsegregationinHSF1-/-MEFs.CtrlHSRH2O23hHSR+

H2O23hpcDNA3.1-HSP70WT,HSP70ΔNLS

pEGFP-HSP70WT,HSP70ΔNLS

pcDNA3.1(-)HSP70WTCtrlH2O23hHSP70ΔNLSHSP70inhibitedH2O2–mediatednucleolarsegregationinC2C12cellsCtrlH2O2HSP70WT

HSP70ΔNLS

B

D

A

C

FluorescentmicroscopyshowingtheintracellulardistributionofHSP70WTandHSP70ΔNLSHSP60/HSP10：

1、H9C2細胞→腺病毒介導HSP60/HSP10基因轉染→缺氧→酶釋放↓，存活率↑（必須兩者同時轉染才有效）（LauSetal,1997)2、腺病毒介導基因轉染→新生大鼠心肌細胞HSP60/HSP10過表達→缺氧-再給氧→保護作用壞死↓(酶釋放↓)

凋亡↓(CytC釋放↓,Caspase-3↓,DNA降解↓)

（LinKMetal,2001）HSP32(hemeoxygenase-1,HO-1)

血紅素氧合酶是催化血紅素分解成膽綠素、膽紅素及CO的限速酶?；?’調控區(qū)含HSE，受HSF調控，在氧化應激時誘導表達。

COIronNADP

HO-1

HemeBiliverdin（膽綠素）

Biliverdin

reductase

NADPHNADHO2NADPHBilirubin（膽紅素）NADPNAD1、大鼠心臟→缺血-再灌HSP32表達↑

大鼠→血紅素注射（i.p）心肌中HSP32↑（2.8倍）→I/R→梗塞面積↓（如同時給予HO-1抑制劑，則保護作用被取消）（HangaishiMetal,2000）2、小鼠基因敲除模型→破壞一個HO-1基因→

HO-1（+/-）小鼠→離體心I/R→心肌力學恢復差，CPK釋放↑，梗塞面積↑（YoshidaTetal,2001）

24hr48hr小分子HSP：分子量20～30kD：

HSP27/25αB-晶狀體蛋白（HSP22）

αA-晶狀體蛋白

HSP20MKBP/HSPB2HSPB3

特點：

1、C-末端含有共同的“α-晶狀體蛋白核心結構域”；

2、在橫紋肌中表達水平高，與胚胎期橫紋肌的分化關系密切；

3、與細胞骨架關系密切。

小分子HSP的心肌保護研究

1、大鼠心肌缺血→HSP27/25、αB-晶狀體蛋白及MKBP從胞漿向肌原纖維移位，主要分布于閏盤、Z線等處（YashidaKetal,1999）

2、大鼠、豬心肌缺血→αBC的移位伴隨有磷酸化（GolenhofenNetal,1998）

3、L929細胞，H2O2損傷→HSP27/25的分子伴娘及細胞保護作用與其磷酸化狀態(tài)及細胞中谷胱甘肽水平升高有關（RogallaTetal,1999;PrevilleXetal,1998）

可跨膜運轉的αB-晶狀體蛋白工程蛋白質的制備及其對心肌細胞損傷的保護作用pGEX-MTS-αBCpGEX-MTSpF14GGSTMTSFactorXaEcoRIEcoRIEcoRIαBCGSTMTSFactorXaαBCAB1234512kb321.610.50.40.30.20.1αBC載體構建

AB45.7KD32.5KD18.4KD123456123←GST-MTS-αBC

←GST←MTS-αBC

←GST-MTS-αBC

←MTS-αBC

78KDABCCelldeathrate(%)LDHrelease(%)*#*#4、新生大鼠心肌細胞→腺病毒介導αBC基因轉染→模擬缺血→CPK釋放↓，微管結構損傷↓（DillmannWHetal,1999）5、αBC轉基因小鼠→工作心臟→缺血20min，再灌3hr→心功能改善，梗塞面積↓，凋亡↓（RayPSetal,2001）

熱休克蛋白對心肌細胞凋亡的影響αBCHSP60HSP27HSP70OtherPathways(From:Kamradtetal,2001;Brueyetal,2000;Pandeyetal2000;Linetal,2001;Xanthoudakisetal1999;Sumlietal,1999;Mosseretal,2000;Salehetal,2000;Nylandstedetal,2000;Pandeyetal,2000;Parketal,2001)HSP90?pcDNA3.1+H2O2(12h)Smac+H2O2(12h)HSP70+H2O2(12h)HSP70+Smac+H2O2(12h)*#**##22222222Fig.7.EffectofHSP70orSmacoverexpressiononthepercentageofapoptoticnucleiinducedbyH2O2.

HSP70的蛋白質相互作用網絡及其心肌保護作用研究ContentsI.IntroductionofHSPs1.DefinitionofHSPs2.Characteristic3.Classficationanddistributionwithincell4.Functions5.Regulationofexpression

II.HSPsandheartdisease

III.HSPsandatherosclerosis

IV.HSPsandinflammation

V.HSPsandtumor

VI.HSPsandaging

熱休克蛋白與動脈粥樣硬化HSP70：在單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞和平滑肌細胞中高表達。HSP60：動脈粥樣硬化斑塊形成早期最重要的自身抗原。SchematicrepresentationoftheroleofautoimmuneresponsestoHSP60inatherosclerosis.ContentsI.IntroductionofHSPs1.DefinitionofHSPs2.Characteristic3.Classficationanddistributionwithincell4.Functions5.Regulationofexpression

II.HSPsandheartdisease

III.HSPsandatherosclerosis

IV.HSPsandinflammation

V.HSPsandtumor

VI.HSPsandaging

熱休克蛋白與炎性疾病HSP在腦膜炎中的表達PM：化膿性腦膜炎；TM：結核性腦膜炎；VM：病毒性腦膜炎1.細胞內熱休克蛋白2.細胞外熱休克蛋白細胞內熱休克蛋白與炎性疾病HSP72對晚期炎癥介質HMGB1釋放和功能的影響細胞外熱休克蛋白與炎性疾病抗原呈遞作用自身抗原：動脈粥樣硬化(a)lysisofthecelloforigin;(b)releaseinvesiclesbya‘‘blebbing’’mechanismfollowedbysubsequentlysisofvesicles;(c)secretionthroughanendolysosomesandreleasewhentheendolysosomefuseswiththecellsurface.Hsp70receptorsCD91：α2巨球蛋白受體，存在于多種免疫細胞CD40：選擇性識別HSP70LOX-1：氧化低密度脂蛋白受體，促進單核細胞與HSP70的結合Effectsofheatshockproteinsondendriticcells,andinductionofpeptide-specificimmunityContentsI.IntroductionofHSPs1.DefinitionofHSPs2.Characteristic3.Classficationanddistributionwithincell4.Functions5.Regulationofexpression

II.HSPsandheartdisease

III.HSPsandatherosclerosis

IV.HSPsandinflammation

V.HSPsandtumor

VI.HSPsandaging

熱休克蛋白與腫瘤ImplicationsinDiagnosis(診斷)Table1.HeatshockproteinsinBreastcancer

:diagnosticimplications

HspFindingsHsp27Correlationwithestrogenreceptors;Overexpression:lowcellproliferation;LackofassociationwithERinmaleBC;Smears,suspiciousofmalignancyHsp70Hsp70andc-myc:in63%ofcarcinomas;AssociatedwithelevationofER;Highcellproliferation;LNmetastasis,poordifferentiationHsp90αOverexpression:LNinvolvementAssociationwithPRisoformsHigher:cancer,correlatedwithcyclinD1Table2.HeatshockproteinsinEndometrial