第二章基因工程一、緒論1、什么是基因？如何分類？什么是基因表達？2、什么是基因工程？它產生的背景是什么？它的應用前景如何？1、什么是基因？如何分類？什么是基因表達？

基因，在希臘語中是“給予生命”之意，1909年，丹麥生物學家首先使用名詞“基因”代替“遺傳因子”這個術語。1）經典的基因概念（Theoryofthegene）1926T.H.Morgan基因是染色體上的實體基因象鏈珠(bead)一樣，孤立地呈線狀地排列在染色體上基因是(Threeinone)

；功能(functionalunit)突變(mutationunit)

交換(cross-overunit)

“三位一體”的最小的不可分割的基本的遺傳單位(1926T.H.Morgan)1910年始做果蠅雜交試驗，發(fā)現“連鎖遺傳規(guī)律”,并概括提出“基因論”1、什么是基因？如何分類？什么是基因表達？

2）后來順反子理論和操縱子理論的提出對經典的基因概念做了重要修正與發(fā)展。順反子理論的重要理論基礎：①“一個基因一個酶”假說1941Beadle&Tatum基因的化學本質就是DNA分子

1944Avery.O.T

順反子學說：一個順反子就是一個基因，這個基因或者編碼蛋白質，或者編碼RNA分子。在一個順反子內，有若干個突變單位突變子

在一個順反子內，有若干個交換單位交換子順反子學說徹底否定了基因是決定遺傳性狀的功能單位和突變、重組的最小單位這樣三位一體的概念。onegene→onefunction(Ribozyme,Abzyme,rDNA,tDNA..)

onegene→oneenzymeLac.Operon誘導物操縱子理論

(Lactoseoperon1961.Jacob,Monod)

基因功能的表現是若干基因組成的信息表達的整體行為IPOZYA

zonegene→onepeptideya1、什么是基因？如何分類？什么是基因表達？

3）基因：是一段含有特定遺傳信息的核苷酸序列（或核酸片段），它是控制生物性狀的功能和結構單位。1、什么是基因？如何分類？什么是基因表達？

4）從分子水平來說，基因有三個基本特性。

基因可自體復制1953年Watson-Crick提出了DNA雙螺旋結構模型。說明了半保留復制機制，兩股DNA彼此分開，以每一股為模板，按堿基配對的規(guī)則，各自配上一股新的DNA，復制便告完成?；虻囊话闾攸c

基因決定性狀

生物體的表（現）型（phenotype）是指有機體可見的或可計算的外在性質，而基因型（genotype）是指控制這些表型的遺傳因子?；虻囊话闾攸c

基因突變

基因通常是一個穩(wěn)定的遺傳單位，但它也可能發(fā)生可遺傳的變異，這種變異叫基因突變（mutation）。突變以后的基因以新的形式穩(wěn)定遺傳。攜帶突變基因的生物體叫突變體（mutant），攜帶正常基因的生物體叫野生型（wildtype)?；虻囊话闾攸c5）、根據是否轉錄和翻譯功能可分三類：一類是既有轉錄功能又有翻譯功能的基因，這類基因是指編碼酶和結構蛋白質的結構基因及編碼阻遏蛋白的調節(jié)基因（統稱為蛋白質基因）；第二類是只有轉錄功能而沒有翻譯功能的基因，包括編碼tRNA和rRNA的基因；第三類是既不轉錄也不翻譯的基因，包括啟動基因、操縱基因、增強子等（有時也把它稱為調控基因）。6）所以基因表達不能說就是遺傳信息經轉錄和翻譯從（DNA）傳遞到蛋白質的過程?；虮磉_：是基因表現其生物功能所經歷的一系列分子轉化和相互作用的過程。2、什么是基因工程？它產生的背景是什么？它的前景如何？

（1）、基因工程：應用DNA重組技術，按照人們的意愿，在基因水平上改變生物的遺傳性狀，創(chuàng)造新生物物種，通過工程化為人類提供有用產品及服務的技術。遺傳工程：是包括基因工程在內的人工改造生物遺傳性狀的全部技術；DNA重組技術：是采用酶法，將不同來源DNA進行體外切割與連接構成雜種DNA分子：分子克?。褐饕侵窪NA分子在宿主細胞內的復制過程。三者之間有聯系，但是有不同。（2）產生的背景：一方面是科學發(fā)展的必然要求（當時育種工作、癌等的治療都要求科技應有所突破）；另一方面是有關基因結構與功能的基礎理論研究的重大突破和技術的必然結果。（3）基因工程的成果和發(fā)展前景A、基因工程與醫(yī)藥衛(wèi)生B、基因工程與農牧業(yè)、食品工業(yè)C、基因工程與環(huán)境保護A基因工程與醫(yī)藥衛(wèi)生基因工程藥品的生產許多藥品的生產是從生物組織中提取的。受材料來源限制產量有限，其價格往往十分昂貴。微生物生長迅速，容易控制，適于大規(guī)模工業(yè)化生產。若將生物合成相應藥物成分的基因導入微生物細胞內，讓它們產生相應的藥物，不但能解決產量問題，還能大大降低生產成本?；蚬こ桃葝u素（一）胰島素是治療糖尿病的特效藥，長期以來只能依靠從豬、牛等動物的胰腺中提取，100Kg胰腺只能提取4-5g的胰島素，其產量之低和價格之高可想而知。胰島素分子結構基因工程胰島素（二）將合成的胰島素基因導入大腸桿菌，每2000L培養(yǎng)液就能產生100g胰島素！大規(guī)模工業(yè)化生產不但解決了這種比黃金還貴的藥品產量問題，還使其價格降低了30%-50%!胰島素生產車間其它基因工程藥物人造血液、白細胞介素、乙肝疫苗等通過基因工程實現工業(yè)化生產，均為解除人類的病苦，提高人類的健康水平發(fā)揮了重大的作用。人造血液及其生產B基因工程與農牧業(yè)、食品工業(yè)運用基因工程技術，不但可以培養(yǎng)優(yōu)質、高產、抗性好的農作物及畜、禽新品種，還可以培養(yǎng)出具有特殊用途的動、植物。轉魚抗寒基因的番茄轉黃瓜抗青枯病基因的馬鈴薯不會引起過敏的轉基因大豆超級動物導入貯藏蛋白基因的超級羊和超級小鼠特殊動物導入人基因具特殊用途的豬和小鼠C基因工程與環(huán)境保護基因工程做成的DNA探針能夠十分靈敏地檢測環(huán)境中的病毒、細菌等污染。1t水中只有10個病毒也能被DNA探針檢測出來基因工程在環(huán)境監(jiān)測上的應用基因工程與環(huán)境污染治理基因工程做成的“超級細菌”能吞食和分解多種污染環(huán)境的物質。通常一種細菌只能分解石油中的一種烴類，用基因工程培育成功的“超級細菌”卻能分解石油中的多種烴類化合物。有的還能吞食轉化汞、鎘等重金屬，分解DDT等毒害物質。A重組DNA技術的理論基礎二基因工程的基本原理19世紀中孟德爾

豌豆雜交試驗

遺傳因子

經典遺傳學20世紀初摩爾根

果蠅雜交實驗

基因

基因學1944年艾弗瑞

肺炎雙球菌轉化實驗

遺傳物質DNA1973年伯格-杰克森-考恩-鮑耶

DNA分子體外拼接分子遺傳學1953年沃森-克瑞克

DNA雙螺旋結構

分子生物學基因工程B基因的分子生物學二基因工程的基本原理C基因工程的基本原理提高外源基因的劑量——分子遺傳學原理篩選修飾重組基因表達的轉錄調控元件，如：啟動子、

增強子、操作子、終止子、上游調控序列等列、mRNA非編碼區(qū)、密碼子等——分子生物學原理

修飾構建蛋白質生物合成的翻譯調控元件，如：SD序

基因工程菌（微型生物反應器）的增殖及穩(wěn)定生產——生化工程學原理

——分子生物學原理

D基因工程的支撐技術核酸凝膠電泳技術核酸分子雜交技術細菌轉化轉染技術DNA序列分析技術寡核苷酸合成技術基因定點突變技術聚合酶鏈反應（PCR）技術三基因工程的基本條件C用于基因轉移的受體菌或細胞B用于基因克隆的載體A用于核酸操作的工具酶A用于核酸操作的工具酶限制性核酸內切酶DNA連接酶DNA聚合酶核酸酶核酸修飾酶（一）、工具酶：基因工程中所使用的酶類。1、限制酶：凡能識別和切割雙螺旋DNA分子內特定核苷酸順序的酶類，全稱是限制性核酸內切酶（1）、限制性核酸內切酶的發(fā)現：寄主控制的限制和修飾現象（R/M體系）因此發(fā)現了兩種酶：核酸內切酶：破壞外源DNA，使之迅速降解；

甲基化酶：保護自身DNA不受限制。

1968年，Smith等人首先從流感嗜血桿菌d株中分離出HindII和HindIII

限制性核酸內切酶的生物功能識別雙鏈DNA分子中的特定序列，并切割DNA雙鏈；主要存在于原核細菌中，幫助細菌限制外來DNA的入侵（2）限制性核酸內切酶的命名屬名種名株名HindIIIHaemophilusinfluenzae

d嗜血流感桿菌d株同一菌株中所含的多個不同的限制性核酸內切酶根據屬名和種名相結合的原則，即取細菌屬名的第一個字母（大寫）+種名的前兩個字母（小寫）表示。（若有株名時，用株名第一個字母置于三字母后）（3）核酸限制性內切酶的類型根據識別序列和切割位點的一致性，分為3類：

其中II型酶的核酸內切酶活性和甲基化作用是分開的，且具有序列特異性，在基因克隆中廣泛使用。II型限制性核酸內切酶的基本特性識別雙鏈DNA分子中4-8對堿基的特定序列大部分酶的切割位點在識別序列內部或兩側識別切割序列呈典型的旋轉對稱型回文結構5‘…GCTGAATTCGAG…3’3‘…CGACTTAAGCTC…5’EcoRI的識別序列EcoRI的切割位點具有很強的底物專一性，其底物只能是雙鏈DNA分子，對單鏈RNA及雙鏈DNA-RNA雜交分子均不起作用；EcoRI等產生的5‘粘性末端5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’EcoRI37℃5‘…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’退火4-7℃5‘…G-C-T-G

A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A

G-C-T-C…5’OHPOHPPstI等產生的3‘粘性末端5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’PstI37℃5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-OH

P-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-P

OH-A-C-G-T-C-C-T-C…5’退火4-7℃5‘…G-C-T-C-T-G-C-A

G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G

A-C-G-T-C-C-T-C…5’OHPOHPPvuII等產生的平頭末端5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C…5’PvuII37℃5‘…G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C…5’

(4)：影響限制酶活性的因素：底物的純度；純度高則酶活性強DNA的甲基化程度；甲基化程度高則酶活性弱DNA分子結構；環(huán)狀雙螺旋DNA分子較線性DNA穩(wěn)定，所需酶量較線性多。反應溫度；

大多數為37℃，特別：SmaI：25，ApaI：30，MaeI：45反應緩沖液。終止限制酶反應的方法：加熱失活，65℃保溫5分鐘；如是耐熱酶，則可用脲、SOS、及胍等變性劑使之失活。2、DNA連接酶及T4-DNA連接酶問題：什么是連接酶？兩種連接酶各有什么特點？能催化DNA片段5‘-磷?；c3’-羥基形成磷酸二酯鍵的酶。T4-DNA連接酶是T4-噬菌體編碼的一種重要連接酶特點：DNA連接酶只能封閉缺口，而不能封閉裂口；只能連接粘性末端，不能連接平整末端。T4-DNA連接酶既能連接粘性末端，又能連接平整末端。但用量大。DNA連接酶(ligase):催化2條鏈3’-OH和5’-P之間形成磷酸二酯鍵。DNA連接酶的活性能封閉nick，而非gap反應溫度：37℃為最佳溫度26℃反應4小時4℃過夜

nickgap3、DNA聚合酶：將脫氧核苷酸連續(xù)地加到雙鏈DNA分子引物鏈的3’-OH末端，催化核苷酸的聚合。（1）大腸桿菌DNA聚合酶I(E.coli.DNAPolI)

特點：5’-3’DNA聚合酶活性：Mg2+、單鏈DNA模板、3’-OH末端3’-5’外切酶活性：識別消除不配對堿基5’-3’外切酶活性作用DNA缺口轉移（2）大腸桿菌DNA聚合酶I大片段(Klenow片段)特點5’-3’聚合酶3’-5’外切酶應用用同位素標記DNA片段的末端補平粘末端合成cDNA第二鏈Sanger雙脫氧法進行序列測定定位突變B用于基因克隆的載體

問題：什么是載體？做為載體必須符合哪些條件？基因工程為什么要用載體？什么是受體、克隆和重組體（重組子）？載體：能將目的基因運載進生物細胞并在其中自我復制的遺傳因子。

載體的功能運送外源基因高效轉入受體細胞為外源基因提供復制能力或整合能力為外源基因的擴增或表達提供必要的條件載體應具備的條件在細胞中能自我復制，即本身是復制子(可繁殖性)；具有一種或多種限制酶的單一切割位點，并在此位點中插入外源基因片斷后，不影響其本身的復制功能(可利用性)；在基因重組中有1-2個篩選標記從而容易進行選擇(具有便利性)；分子小，多拷貝，安全性好，適應性強，容易控制，便于表達。在基因工程中，載體一般是用天然質?；虿《緸椴牧?，經過人工改造或重新構建而成，改造的目標：1、質粒改小(增加有效裝載量和拷貝數)2、減少相同的限制酶切點，使載體適合于多種限制性酶的切割3、引入強的復制原點，構建克隆載體4、引入強的啟動子和其它表達序列，構建表達載體。5、引入兩種不同的復制原點，構建穿梭載體。1、質粒載體（PlasmidUector）：質粒的基本特征質粒是生物細胞內固有的、能獨立于寄主染色體而自主復制、并被穩(wěn)定遺傳的一類核酸分子質粒常見于原核細菌和真菌中絕大多數的質粒是DNA型的絕大多數的天然DNA質粒具有共價、封閉、環(huán)狀的分子結構，即cccDNA質粒DNA的分子量范圍：1-300kb質粒的自主復制性質粒能利用寄主細胞的DNA復制系統進行自主復制質粒DNA上的復制子結構決定了質粒與寄主的對應關系根據在每個細胞中的分子數（拷貝數）多寡，質?？煞譃閮纱髲椭祁愋停簢谰o型復制控制的質粒1-3拷貝松弛型復制控制的質粒10-60拷貝質粒的不相容性任何兩種含有相似復制子結構的不同質粒，不能同時存在于一個細胞中，這種現象稱為質以大腸桿菌的質粒為例：ColE1、pMB1擁有相似的復制子結構，彼此不相容粒組成不相容性群粒的不相容性，不相容性的質質粒的可轉移性革蘭氏陰性菌的質?？煞殖蓛纱箢悾航雍闲唾|粒能在天然條件下自發(fā)地從一個細胞轉移到另一個細胞（接合作用），如F、R、Col質粒等非接合型質粒不能在天然條件下獨立地發(fā)生接合作用(用做基因工程的載體更為安全)值得注意的是，某些非接合型質粒（ColE1）在接合型質粒的存在和協助下，也能發(fā)生DNA轉移，這個過程由bom和mob基因決定攜帶特殊的遺傳標記野生型的質粒DNA上往往攜帶一個或多個遺傳標記基因，這使得寄主生物產生正常生長非必需的附加性狀，包括：這些標記基因對DNA重組分子的篩選具有重要意義質粒的分類人工構建的質粒根據其功能和用途可分成如下幾類：高拷貝質粒突變拷貝數控制基因拷貝數1000-3000擴增基因低拷貝質粒來自pSC101拷貝數小于10表達某些毒性基因溫敏質粒在不同溫度下表現出拷貝數、整合等不同性質測序質粒含有測序通用引物互補序列和多酶接頭polylinker整合質粒裝有整合促進基因及位點便于外源基因的整合穿梭質粒裝有針對兩種不同受體的復制子便于基因克隆表達質粒裝有強化外源基因表達的轉錄、翻譯、純化的元件探針質粒裝有報告基因便于啟動子等元件的克隆篩選PBR322質粒：PBR322質粒是大腸桿菌質粒載體，有萬能質粒載體之稱。它是由PSF2124、PMB8、PSC101三個親本質粒經過復雜的重組構成的。PSF2124—帶有氨芐青霉素抗菌素基因（Ampr）；PMB8—帶有ColEⅠ松馳型復制子；

PSC101—帶有一個四環(huán)素抗性基因（Tetr）。因此PBR322質粒是一個帶有（Ampr）和（Tetr）標記的松馳型質粒載體。重要的大腸桿菌質粒載體松弛型復制pBR322：2.6x106道爾頓拷貝數50-100/cell用于基因克隆2、噬菌體或病毒DNA噬菌體或病毒是一類非細胞微生物，能高效高特異性地侵染宿主細胞，然后或自主復制繁殖，或整合入宿主基因組中潛伏起來，而且在一定的條件下上述兩種狀態(tài)還會相互轉化。噬菌體或病毒的DNA能被開發(fā)成為基因工程的載體，因為：高效率的感染性能使外源基因高效導入受體細胞自主復制繁殖性能使外源基因在受體細胞中高效擴增大腸桿菌的l噬菌體DNAl噬菌體的生物學特性：生物結構l噬菌體由外殼包裝蛋白和l-DNA組成

l-DNA全長48502個核苷酸l-DNA上至少有61個基因大腸桿菌的l噬菌體DNAl噬菌體生物學特性：感染周期E.coli吸附LamB受體注入復制包裝裂解大腸桿菌的l噬菌體DNAl噬菌體生物學特性：溶源狀態(tài)

l噬菌體感染大腸桿菌后，除能裂解細胞外，也可能將其DNA直接整合到宿主細胞的染色體DNA上，并不產生子代噬菌體顆粒，這種情況為溶源狀態(tài)。人們可以根據需要改變l-DNA或宿主細胞的性質，使噬菌體或處于溶菌狀態(tài)，或處于溶源狀態(tài)。DNA重組技術一般需要l噬菌體進入溶菌狀態(tài)大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA載體的構建：縮短長度

野生型l-DNA包裝的上限為51kb，本身長度為48.5kb，只有當插入的外源DNA片段不大于2.5kb時，才能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒。因此縮短野生型l-DNA的長度，可以提高裝載量。其實野生型l-DNA上約有40-50%的片段是復制和裂解所非必需的。大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA載體的構建：刪除重復的酶切位點野生型的l-DNA鏈上有5個EcoRI位點和7個HindIII位點，不利于重組操作，必須刪除至1-2個同時，為了便于各種來源的DNA片段的克隆，還需要增加一些單一的酶切位點大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA載體的構建：加裝選擇標記與質粒不同，野生型l-DNA上缺少合適的選擇標記，因此加裝選擇標記是l-DNA克隆載體構建的重要內容l-DNA克隆載體上的選擇標記主要有下列兩類：免疫功能類標記顏色反應類標記大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA載體的構建：加裝選擇標記lacZlacZ基因編碼b-半乳糖苷酶，能催化無色的X-gal生成藍色化合物。當外源基因插入到lacZ基因中，基因滅活，不能合成藍色化合物；而空載體l-DNA則產生藍色透明斑。l-DNA作為載體的優(yōu)點：l-DNA可在體外包裝成噬菌體顆粒，能高效轉染大腸桿菌

l-DNA載體的裝載能力為25kb，遠遠大于質粒的裝載量

重組l-DNA分子的篩選較為方便

重組l-DNA分子的提取較為簡便

l-DNA載體適合克隆和擴增外源DNA片段，但不適合表達外源基因受體：用于擴增載體及目的基因的細胞?？寺。耗康幕虻臄U增過程。重組體（重組子）：攜帶重組DNA分子的受體細胞。對受體要求：

※對人體無害：※繁殖能力強、生長速度快、從而在短時間內能產生大量的后代，得到大量的基因拷貝和產物；※限制系統缺陷，對外來DNA不降解；

※有蛋白質的加工修飾