發(fā)育生物學相關技術1組織學與胚胎學系 肖玲概述2發(fā)育生物學是一個多學科的研究領域，它利用一切有關學科的技術方法，也利用它們的研究成果，來研究和解釋發(fā)育中的問題。例如要了解早期發(fā)育時的基因活動，就需要用分子生物學的技術研究受精之前和受精之后以至卵裂時期的RNA，以判斷哪些是受精前已有的，哪些是受精后轉錄的，它們是哪些類型，何時開場、在哪些細胞中轉錄的；要研究某一構造基因的調節(jié)控制，分子遺傳學關于原核基因的研究就是不可缺少的根底。生物學/胚胎學/分子生物學/遺傳學長期以來，生物學研究一直被一個問題所困擾，那就是進化對基因的修修補補為何沒有把生命變得一團糟。一種流行的理論認為，基因組拷貝了一些關鍵的基因，因此一旦有突變破壞了這些基因，生物體還留有一個備份。研究人員追蹤到一種被復制的基因---纖維原細胞生長因子受體1(fgfr1)的基因，在這種基因的作用下能夠繁殖出所謂的鏡子魚〔鏡鯉 〕，這些魚擁有巨大且能夠反射光線的鱗片。3?發(fā)育機制的探索，既可以是分子水平的研究，也可以是亞顯微或細胞水平的，如果涉及某些細胞器在細胞分化中的變化和作用；或者如果涉及到不同胚層的細胞在形成某一特定構造中的相互作用，就是更高水平的事。或者如果涉及個體的極性或對稱等的形成，那就是個體水平的了。不管哪個水平的發(fā)育，追究到底都可以從有關基因的調節(jié)、激活去探索。有關基因在何時被激活，它的產物在何時、如何在不同的水平上起作用，導致出現(xiàn)各個水平的形態(tài)發(fā)生過程，那么是發(fā)育生物學的重點所在。研究基因的構造，轉錄的時刻，轉譯產物的性質等自然要用分子生物學的方法；研究某種超微構造在發(fā)育中的變化，就要應用電子顯微鏡技術；研究某種蛋白的出現(xiàn)，細胞膜受體等可能需要免疫學技術，如果要離體地研究某種細胞的終末分化，或者不同組織在形成某種構造中的相互作用，就離不開細胞培養(yǎng)或組織培養(yǎng)的技術，顯然，在哪個水平上工作，或者研究什么問題，決定了采用什么技術。4常用的實驗材料一些過去在實驗胚胎學中較少使用的，但是對研究某些發(fā)育生物學問題有利的材料已受到重視。如果蠅，經過遺傳學家?guī)资甑呐Γ瑢λ男誀钸z傳已經充分了解，而且培育出大量的突變型。果蠅的有些突變型正是了解某一基因在何時起影響，起什么樣的影響的理想材料，這是用野生型做材料無法做到的。雖然果蠅體積較小，難以得到足夠的量供生化分析，但有可能通過大量培養(yǎng)和發(fā)展微量化檢測方法克服這一困難。5小鼠是另一種常用的材料。因為已經培養(yǎng)出一些突變型，而且它的胚胎在體內發(fā)育與人類比較接近。另一種使用范圍有擴大趨勢的材料是一種自由生活的秀麗隱桿線蟲，與人類基因的相似程度高達80%。已經用實驗方法得到許多突變型。它們繁殖迅速，可以在短期內培養(yǎng)出大量材料供生化分析和提取之用。62002年諾貝爾生理學或醫(yī)學獎獲得者悉尼·布雷內等三人，他們獲獎的原因是在20世紀60年代初期正確選擇線蟲作為模式生物，發(fā)現(xiàn)器官發(fā)育和“程序性細胞死亡〞過程中的基因規(guī)那么。布雷內是分子生物學的奠基者之一，他在1965年第一次研究線蟲，直到1974年才發(fā)表第一篇有關論文，其中經歷了長達10年左右默默無聞的根底工作時間。直到20世紀80年代后，線蟲研究才逐漸受到國際認可。?線蟲成蟲體全長只有0.1

公分，以細菌為食物，在實驗室中極易培養(yǎng)。因為全身透明，研究時不需染色，即可在顯微鏡下看到線蟲體內的器官如腸道、生殖腺等；假設使用高倍相位差顯微鏡，還可到達單一細胞的分辨率。7。，?實驗胚胎學的傳統(tǒng)材料──棘皮動物、兩棲類、鳥類等，仍然是重要的，只是用來研究的問題不同例如關于早期發(fā)育中基因的活動用海膽作材料的研究曾經提供大量資料。關于器官發(fā)生的分析，細胞分化的分子根底，兩棲類和鳥類仍然是重要的材料。8一、譜系跟蹤9定義：將細胞標記后注入胚胎或體外組織，通過對被標記細胞的跟蹤可以獲得胚胎形

成過程中細胞或組織變異的最直接信息，

假設在某一特定組織發(fā)生之前對細胞譜系

特異性基因表達進展比較，那么可鑒別出

細胞譜系的父代組織。一、譜系跟蹤101.細胞譜系〔cell line〕和系統(tǒng)譜系〔genealogicalpedigrees〕的跟蹤只需將偶聯(lián)了非擴散高分子葡聚糖的熒光染料注射創(chuàng)立者細胞，使之被標記即可。最近，創(chuàng)立者細胞已采用導入報告基因〔通過逆轉錄病毒、DNA注射或電脈沖轉移等〕來標記。設計精巧的報告基因在有絲分裂時可忠實地復制從而不致在細胞分裂過程中被稀釋。細菌的基因lacZ就是很好的報告基因。與一種真核啟動區(qū)相連接，注射后即能使它在受體細胞中表達。β-半乳糖苷酶基因的轉錄和轉譯可通過β-半乳糖苷酶催化產生一種藍色染料而查出。2.熒光素酶〔naturalluciferase〕天然的熒光素酶〔natural

luciferase〕由螢火蟲等許多發(fā)光生物的共生菌產生。熒光素酶催化一種一般稱作“熒光素〞的底物的，由此而發(fā)光。當熒光素與ATP參加到可滲透的細胞或細胞提取物中時，由光電倍增管測出的閃光即表示有熒光素酶存在于表達該基因的受體細胞中。11123.綠熒光蛋白質〔green

fluorescent

protein〕，GFP的的發(fā)現(xiàn)：60年代，

Shimomura等首先從水母中別離出一種水母發(fā)光蛋白(aequoren)該蛋白與鈣和腸腔素結合后可產生藍色熒光。然而水母整體提取的顆粒都呈綠色，后經證實在水母體內還存在另外一種發(fā)光蛋白即綠色熒光蛋白GFP,后經研究說明，在水母體內Ca2+和腸腔素與水母發(fā)光蛋白結合后，水母發(fā)光蛋白產生藍色熒光，GFP在藍光的激發(fā)下，產生綠色熒光。133.綠熒光蛋白質〔green

fluorescent

protein〕。GFP與水母及其它腔腸動物綠色的生物發(fā)光有關。GFP含有一種修飾過的氨基酸〔Leu-Tyr-Gly〕所組成的載色中心當GFP基因表達時，GFP中的載色中心即自發(fā)形成。由于有該載色中心，甚至在活細胞中心，用普通的熒光顯微鏡以標準的長波紫外光源就很容易地測出該基因的產物。將外源基因與GFPDNA 相連,構成融合基因，再將這種融合基因置于一常用的啟動區(qū)控制之下，由這種融合基因所編碼的多功能的相應蛋白質的表達那么通過GFP這局部產生的強熒光反映出來，因此GFP可作為外源基因的報告基因實時監(jiān)測外源基因的表達.?14Baby

mice

fathered

by

mice

receiving

a

donation

ofspermatogonial

stem

cells

from

mice

expressing

greenfluorescent

protein.

Only

half

the

baby

mice

show

the

greencolor.

This

is

because

each

spermatogonial

stem

cell

hasonly

one

copy

of

the

gene

for

green

fluorescent

protein.When

the

spermatogonial

cell

divides,

only

half

the

cellsthatresult

from

it

have

the

gene

for

green

fluorescent

protein.15GFP主要應用:16對活細胞中的蛋白質進展準確定位及動態(tài)觀察

可實時原位跟蹤特定蛋白在細胞生長、分裂、分化過程中或外界刺激因子的作用下的時空表達,如某種轉錄因子的核轉位、蛋白激酶C的膜轉位等。

GFP基因與分泌蛋白基因連接后轉染細胞,可動態(tài)觀察該分泌蛋白分泌到細胞外的過程

GFP基因與定位于某一細胞器特殊蛋白基因相連,就能顯示活細胞中細胞核、內質網(wǎng)、高爾基體、線粒體等細胞器的構造及病理過程可用于觀察分子的運動〔FRAP〕蛋白之間的相互作用〔FRET〕二、誘變與“基因敲除小鼠〞17基因敲除：指對一個構造但功能未知的基

因，從分子水平設計實驗，將該基因去除，或用其他序列相近基因取代，然后從整體觀察實驗動物，推測該基因相應功能的方法。二、誘變與“基因敲除小鼠〞18要對特定基因的功能和意義作追蹤蹤跡，有效的手段是設法將該基因完全地剔除〔功能喪失的突變〕，或者通過引入—方案好的突變以精巧的方式影響它的功能。在某些模式生物中引入轉座子〔如果蠅某些品系的P元件〕，或者，通過導入側翼接上取自轉座子或逆轉錄病毒介導插入的序列的外源基因，很容易產生隨機突變〔插入誘變〕。但這種方法無法按所設想改變某一特定的靶基因，受影響的還可能是別的基因。如果導入的DNA序列與所涉基因有一樣

源的的局部且?guī)в兴耐蛔?，定點誘變可能得以實現(xiàn)。有時，宿主原有的基因會被所導入的基因取代。由于這類事件只在罕見的情況下發(fā)生〔有些單倍體真菌，尤其是酵母，這種情況卻很平常〕，因此，兩個同源染色體中通常只有一個帶有該種突變。雖然如此，研究人員還是找到方法來獲得兩個等位基因均有同樣突變的小鼠。培養(yǎng)的胚胎干〔ES〕細胞，通過定點誘變使特定的基因失活，可用來產生出標準的“基因敲除小鼠〞〔Box2〕。然后將這種ES細胞注射到小鼠胚胎中，它們那么有可能發(fā)育成小鼠的各種類型細胞包括生殖細胞。然后將這種動物進展配種，其生殖細胞——卵子與精子——是來源于該ES細胞的動物，那么將會把該突變基因傳到其后代。經過常規(guī)的回交，那么可獲得純合型突變。19基因敲除小鼠20是指運用DNA同源重組原理，迫使所導入的外源基因與小鼠基因組中特定的內源基因（目的基因或靶基因）發(fā)生同源重組（這種重組現(xiàn)象又稱為定點整合或基因打靶），而獲得的內源目的基因缺失或功能喪失的轉基因小鼠。培育基因剔除小鼠的關鍵技術是ES細胞基因組操作，設法使外源基因能夠定點整合到ES細胞基因組中。人們已設計出能夠使外源基因定點整合的幾種正-負選擇（positive-negativeselection，PNS）系統(tǒng)。positive-negative

selection，PNS系統(tǒng)21最常用的PNS系統(tǒng)是由Mansaur等于1988年設計的。這套系統(tǒng)的根本策略是首先構建一個導向載體，其中含有一段與內源的靶基因〔以X代表〕同源的DNA序列，該同源序列內的一個外顯子中插有新霉素抗性基因〔neo〕，以用作正選擇的標志，在該同源序列附近還插有皰疹病毒胸苷激酶基因〔HSV-tk〕，以用作負選擇標志。HSV-tk基因本身沒有啟動子，但可承受neo基因的啟動子的調節(jié)。以一定的方法〔如顯微注射、電穿孔等〕將構建的導向載體導入ES細胞，繼續(xù)體外培養(yǎng)并以藥物G418和GANG作雙重選擇。如果所導入的導向載體DNA與ES細胞基因組DNA之間發(fā)生的是非同源重組，那么導向載體整個地隨機插入ES細胞基因組DNA中，其基因型為X、neo、HSV-tk。此時，neo基因和HSV-tk基因同時表達，其中neo基因的產物使ES細胞具有G418抗性，但

HSV-tk基因的產物可使

GANG轉變?yōu)橐环N有毒的物質，使ES細胞死亡。然而，如果發(fā)生的是同源重組，那么外源的neo基因便可一并整合到ES細胞的靶基因X座位上，而HSV-tk基因就喪失了。此時，僅有neo基因表達，其產物可使ES細胞具有G418抗性而存活下來。22條件性基因敲除法?條件性基因敲除法可定義為將某個基因的修飾限制于小鼠某些特定類型的細胞或發(fā)育的某一特定階段的一種特殊的基因敲除方法。它實際上是在常規(guī)的基因敲除的根底上，利用重組酶Cre介導的位點特異性重組技術，在對小鼠基因修飾的時空范圍上設置一個可調控的“按鈕〞，從而使對小鼠基因組的修飾的范圍和時間處于一種可控狀態(tài)。23除。利用Cre／LoxP

和來自酵母的FLP—frt系統(tǒng)可以研究特定組織器官或特定細胞中靶基因滅活所導致的表型。通過常規(guī)基因打靶在基因組的靶位點上裝上兩個同向排列的1oxP，并以此兩側裝接上

loxP

的(“l(fā)oxPfloxed〞)ES

細胞產生

“l(fā)oxPfloxed〞小鼠,然后，通過將“l(fā)oxPfloxed〞小鼠與Cre轉基因鼠雜交(也可以其他方式向小鼠中引入Cre

重組酶)，產生靶基因發(fā)生特定方式(如特定的組織特異性)修飾的條件性突變小鼠。在

“l(fā)oxP

floxed〞小鼠，雖然靶基因的兩側已各裝上了一個loxP，但靶基因并沒有發(fā)生其他的變化，故“1oxPnoxed〞小鼠表型仍同野生型的一樣。但當它與

Cre

轉基因小鼠雜交時，產生的子代中將同時帶有“l(fā)oxPfloxed〞靶基因和Cre基因。Cre

基因表達產生的Cre

重組酶就會介導靶基因兩側的1oxP

間發(fā)生切除反響，結果將一個loxP

和靶基因切

這樣，靶基因的修飾(切除)是以Cre

的表達為前提的。Cre

的表達特性決定了靶基因的修飾(切除)持性：即Cre

在哪一種組織細胞中表達，靶基因的修飾(切除)就發(fā)生在哪種組織細胞；而Cre

的表達水平將影響靶基因在此種組織細胞中進展修飾的效率。所以只要控制Cre的表達特異性和表達水平就可實現(xiàn)對小鼠中靶基因修飾的特異性和程度。24基因敲除的應用與缺陷25?基因敲除技術的應用及前景：①．建立生物模型?；蚯贸夹g常常用于建立某種特定基因缺失的生物模型，從而進展相關的研究。②.疾病的分子機理研究和疾病的基因治療。通過基因敲除技術可以確定特定基因的性質以及研究它對機體的影響。這無論是對了解疾病的根源或者是尋找基因治療的靶目標都有重大的意義。③.提供廉價的異種移植器官。如：PPL

Therapeutics

公司于1999

年已成功地在豬的體細胞中用基因敲除技術敲除了α－1，3GT

基因。使每只豬都缺乏產生a１－３半乳糖基轉移酶的基因的２個拷貝。這些酶在細胞外表產生一種糖分子，人體的免疫系統(tǒng)可以立即識別出這種糖分子為異源性，從而引發(fā)超急性免疫排斥反響。在缺乏這種酶的情況下，超急性排斥反響即不會再發(fā)生。④.免疫學中的應用。如果將動物免疫分子基因敲除，換以人的相應基因，那么將產生人的抗體，從而解決人源抗體的生產問題。⑤改造生物、培育新的生物品種?；蚯贸夹g為定向改造生物，培育新型生物提供了重要的技術支持。基因敲除技術的缺陷基因敲除技術始終存在著一個難以抑制的缺點，

即敲掉一個基因并不一定就能獲知該基因的功能，其原因包括：許多基因在功能上是冗余的，敲掉一個在功能上冗余的基因，并不能造成容易識別的表型，因為基因家族的其他成員可以提供同樣的功能對于某些必需基因，敲除后會造成細胞的致死性，也就無法對這些必需基因進展相應的研究了。26基因敲除的應用與缺陷三、轉基因技術轉基因動物〔transgenic

animal〕是指染色體基

因組中整合有外源基因并能表達和穩(wěn)定遺傳的一

類動物。1974年，Jaenish和Mintz應用顯微注射法，在世界上首次成功地獲得了SV40

DNA轉基

因小鼠。1980年，Gordon等人首先育成帶有人胸苷激酶基因的轉基因小鼠。尤其是1982年Palmiter等人將大鼠的生長激素基因導入小鼠受

精卵的雄原核中，獲得比普通小鼠生長速度快2~4倍，體形大一倍的轉基因“碩鼠〞后，轉基因動物技術轟動了整個生命科學界。隨后的十幾年里，

轉基因動物技術飛速開展，轉基因兔、轉基因豬、轉基因牛、轉基因雞、轉基因魚等陸續(xù)育成。轉

基因動物技術已廣泛應用于生物學、醫(yī)學、藥學、畜牧學等研究領域，27轉基因動物28

動物個體如何具備一個外來的〔如人的〕基

因？為查明某個基因的功能及它與遺傳性疾病的

關系而設計了這類實驗。如果醫(yī)學所關心的是在

于此，大多數(shù)探索性研究可以用小鼠來進展。方

法類似于引入突變。借助與逆轉錄病毒或諸如顯

微注射的物理方法，可以將某一工程基因構件裝

進小鼠的ES細胞中。這種構件往往含有介導插入的序列和另外一個對某種抗生素提供抗性的基因。這有助于對轉染成功的ES細胞進展鑒定。隨后，將篩選出的ES細胞引入到胚泡中〔Box

2〕。假

設此類細胞參與生殖細胞的形成，轉基因的卵子

或精子就可加利用，通過子代的自交，那么會獲

得異合型或純合型轉基因的動物。根據(jù)目的基因導入的方法與對象不同，培育轉基因動物的主要方法有基因顯微注射法、逆轉錄病毒感染法、胚胎干細胞介導法、精子載體導入法等。29⑴基因顯微注射法孕馬血清促性腺激素（PMSG）人絨毛膜促性腺激素（HCG）陽性Founder小鼠（首建鼠）PMSG30〔1〕目的基因的制備與純化目的基因可以來源于：①通過限制性內切酶預先別離的某一基因。②逆轉錄法得到的

cDNA。③人工合成的DNA片段。④聚合酶鏈式反響〔

PCR〕擴增的特定基因片段。目的基因的克隆可以通過載體方式進展，通常選擇質粒作為載體。將目的基因與質粒結合形成重組因子，然后轉化至大腸桿菌，擴增質粒，再別離純化重組質粒DNA，用適當?shù)南拗菩詢惹忻赶苽涑删€狀基因片段備用。目的基因的克隆也可以通過ＰＣ

Ｒ來實現(xiàn)。31〔2〕卵供體母鼠和假孕母鼠的準備定期準備相當數(shù)量的卵供體母鼠和假孕母鼠以及一批相對穩(wěn)定的正常公鼠與結扎公鼠。32〔3〕超排卵與取卵選擇4~6周齡母鼠，注射孕馬血清促性腺激素〔PMSG〕后，隔42~48h再注射人絨毛膜促性腺激素〔

HCG〕，注射HCG后10~13h剖腹取卵，用培養(yǎng)液保存，置

CO2培養(yǎng)箱備用。〔4〕基因顯微注射用專門的持卵管和注射針，在顯微注射儀上操作，將純化的目的基因〔DNA〕注射到受精卵的雄性原核內〔雄性原核較雌性原核大〕。33Figure

10.2.

Preparation

of

an

injection

needle.The

finely

drawn-out

capillary

is

bent

using

fine

forceps

to

identify

thepoint

of

flexure.The

forceps

are

used

to

very

gently

break

the

capillary

at

an

angle

atapproximately

the

point

of

flexure.Magnified

view

of

needle

tip,

showing

the

angled

break.

This

needlehas

an

inside

diameter

of

approximately

20

microns.34Figure

10.3.

Testing

and

use

of

an

injection

needle.Injection

of

dye

solution

beneath

the

surface

of

a

drop

of

mineral

oil,

illustratingconsistent

injection

volumes.Injection

needle

contacting

a

one-cell

embryo

at

approximately

a

right

angleand

depressing

the

surface.Once

the

needle

has

penetrated,

the

embryo

and

vitelline

membrane

revert

totheir

normal

shape.35〔5〕受精卵移植轉基因受精卵在單細胞至桑椹胚階段移植到受孕后

0.5d的假孕母鼠的輸卵管，在囊胚期那么移植到受孕后2.5d的假孕母鼠子宮。每只假孕母鼠移植20~30個轉基因卵為宜。〔6〕目的基因的表達整合鑒定和檢測從假孕母鼠產下的幼鼠尾尖提取DNA，用PCR、Southernbolt(DNA印跡)、FISH(熒光原位雜交)等方法在染色體及基因水平上進展整合鑒定，并通過Northernblot(RNA印跡)和Western

blot〔蛋白質印跡〕等方法在轉錄及蛋白質水平上進展表達檢測。經檢測獲得陽性Founder小鼠〔首建鼠〕。〔7〕建系將陽性Founder小鼠與同一品系的正常小鼠交配，檢測F1代仔鼠的陽性率，當繁殖到陽性率為50%左右時，即根本上可以判斷出外源目的基因為單一位點的整合。經擴大繁殖，從中選擇外源目的基因表達效果好、適應性好的轉基因小鼠進展近親繁殖。然后從子代中選擇理想的純合子個體進展全同胞兄妹交配，建立遺傳基因小鼠近交系。3637⑵逆轉錄病毒感染法逆轉錄病毒具有高效感染和在宿主細胞DNA上高度整合的特性。因此，利用逆轉錄病毒作為目的基因載體，通過感染早期胚胎細胞實現(xiàn)基因轉移，產生嵌合體動物(chimeric animal)，再經過雜交、篩選即可獲得轉基因動物。下面介紹其中幾項關鍵步驟。〔1〕逆轉錄病毒載體的構建 常以禽類和鼠類的逆轉錄病毒為載體。其構建步驟包括：①提取病毒未整合的環(huán)狀DNA。②將環(huán)狀DNA克隆到適當?shù)妮d體中。③選擇適當?shù)拿笇⒉《緲嬙斓鞍拙幋a區(qū)切除，如構建可復制型載體，那么切除其他局部非構造蛋白基因，如致癌基因等。④將外源目的基因克隆到載體中。⑤轉染細胞，測定外源基因的表達。38〔2〕包裝細胞又稱輔助細胞，它能為逆轉錄病毒載體提供包裝蛋白，對逆轉錄病毒載體功能的發(fā)揮起著重要的作用，決定著重組病毒效價及其宿主范圍。在哺乳動物，最常用的包裝細胞是φ-2細胞株，在其染色體內整合的是剔除了φ位點的Moloney小鼠白血病毒的缺陷型基因組。39〔3〕重組逆轉錄病毒感染早期胚胎載體轉染包裝細胞后，在載體中φ序列的作用下，將載體DNA轉錄的RNA和包裝

細胞表達的病毒蛋白包裝成具有感染性的重組顆粒。這時

就可以收集病毒顆粒，用于轉染早期胚胎，或者將胚胎直

接參加輔助細胞培養(yǎng)物中共培養(yǎng)進展轉染。經逆轉錄病毒

載體培育的轉基因動物主要是小鼠和家禽。小鼠的轉染方

法如下：①小鼠在交配后48h處死，取輸卵管，用胚胎培

養(yǎng)液沖出8細胞胚胎。②將胚胎置專門溶液中去除透明帶，再用胚胎培養(yǎng)液洗凈。③用專門溶液沖洗已轉染重組病毒

載體的輔助細胞，與無透明帶的胚胎共培養(yǎng)24h轉染目的

基因。④將轉染目的基因的胚胎，經手術移植到交配后

2.5d假孕母鼠子宮內。⑤產生的仔鼠經篩選、雜交獲得轉

基因小鼠。40⑶胚胎干細胞介導法

胚胎干細胞〔embryonic

stem

cell，ES〕是從 期胚胎內細胞團別離出來的，能在體外培養(yǎng)一種高度未分化的多發(fā)育潛能的細胞。它與 期胚胎聚集，或被注射到胚胎后，能參與宿主胚胎的發(fā)育，形成包括生殖細胞在內的所有組織；它也可以在體外進展人工培養(yǎng)、擴增，以克隆形式保存，因此，將外源目的基因導入ES細胞，再移入胚泡期的宿主胚胎，最后將宿主胚胎移植到假孕母鼠子宮內，便可獲得由胚胎干細胞介導的轉基因動物。41以小鼠為例，大致過程如下：①分離培養(yǎng)ES細胞。從確認受精后3.5d母鼠采取胚胎，胚胎培養(yǎng)4~6d后，分離出內細胞團。然后經胰蛋白酶處理，從中分離出ES細胞，并克隆

ES細胞。②ES細胞基因操作。首先構建特定的外源目的基因載體，再通過電穿孔、顯微注射、磷酸鈣-DNA共沉淀、逆轉錄病毒感染等方法，將外源目的基因導入ES細胞。③獲取囊胚期胚胎，以作為ES細胞的移植受體。④通過顯微

操作將ES細胞注射到囊胚期胚胎的囊胚腔內，形成嵌合體。⑤將注射過ES細胞的胚胎，移植到交配后3d的假孕母鼠子宮內，培育出轉基因小鼠。42⑷精子載體導入法43

1989年，Arezzo發(fā)現(xiàn)同源性和異源性大分子能夠穿透活的海星精子，用吸附有pSRVCAT或pSV2CAT的精子受精后，pSRVCAT或pSV2CAT質粒整合到卵內，并發(fā)現(xiàn)CAT質粒NDA基因在胚胎內獲得表達。同年，Lavitrano等利用鼠附睪內的精子進展試驗，觀察到一樣的結果，并以30%的頻率得到轉基因鼠。從此開展了以精子為載體的轉基因動物培育技術。這一方法的獨特步驟包括：①外源目的基因導入精子?？赏ㄟ^DNA與精子共育法、電穿孔導入法、脂質體轉染法等方法實現(xiàn)。②被導入外源目的基因的精子與卵子受精。方法有人工授精、壺腹部手術授精、體外授精等。⑸轉基因動物培育的新方法通過體細胞核移植技術培育轉基因動物

1997年，英國PPL公司的Scknieke與Roslin研究所的Wilmut等聯(lián)手，首次建立這一技術，并獲得3只人凝血因子IX基因和新霉素抗性基因的轉基因克隆綿羊，取名為“波莉(Polly)〞。44⑸轉基因動物培育的新方法通過將逆轉錄病毒載體注射MII期卵母細胞培育轉基因動物

其技術要點是：受精前用顯微注射方法將克隆有外源目

的基因的逆轉錄病毒載體注射入處于減數(shù)分裂中期〔MII〕的卵母細胞。這一方法由Anthony等首先報道。他們用此方法獲得了4頭乙型肝炎外表抗原基因的轉基因牛。通過精子頭與外源DNA合并注射卵母細胞培育轉基因動物

即首先將精子與外源目的基因共孵育，然后將精子頭部注射入MII期卵母細胞內。經人工破損精子膜效果更佳。45四、原位雜交技術46原位雜交技術現(xiàn)已較多地應用于胚胎發(fā)育

研究。常見的是胚胎組織切片的原位雜交

和整胚原位雜交〔whole

mount

in

situhybridization，WISH)，它們不同于一般的在載片上對細胞和組織切片進展探針雜交

及檢測的原位雜交，尤其是整胚原位雜交，能通過較好地保存組織中的RNA，觀察胚胎整體在不同發(fā)育時期的基因表達情況，

從而對在發(fā)育過程中表達的基因進展較準

確的三維定位，結果定位較直觀。原位雜交應用于胚胎組織的技術原理與方法和一般原位雜交大體一樣，但值得指出的是，對較大的胚胎標本而言，探針和抗體很難穿透整個組織或胚胎，可以先切成小的胚胎組織塊、厚片或薄片，然后進展固定、雜交。47胚胎的采集與固定1.用水合氯醛麻醉孕鼠，尾靜脈注射3分鐘后殺死老鼠，從子宮取出胎鼠2.將胎鼠放在冰浴PBS

中，洗滌2次。3.4°C 4％多聚甲醛/PB固定過夜4.0.1M

PBS/0.1%Tween

20(PBST)洗滌2x10min5.梯度甲醇〔25％，50％，75％，100％〕脫水6.胚胎在100％甲醇中－20°C保存?zhèn)溆?。雜交前處理1.梯度甲醇/PBST〔100％，75％，50％，25％〕至水。PBST洗滌10

min×22.3%H2O2/PBST

30min，PBST洗滌10min×23.20μg/ml

蛋白酶K

37°C

20

min4.0.1M

Glycin/PBST洗滌10

min×2，PBST洗滌

10min×25.4％多聚甲醛/PB

固定10min6.PBST洗滌10min48雜交

1.預雜交液〔50%formamide,5×SSC,50

μg/mlyeast

RNA,50

μg/ml

heparin,and

0.2%Tween

20〕與

PBST

1:1配制37°C

20

min2.預雜交液37°C

1

hr3.將地高辛標記探針參加預雜交液，雜交16-18hr4.梯度預雜交液/PBST〔4:1,3:2,2:3,1:4〕洗滌，10min/次5.PBST洗滌10

min×249雜交后洗滌與顯色1.TNB封閉1

hr2.用TNB

溶液1:100

稀釋的Anti-Digoxigenin-POD，4°C

孵育過夜3.TNT

Buffer洗滌10min×34.用試劑盒自帶稀釋液AmplificationReagent稀釋信號放大試劑Biotinyl

Tyamid〔Biotinyl

Tyramid貯存液：

Biotinyl

Tyramid溶解于0.2mlDMSO，BiotinylTyramid

工作液：1x稀釋液，1:50稀釋Biotinyl

Tyramid貯存液〕,室溫20

min5.TNT

Buffer洗滌10min×36.用TNB

溶液1:100

稀釋的SA-AP〔鏈霉卵白素-堿性磷酸酶〕，室溫1

hr7.TNT

Buffer洗滌10

min×3

。NTMT

(100

mMNaCl,100

mMTris-HCl,pH

9.5,50

mM

MgCl2,and

1%Tween

20)洗滌10

min×38.NBT/BCIP溶液〔4.5μl/ml

NBT

和3.5μl/ml

BCIP溶于

NTMT〕避光顯色1

hrs。NTMT洗滌10

min×3終止顯色9.70％甘油中保存50反義探針雜交的10.5

dpc胚胎在腦、脊神經管、生殖脊、心包、肢芽及頜弓部位呈現(xiàn)清晰的雜交信號(圖3,A),而正義探針雜交的胚胎無陽性信號(圖3,B);反義探針雜交的13.5

DPC胚胎在端腦、中腦、延髓、脊髓、肢芽部位呈現(xiàn)清晰的雜交信號(圖3,C),而正義探針雜交的胚胎無陽性信號(圖3,D)。A：小鼠10.5dpc胚胎

ERβ反義RNA探針的雜交結果：

RE(菱腦),MA(頜弓),PC(心包),SNT(脊神經管),GR(生殖脊),LB(肢芽);B：小鼠10.5

dpc胚胎

ERb

正義RNA探針的雜交結果;C:13.5

dpc胚胎ERb反義RNA探針的雜交結果:TE(端腦),ME(中腦),MO(延髓),SC(脊髓),LB(肢芽)：D：小鼠13.5dpc胚胎ERb正義RNA探針的雜交結果。51五、RNAi52

雙鏈RNA〔dsRNA〕對基因表達的阻斷作用被稱為RNA干預〔RNA

interference，RNAi〕。1995年，康奈爾大學的SuGuo

博士用反義RNA阻斷線蟲基因表達的試驗中發(fā)現(xiàn)，反義RNA（antisenseRNA和正義RNA（senseRNA）都阻斷了基因的表達，他們對這個結果百思不得其解。直到1998年，Andrew

Fire的研究證明，在正義RNA阻斷了基因表達的試驗中，真正起作用的是雙鏈RNA。這些雙鏈RNA是體外轉錄正義RNA時生成的。于是提出了RNAi這個詞。2002年，Zernicka-Coetz等