目錄一、摘要1中文摘要 12英文摘要 4二、正文1前言 62材料與方法 83結果3.1HE染色結果 113.2Kibra結果 123.3aPKC結果 194討論 265結論 276參考文獻 28三、綜述1綜述 312結語 413參考文獻 42四、致謝 48Kibra和aPKC在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的表達及意義中文摘要概述Kibra是一個含有WW結構域，表達于腎臟和腦組織的蛋白質。通過基因組單核苷酸多態(tài)性篩選證實，Kibra參與了人類記憶認知功能。大量研究表明，Kibra表達在記憶相關的腦組織區(qū)域；在記憶提取的過程中，Kibra等位基因會發(fā)生明顯改變；Kibra與CLSTN2表達在記憶相關區(qū)域內(nèi)顳葉部位參與情節(jié)記憶的形成，與阿爾默海茨病病因有關。但是Kibra在腦組織中的表達部位以及在胚胎發(fā)育過程中Kibra表達部位和表達水平的變化與記憶形成的關系尚不明確。PKC（蛋白激酶C）作為一個蘇氨酸-絲氨酸家族蛋白，參與了機體很多的生理性和病理性過程。如：腦組織的發(fā)育、突觸的可塑性、癲癇病、腦缺血以及神經(jīng)細胞的死亡。aPKC(非典型蛋白激酶C)為蛋白激酶C家族中的一個類型，可以分為三個亞型，PKCζ、PKCλ/ι、PKMζ。這些亞型在突觸可塑性和神經(jīng)變性疾病中發(fā)揮了重要的作用。它們介導胞外信號調(diào)節(jié)的激酶級聯(lián)反應，P70S6激酶信號級聯(lián)反應，參與腫瘤的發(fā)生，細胞極性的形成以及記憶的長時程增強。大腦記憶的主要功能區(qū)域在海馬，其次為顳葉和小腦，因為Kibra和PKC在胚胎發(fā)育腦組織中的具體表達部位及其意義還未闡明，如果能證實它們表達于大腦這些與記憶相關的區(qū)域，能為記憶形成的機理研究打下一定基礎。同時,最近研究發(fā)現(xiàn)，Kibra與PKC關系密切，可能是PKC磷酸化的底物。本研究以大鼠不同發(fā)育時期的腦組織（不同胚胎期、新生、成年）為研究對象,通過HE染色了解腦組織的基本結構和細胞形態(tài)；陰道抽液法確定受孕日期；免疫組織化學方法檢測Kibra和aPKC在不同時期腦組織中的表達，從而探討二者在突觸可塑性和記憶形成的聯(lián)系。結果顯示：1、Kibra在大腦皮層、海馬、小腦的細胞核中表達；在10d、12d表達陰性，14d表達弱陽性，16d、18d、新生、成年大鼠陽性表達逐漸增強。2、aPKC在大腦皮層、海馬、小腦細胞的細胞連接處表達，且在各個時期腦組織均為陽性表達。目的1、掌握了解大鼠腦組織的形態(tài)結構和組織特點。2、研究Kibra和aPKC在不同時期的大鼠腦組織中的表達。3、初步探討Kibra和aPKC在大腦記憶形成中的相關性。方法1、將雌雄成年鼠合籠，陰道抽液確定懷孕日期（檢查到精子記為懷孕0.5天）。2、收集不同時期（胚胎第10d，12d，14d，16d，18d，20d）胚胎鼠、新生鼠及成年鼠各兩只，共16只，分別標記、取腦組織。3、固定標本并切片（做冰凍切片和石蠟切片二種），HE染色、同一時期的大鼠腦組織分別用ABC三步法免疫組織化學法進行Kibra和aPKC染色。結果1、Kibra在大腦皮層、海馬、小腦的細胞質中表達；在胚胎10d、12d表達陰性；胚胎第14d在大腦皮層表達弱陽性，胚胎第18d在大腦皮層表達陽性，海馬區(qū)表達弱陽性；新生鼠在大腦皮層、海馬、小腦的浦肯野細胞中表達陽性。隨著胚胎的發(fā)育，表達逐漸增強。2、aPKC自胚胎第10d在大腦皮層、海馬、小腦細胞的細胞連接處表達陽性且均在各個腦組織時期表達陽性，隨著胚胎發(fā)育，表達有逐漸增強的趨勢。結論1、Kibra較aPKC晚表達于腦組織中，Kibra在腦組織中的表達隨胚胎發(fā)育逐漸增強，表達區(qū)域逐漸擴大。2、aPKC在自胚胎早期即表達于腦組織，說明是腦組織發(fā)育不可缺少的成分。3、Kibra和aPKC自新生后均在腦組織海馬、大腦皮層和小腦中表達，提示了二者可能存在潛在的相互作用和聯(lián)系，參與了記憶的形成。關鍵詞：記憶形成；腦組織；Kibra；aPKC;免疫組化；HE染色ExpressionandsignificanceofKibraandaPKCincentralnervoussystemduringembrynicdevelopmentCandidate:ZhouJin’anSupervisor:Prof.DuanYaqiTongjiMedicalCollege,HuazhongABSTRACTSummarizeTheKibrageneencodesacytoplasmaticprotein,amemberofthesignaltransductionproteinfamily,expressedmainlyinthebrain.RecentstudieshaveimplicatedtheinvolvementofageneticvariationintheKIBRAgene(Tallele)inhumanmemoryinnormalsubjectsandintheriskofdevelopingAlzheimer'sdisease(AD).PROTEINKINASEC(PKC)isanintegralpartinthecellsignalingmachinery.Biochemicalandmolecularcloninganalysishasrevealedthat,likemostothersignalingproteins,theenzymecomprisesalargefamilywithmultipleisoformsexhibitingindividualcharacteristicsanddistinctpatternsoftissuedistribution.Thebiologicalsignificanceofthisheterogeneityhasnotbeenfullyclarified,butthefunctionofeachPKCisoformforcellularregulationisbeinginvestigatedextensively.Presently,thepossibilitymaynotberuledoutthatsomeisoformsrepresentsimplyaredundancy,butplausibleevidencesuggeststhatthemembersofthisenzymefamilyareactivatedinspecificintracellularcompartmentsindifferentways,dependingonvariousmembranelipidmetabolites,andplaydistinctrolesforthecontrolofmajorcellularfunctions.ObjectiveTheaimofourstudywastoinvestigatethemorphologicalstructureandfeaturesoforganizationinbraintissues.TheexpressionofKibraandaPACinbraintissuesweredetectedaswell.MethodsThefemaleandmaleratswerematedanddatesofpregnantwereconfirmedbyvaginalfluid.Thebraintissuesoffetusesrats(10d,12d,14d,16d,18d,20d),neonatalratsandadultratsatdifferentstageswerecollected.Routinelyprocessed4%formamint-fixed,frozensectionsandparaffin-embeddedblockswerearchived.KibraandaPKCwerestainingbyHEandABCimmunohistochemicalmethods.ResultsKibrawasexpressedinthenucleiofcerebralcortex,hippocampusandepencephalon.TheexpressionlevelsofKibrawerenegativeonday10,12,weaklypositiveonday14.Theexpressionlevelwasgraduallyincreasedinneonatalratsandadultrats.TheexpressionofaPKCwaspositiveintheadherensjunctionsofcerebralcortex,seahorseandepencephalonatdifferentperiodofbraintissues.Conclusion1、Inbraintissues,theexpressionofKibraislaterthanaPKC.TheexpressionlevelandareaofKibraincreaseswiththeembryonicdevelopment.2、aPKCisanindispensablecomponentofbraindevelopmentbecauseitexpressesinbraintissueinearlyembryon.3.ColocalizationofKibraandaPKCinthecerebralcoretex,hippocampusandcerebellummayimplicatetheirrolesinmemoryformation.Keywords:engraphia;Kibra;aPKC;immunohistochemistry;HEstainingKibra和aPKC在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的表達及意義前言人類記憶的形成在神經(jīng)生物界至今是一個謎。一些研究者對記憶的獲得、維持和再現(xiàn)的機制仍在尋求答案。記憶的形成是一個高度復雜的過程，需要各種蛋白質分子的相互作用參與。其中，情節(jié)記憶是人類對過去特定的時間特定經(jīng)驗信息的一個儲存ADDINNE.Ref.{67EDEBCA-ECC8-4248-ABBD-1E96527FE154}[1]。情節(jié)記憶50%是由遺傳獲得ADDINNE.Ref.{AAAB2BD6-5DAD-48BE-8D2E-C08FD0C87EC6}[2]，但是個體情節(jié)記憶的遺傳差異的機制尚不清楚。動物實驗研究表明，個體間的記憶遺傳差異歸功于記憶形成過程中記憶相關信號分子ADDINNE.Ref.{CDF4B773-BC5B-49BB-AF56-9BCD8249EBCC}[3]。在這些相互作用的分子中，Kibra是一個近期研究比較熱門的分子，通過運用單核苷酸多態(tài)性的基因組相關研究表明，Kibra與人類情節(jié)記憶有關。最近的研究結果也一再顯示了Kibra在記憶形成過程中的重要性ADDINNE.Ref.{A0641C64-9BAC-40BA-83FF-7989D6C7EAC3}[4,5]。Kibra是一個含有WW-結構域的蛋白分子，表達于腎臟和腦組織中ADDINNE.Ref.{5C3830BB-45C2-4C2D-8C14-EDDD61B5953C}[6]。在海馬及顳葉這些與記憶高度相關的區(qū)域高度表達ADDINNE.Ref.{9BEA9573-B6CA-46BC-9DA2-67887DD1DDEA}[7,8]。Kibra被證實涉及到情節(jié)記憶形成的過程中，如信號轉導，突觸可塑性，長時程增強及突觸傳遞ADDINNE.Ref.{C621A9B9-D7CA-4E9C-80A2-E0B4FAAA2DDF}[6,7,9]。Kibra還通過與多種分子相互作用參與到多種生理功能中，如：信號傳導、細胞極性的分化、細胞的遷移、囊泡遞質的運輸、轉錄的調(diào)節(jié)ADDINNE.Ref.{75EC50C7-82F8-4E48-A273-5A1EDFF15559}[10]等。在乳腺癌MCF7細胞中Kibra還與DLC1共同激活雌激素受體ADDINNE.Ref.{A3B68FE1-2A25-4407-BD28-036BB997803D}[11]，對乳腺癌的治療、預后有一定的指導意義。PKC是絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶家族的一個成員，通過磷酸化反應來調(diào)節(jié)許多的細胞功能ADDINNE.Ref.{82EC5496-E1A6-440F-9ED4-EDD5C25A3994}[12]。根據(jù)其結構和功能將PKC分為12種亞型。aPKC由于缺少Ca離子和二酰甘油結合區(qū)，故激活機制不同于其他PKC。aPKC可分為三種亞型：PKCζ、PKCλ/ι、PKM。三者的結構如綜述圖1所示。aPKC包含調(diào)節(jié)區(qū)和催化區(qū)二個結構域，PKCζ、PKCλ/ι在催化區(qū)有高度相關性，研究發(fā)現(xiàn)，這二種亞型在基因敲除小鼠不同表型中發(fā)揮的作用是不同的。敲除PKCλ/ι的小鼠由于胚胎早期細胞極性的缺陷在胚胎期死亡，而敲除PKCζ的小鼠卻可以存活。說明，在胚胎發(fā)育中PKCλ/ι對細胞極性的建立至關重要，而PKCζ不參與這個過程ADDINNE.Ref.{C31D2021-AEE5-45E9-B029-796054F2E6C3}[13]。在各種細胞中，PKCζ參與MAPK級聯(lián)反應；活性突變的PKCζ活化MAPK激酶MEK1和ERK1ADDINNE.Ref.{2A1BEEEA-1A2C-44D8-83AE-DD86D1A37EFC}[14-17]；野生型PKCζ的過度表達激活ERK1和ERK2，增加EIK1的轉錄活性；參與受體信號復合物到NFκB轉錄因子的活化ADDINNE.Ref.{70FDFEA7-E569-481C-B475-2D5DD21BDD3D}[18,19]和P70S6激酶信號及級聯(lián)反應ADDINNE.Ref.{C986ECD5-2DE7-4E55-9FBA-D6D5E2D6FA6B}[20,21]等。PKCλ/ι在一些惡性腫瘤如非小細胞肺癌和卵巢癌中異常表達，持續(xù)過度表達可導致細胞極性、粘附作用喪失，與腫瘤的轉移、發(fā)展、預后有一定的關系ADDINNE.Ref.{A15B1049-4306-4D65-919B-72D87360307B}[22,23]。而PKM只含有催化區(qū)，是一個截短型的aPKC分子ADDINNE.Ref.{539AC6CD-3536-4725-B29A-F376F0093BA7}[24]，一旦產(chǎn)生，就始終處于激活狀態(tài)。研究表明，PKM在長期記憶的維持和海馬長時程增強中發(fā)揮了重要作用，是一個必不可少的分子ADDINNE.Ref.{E5A8B35E-8E3E-4E70-8112-27BA6365FC86}[25]。本實驗旨在研究Kibra和aPKC在不同鼠腦組織發(fā)育過程中的表達部位，通過初步探討二者的表達，為進一步研究二者間的相互作用提供定位依據(jù)。一些實驗研究表明：Kibra和aPKC通過與不同分子的相互作用共同參與信號通道中，發(fā)揮相同的功能。Kibra作為aPKC磷酸化的底物這是至今唯一明確的關于二者直接相互作用的研究發(fā)現(xiàn)。如果Kibra被PKC磷酸化后參與記憶的形成，那么通過對Kibra及PKC在胚胎發(fā)育過程中定位的研究，可以部分揭開兩者神秘關系的面紗。材料和方法一材料（一）動物成年健康250g左右SD大鼠24只：購于華中科技大學同濟醫(yī)學院動物實驗中心（二）試劑1.Kibra及aPKC抗體購于美國Santacruz公司，最終稀釋濃度：Kibra為1：200，aPKC為1:1000。2.4%多聚甲醛：稱取40g多聚甲醛,加熱至60℃左右的蒸餾水約400ml，攪拌,加入少量的1MNaOH溶液，攪拌至完全溶解（一直保持60℃的溫度）；加入0.2M的PBS500ml，冷卻后過濾，蒸餾水定容至1000ml。PH值調(diào)至7.2-7.4，放入4℃冰箱預冷，現(xiàn)配現(xiàn)用。3.0.2MPBS：(1)Na2HPO4·12H2O5.67g溶于200ml蒸餾水(2)NaH2PO4·2H2O1.56g溶于50ml蒸餾水，4.免疫組化用PBS：Na2HPO4·12H2O14.4999g、NaH2PO4·2H2O1.482g、Nacl45g溶于5L蒸餾水中，調(diào)PH至7.4。5.30%蔗糖：（1）稱取14.2Na2HPO4·12H2O14.2g溶于100ml蒸餾水中，（2）稱取NaH2PO4·2H2O12g溶于100ml中，分別?。?）72.9ml和（2）27.1ml混合，加入30g蔗糖溶解其中，現(xiàn)配現(xiàn)用。6.OCT包埋劑：購于美國SAKURA產(chǎn)品。7.ABC試劑：購于北京中杉金橋免疫組化專用ABC試劑盒。8.95%乙醇：950ml無水乙醇，50ml雙蒸水。9.90%乙醇：900ml無水乙醇，100ml雙蒸水。10.80%乙醇：800ml無水乙醇，200ml雙蒸水。11.抗原修復液：0.01mol/L檸檬酸鹽緩沖液（CB，pH6.0，1000ml），檸檬酸三鈉3g，檸檬酸0.4g，混勻。12.3%H2O2：30%H2O2，PBS按體積1:10比例混合13.DAB：購于美國R&DSystems公司。14.1%鹽酸酒精：75%的酒精100ml+1ml濃鹽酸（三）主要儀器HPIAS－1000型圖像分析系統(tǒng)。二方法（一）獲取胎鼠腦組織(1)獲取胎鼠：第一天下午17:30以2:1的比例雌雄合籠，于次日9點前進行陰道抽液并涂片，鏡下觀察精子，記錄陰道涂片有精子的雌鼠進行標記并記錄為妊娠0.5天。(2)待胎鼠孕育到所需天數(shù)后麻醉孕鼠剖腹取出胎鼠，麻醉，斷頭。冰上分離其腦組織。(3)獲取新生鼠及成年大鼠的腦組織：取新生鼠及250g成年大鼠，麻醉，剪開胸腔，暴露心臟。從心尖處將灌流針插入左心室，剪開右心耳。先灌以少量生理鹽水，再用4%多聚甲醛灌流。待新生鼠四肢抽搐，僵硬，變白后，斷頭取腦，冰上分離腦組織。(4)腦組織的處理及后固定：以上腦組織分離后分別投入4%多聚甲醛過夜，后轉入30%的蔗糖中。待沉底后，OCT包埋，液氮速凍一分鐘，放置-70℃冰箱保存。所有標本收集齊后，進行腦組織切片。(5)腦組織切片：將標本進行石蠟包埋，從平行大腦中線面進行矢狀切片，片厚5μm，每5張取一張?？酒^夜，待染色。（二）HE染色步驟（1）脫蠟：二甲苯脫蠟10mins×2。（2）水化：100%酒精，95%酒精，75%酒精依次放置5mins。（3）自來水沖洗后過雙蒸水，1min。（4）蘇木素染色5min后，充分自來水沖洗1min；將玻片表面蘇木素沖凈然后過鹽酸酒精分化10s。（5）流水沖洗，觀察染色是否充分。（6）伊紅染色20秒，然后用無水酒精Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ脫水，2min/次。（7）吹干，中性樹膠封片。（三）免疫組化采用S-P法染色步驟(1)石蠟切片脫蠟至水：二甲苯10mins，二甲苯10mins，二甲苯5mins，95%酒精5mins，80%酒精5mins，75%酒精5mins，蒸餾水2mins。（2）高壓鍋抗原修復：加入枸櫞酸鈉修復液，冒氣時開始計時1分30秒。（3）3%過氧化氫室溫孵育10mins，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。（4）自來水沖洗1min。（5）PBS5mins×3。（6）加A液37℃30mins，（7）甩掉切片上的A液，滴加用血清稀釋好的一抗，4℃過夜。（8）自來水洗1mins。（9）PBS5mins×3。（10）加B液，37℃20mins。（11）自來水洗1mins。（12）PBS5mins×3。（13）加C液，37℃20mins。（14）自來水洗1mins。（15）PBS5mins×3。（16）滴加二抗，37℃30mins。（17）自來水洗1mins。（18）蘇木素復染，透明，封片。（四）結果的閱讀和分析本實驗結果由一名經(jīng)驗豐富的技師指導染色，經(jīng)過二名同濟醫(yī)院副高以上專家閱片，采用HPIAS－1000型圖像分析系統(tǒng)獲取圖片，結果真實可靠。結果一、HE染色：腦組織的正常形態(tài)結構。圖1-1成年鼠腦組織HE染色（20×）圖1-2成年鼠腦組織HE染色(海馬400×)圖1-3成年鼠腦組織HE染色(小腦400×)二、Kibra結果Kibra自胚胎第14天在大腦皮層表達弱陽性；胚胎第18天在大腦皮層表達陽性，海馬區(qū)表達弱陽性；新生鼠在大腦皮層、海馬、小腦的浦肯野細胞中表達陽性。1、在大鼠胚胎發(fā)育的第10d，其腦組織為神經(jīng)管，Kibra染色結果為陰性（見圖2-1）。圖2-110d胎鼠腦組織免疫組化結果示Kibra的表達（20×）；2、在大鼠胚胎發(fā)育的第12d，腦組織Kibra染色結果為陰性（見圖2-2）。圖2-212d胎鼠腦組織免疫組化結果示Kibra的表達（20×）；3、在大鼠胚胎發(fā)育的第14d，大腦皮層Kibra染色結果為陽性（見圖2-3箭頭所指處）。4、在大鼠胚胎發(fā)育的第16d，大腦皮層Kibra染色結果為陽性，著色較第14d稍深（見圖2-4箭頭所指處）。5、在大鼠胚胎發(fā)育的第18d，大腦皮層Kibra染色結果為陽性，海馬區(qū)Kibra染色結果為陽性（見圖2-5箭頭所指處）。6、新生鼠免疫組化結果示Kibra在大腦皮層、海馬、小腦中的表達均為陽性（見圖2-6、圖2-11，圖2-6箭頭所指處從左到右分別為小腦、海馬、大腦皮層；圖2-11示新生鼠小腦）。7、成年鼠免疫組化結果示Kibra在大腦皮層、海馬、小腦中的表達均為陽性，并且著色較前都有明顯加深（見圖2-7、2-8、2-9、2-10）。圖2-314d胎鼠腦組織免疫組化結果示Kibra的表達（20×）；圖2-416d胎鼠腦組織免疫組化結果示Kibra的表達（20×）；圖2-518d胎鼠腦組織免疫組化結果示Kibra的表達（20×）；（左側箭頭示大腦皮層，右側箭頭示海馬區(qū)）圖2-6新生鼠免疫組化結果示Kibra在大腦皮層、海馬、小腦中的表達（20×）；圖2-7成年鼠免疫組化結果示Kibra在大腦皮層、海馬中的表達（20×）；AA圖2-8圖2-7中A部分示Kibra在大腦皮層表達陽性（100×）BB圖2-9圖2-7中B部分示Kibra在海馬及齒狀回表達陽性（100×）C字形為CA區(qū)，W形為齒狀回區(qū)CC圖2-10圖2-7中C部分示Kibra在海馬區(qū)表達陽性（400×）DD圖2-11圖2-7中D部分Kibra在小腦浦肯野表達陽性（100×）三、aPKC結果：1、aPKC在細胞與細胞連接處出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達。aPKC在大腦皮層，海馬，小腦中表達陽性。2、aPKC在在10d、12d、14d、16d、18d、20d、新生、成年表達均陽性（見圖3-1、圖3-2、圖3-3、圖3-4、圖3-5、圖3-6、圖3-7、圖3-8、圖3-9、圖3-10、圖3-11、圖3-12），強度隨生長發(fā)育的過程有逐漸增強的趨勢。圖3-110d胎鼠腦組織免疫組化結果示aPKC的表達（20×）；圖3-212d胎鼠腦組織免疫組化結果示aPKC的表達（20×）；圖3-314d胎鼠腦組織免疫組化結果示aPKC的表達（20×）；圖3-415d胎鼠腦組織免疫組化結果示aPKC的表達（20×）；圖3-516d胎鼠腦組織免疫組化結果示aPKC的表達（20×）；圖3-618d胎鼠腦組織免疫組化結果示aPKC的表達（20×）；圖3-720d胎鼠腦組織免疫組化結果示aPKC的表達（20×）；圖3-8新生鼠（左）和成年鼠（右）腦組織免疫組化結果示aPKC的表達（20×）；圖3-9圖3-8中E部分免疫組化結果示aPKC在海馬的表達（100×）；圖3-10圖3-8中F部分免疫組化結果示海馬區(qū)aPKC的表達（400×）；圖3-11圖3-8中G部分免疫組化結果示aPKC的表達（400×）（注：周邊一圈棕染細胞為浦肯野細胞）圖3-12圖3-8中H部分免疫組化結果示aPKC在大腦皮質的表達（100×）；討論記憶的形成是一個比較復雜的過程，大腦記憶主要部位已經(jīng)被證實為海馬區(qū)，其次為大腦皮層和小腦，這些部位蛋白的表達與記憶必定存在一定聯(lián)系。Kibra在人類腎臟和腦組織中高度表達。它第一個被證實與記憶行為有著直接聯(lián)系的支架蛋白。與記憶相關基因篩選表明，Kibra基因第九個內(nèi)含子上的單核苷酸多態(tài)性與情節(jié)記憶有關ADDINNE.Ref.{B31C2105-CBDD-4375-8341-09D5271F7CE4}[26]。Kibra蛋白質表達在細胞質，含有二個與富含脯氨酸靶分子結合的WW結構域，一個感應Ca離子的類似C2區(qū)ADDINNE.Ref.{001F596E-5B44-44FE-A4CB-BEA7E5D479B9}[27]及位于羧基端富含谷氨酸的區(qū)域ADDINNE.Ref.{9AB42464-2A24-4F67-928A-7E648E1879FB}[28]。本實驗顯示kibra在細胞質表達，特別是核周表達豐富，它在細胞質的定位說明kibra不參與RNA剪切及轉錄等一系列細胞核蛋白的功能中。免疫組化結果表明kibra在記憶相關區(qū)域海馬CA1，CA2，CA3，齒狀回，大腦皮層，小腦，下丘腦高度表達，參與了記憶的形成。為一些神經(jīng)代謝紊亂疾病和阿爾默海茨病提供了病因依據(jù)。aPKC分為三種亞型PKCζ、PKCλ/ι、PKMζ，大量研究表明PKMζ參與了長時程增強和長時程抑制過程ADDINNE.Ref.{14FB3CED-94FA-40D2-9476-3CF18AACE495}[29]，毋庸置疑的是這三者均為記憶認知形成過程中的重要分子ADDINNE.Ref.{51E066FE-1F66-450F-9DF7-5F50B314CEE5}[30]。PKCλ/ι在胚胎細胞極性形成過程中發(fā)揮了重要作用，胚胎發(fā)育時PKCλ/ι表達缺陷可導致胚胎的死亡ADDINNE.Ref.{EC112508-7061-44C4-91EF-E371C899EE0C}[31]。PKCζ參與多個信號級聯(lián)反應，如炎癥、免疫反應、細胞凋亡、細胞極性的建立中ADDINNE.Ref.{25196937-68D5-48E3-BB8C-66DD79C47669}[32]。本試驗中，aPKC在海馬，大腦皮質，小腦這些部位表達顯著，在一定程度上與胚胎神經(jīng)發(fā)育、記憶形成有關。aPKC在Dishevelled分子作用下促進軸突的分化，在神經(jīng)發(fā)育中有著關鍵的作用ADDINNE.Ref.{BD41064A-3144-467B-8DDA-5C106C7E6CA1}[33]。在亞細胞水平，aPKC在細胞聯(lián)合部位表達陽性，顯示aPKC在細胞極性建立中的重要性。但是aPKC在各種功能中形成復合物后下游調(diào)控的目的分子和調(diào)控這些分子后產(chǎn)生的詳細機制和功能，以及細胞極性維持和建立的分子機制、在記憶形成過程的具體機制有待進一步研究和探討。有研究報導，Kibra和aPKC通過與不同分子的相互作用共同參與信號通道中，發(fā)揮相同的功能。Kibra作為aPKC磷酸化的底物這是至今唯一明確的關于二者直接相互作用的研究發(fā)現(xiàn)。本研究中，在小鼠胚胎發(fā)育到14天后，Kibra在大腦皮層開始表達，而后隨著胚胎的發(fā)育逐漸表達增強，區(qū)域逐步擴展到海馬、小腦。自Kibra完全表達后，其和aPKC在腦組織中表達的部位均為大腦皮層、海馬、小腦這三個與記憶明確相關的區(qū)域。Kibra在14d后開始表達至成年表達逐漸增強，可能說明腦組織發(fā)育到一定階段，通過Kibra的出現(xiàn)，在一系列分子機制下激活aPKC，處于激活狀態(tài)的aPKC作用于Kibra，使14d后的腦組織Kibra的表達呈現(xiàn)出逐漸增強的陽性表達。aPKC自胚胎發(fā)育的第10天即廣泛表達于腦組織中，說明其是腦組織生長發(fā)育和記憶形成中不可缺少的分子。由此，經(jīng)過我們初步探討這二者在腦組織中的表達部位，為進一步研究它們的相互作用機制提供了一個出發(fā)點。結論1、Kibra較aPKC晚表達于腦組織中，Kibra在腦組織中的表達隨胚胎發(fā)育逐漸增強，表達區(qū)域逐漸擴大。2、aPKC在自胚胎早期即表達于腦組織，說明是腦組織發(fā)育不可缺少的成分。3、Kibra和aPKC自新生后均在腦組織海馬、大腦皮層和小腦中表達，提示了二者可能存在潛在的相互作用和聯(lián)系，參與了記憶的形成。參考文獻Tulving,E.,Episodicmemory:frommindtobrain.AnnuRevPsychol,2002.53:p.1-25.Bouchard,T.J.andM.McGue,Geneticandenvironmentalinfluencesonhumanpsychologicaldifferences.JNeurobiol,2003.54(1):p.4-45.Neuropsychiatry,2009.14(4-5):p.356-76.Nacmias,B.,etal.,KIBRAgenevariantsareassociatedwithepisodicmemoryperformanceinsubjectivememorycomplaints.NeurosciLett,2008.436(2):p.145-7.Almeida,O.P.,etal.,KIBRAgeneticpolymorphisminfluencesepisodicmemoryinlaterlife,butdoesnotincreasetheriskofmildcognitiveimpairment.JCellMolMed,2008.12(5A):p.1672-6.Kremerskothen,J.,etal.,CharacterizationofKIBRA,anovelWWdomain-containingprotein.BiochemBiophysResCommun,2003.300(4):p.862-7.Johannsen,S.,etal.,Temporal-spatialexpressionandnovelbiochemicalpropertiesofthememory-relatedproteinKIBRA.Neuroscience,2008.155(4):p.1165-73.Papassotiropoulos,A.,etal.,CommonKibraallelesareassociatedwithhumanmemoryperformance.Science,2006.314(5798):p.475-8.Buther,K.,etal.,KIBRAisanovelsubstrateforproteinkinaseCzeta.BiochemBiophysResCommun,2004.317(3):p.703-7.Schneider,A.,etal.,KIBRA:ANewGatewaytoLearningandMemory?FrontAgingNeurosci,2010.2:p.4.Rayala,S.K.,etal.,EssentialroleofKIBRAinco-activatorfunctionofdyneinlightchain1inmammaliancells.JBiolChem,2006.281(28):p.19092-9.Nishizuka,Y.,ProteinkinaseCandlipidsignalingforsustainedcellularresponses.FASEBJ,1995.9(7):p.484-96.Leitges,M.,etal.,TargeteddisruptionofthezetaPKCgeneresultsintheimpairmentoftheNF-kappaBpathway.MolCell,2001.8(4):p.771-80.Berra,E.,etal.,EvidenceforaroleofMEKandMAPKduringsignaltransductionbyproteinkinaseCzeta.EMBOJ,1995.14(24):p.6157-63.Fernandez,N.,etal.,AtypicalproteinkinaseC-zetastimulatesthyrotropin-independentproliferationinratthyroidcells.Endocrinology,2000.141(1):p.146-52.Schonwasser,Monick,M.M.,etal.,ProteinkinaseCzetaplaysacentralroleinactivationofthep42/44mitogen-activatedproteinkinasebyendotoxininalveolarmacrophages.JImmunol,2000.165(8):p.4632-9.Sanz,L.,etal.,Theinteractionofp62withRIPlinkstheatypicalPKCstoNF-kappaBactivation.EMBOJ,1999.18(11):p.3044-53.Sanz,L.,etal.,TheatypicalPKC-interactingproteinp62channelsNF-kappaBactivationbytheIL-1-TRAF6pathway.EMBOJ,2000.19(7):p.1576-86.Akimoto,K.,etal.,AtypicalproteinkinaseClambdabindsandregulatesp70S6kinase.BiochemJ,1998.335(Pt2):p.417-24.Romanelli,A.,V.C.DreisbachandJ.Blenis,Characterizationofphosphatidylinositol3-kinase-dependentphosphorylationofthehydrophobicmotifsiteThr(389)inp70S6kinase1.JBiolChem,2002.277(43):p.40281-9.Regala,R.P.,etal.,AtypicalproteinkinaseCiotaplaysacriticalroleinhumanlungcancercellgrowthandtumorigenicity.JBiolChem,2005.280(35):p.31109-15.Eder,A.M.,etal.,AtypicalPKCiotacontributestopoorprognosisthroughlossofapical-basalpolarityandcyclinEoverexpressioninovariancancer.ProcNatlAcadSciUSA,2005.102(35):p.12519-24.Takai,Y.,etal.,Studiesonacyclicnucleotide-independentproteinkinaseanditsproe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ng)細胞和足細胞的極性中發(fā)揮了重要作用ADDINNE.Ref.{3B5FACE1-8A82-4CC2-92D5-4CDFB46C395B}[9]。PATJ與KibraⅢ級PDZ序列結合，一起參與細胞極性的分化，而且，在上皮細胞遷移中，PATJ還調(diào)節(jié)aPKC和Par3在亞細胞水平的定位ADDINNE.Ref.{A6BD65D7-D513-4D02-AFF9-8EA6A9D715BB}[15,16]。總之，這些都說明Kibra和PATJ在其極性和遷移中起到了重要的調(diào)節(jié)作用。Kibra被證實是突觸后結構中的一員，以及與細胞極性蛋白的相互作用，參與細胞遷移這些充分表明了Kibra對細胞骨架的重新組裝中起到了一個中心角色的作用。5、動力蛋白復合體ADDINNE.Ref.{C1EACD9A-EAA5-4FCE-9588-43C100A90434}[17]，有研究發(fā)現(xiàn)SNX4與復合體（復合體由微管動力蛋白和Kibra組成）抑制鐵蛋白受體的降減從而使鐵蛋白重復利用。SNX4與復合體的下調(diào)增強了溶酶體介導的鐵蛋白受體的降減。6、sec3，sec3是exocyst復合物的一個成員ADDINNE.Ref.{AE944DEE-E4A6-42F4-B9B0-95B96239DCA2}[18]。Kibra通過聯(lián)合sec3來實現(xiàn)參與囊泡運輸?shù)倪^程。7、Kibra/exocyst復合物通過與細胞內(nèi)靶基因PKC發(fā)生關聯(lián)，對細胞遷移中定位信號級聯(lián)反應進行調(diào)節(jié)。8、組蛋白H3及動力蛋白輕鏈1（DLC1）ADDINNE.Ref.{1D4DE26F-810F-44EF-82CD-F0F66BF45257}[4]，Kibra與動力蛋白的相互作用還可以通過Kibra與組蛋白H3及動力蛋白輕鏈1（DLC1）結合來得到證實。它們與Kibra的結合位點位于羧基端富含谷氨酸序列。在乳腺癌細胞中，去除Kibra與組蛋白結合區(qū)抑制雌激素受體α的反式激活。9、DDR1ADDINNE.Ref.{65DD2CB7-68F7-4F52-A156-42C3ACAC66E1}[19]，Kibra還與絡氨酸激酶受體（DDR1）結合調(diào)節(jié)細胞的轉錄。五PKC的結構蛋白激酶C（PKC）是一個含有多種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，在調(diào)節(jié)細胞的分化、存活、增殖等方面發(fā)揮了重要作用，是細胞內(nèi)許多信號轉導通路的關鍵組成部分。PKC家族根據(jù)其結構和激活方式的不同分為3種類型ADDINNE.Ref.{672AA399-2EC1-42CB-BFAF-980AF00C6E01}[20]：經(jīng)典型PKC（classicalPKC、cPKC）其下的亞型有α，βⅠ，βⅡ，γ；新型PKC（novelPKC、nPKC），它的亞型有δ、ε、η、θ；以及非典型PKC（atypicalPKC、aPKC）包含有ζ、λ/ι、PKMζ三種亞型。同時依據(jù)是否對存在Ca2+依賴，分為Ca2+依賴亞型：PKCα和PKCβII以及Ca2+非依賴亞型：PKCδ和PKCε。它們的結構如圖3ADDINNE.Ref.{EEACF676-090C-4534-8ED3-2AD015551A93}[21]。圖3這三種蛋白激酶cPKC、nPKC、aPKCC端都有一個相對保守的激酶結構域，N端有一個調(diào)節(jié)區(qū)，根據(jù)調(diào)節(jié)區(qū)的拓撲結構的不同把蛋白激酶歸為不同的類型。cPKC有一個磷脂結合區(qū)和Ca離子結合區(qū)及富含半胱氨酸的二個鋅指結構域，因此cPKC可以被二酰甘油（DAG）（磷脂酶C即PLC通過膜磷脂產(chǎn)生三羧甲基氨基甲烷磷酸肌醇IP3及DAGADDINNE.Ref.{C2FED616-C80F-406F-A9C7-64D87CEF9027}[20]）和Ca離子激活；nPKC不含Ca離子結合區(qū)，故對Ca離子不敏感，與cPKC相似的是它們都可以被佛波酯激活ADDINNE.Ref.{D63AC718-A673-43F7-A1C4-1CD23127C21D}[22]，原因在于它們調(diào)節(jié)區(qū)有雙鋅指結構域的存在ADDINNE.Ref.{15EB8CD6-DDB3-4CD8-97A7-E166A52DC63C}[23]。與前二者相反的是，aPKC由于缺乏Ca離子結合區(qū)，也只有一個鋅指結構域，所以它對Ca離子和佛波酯都不敏感。除此之外，aPKC還含有一個假底物結合區(qū)域（PB1），該區(qū)可以識別其他蛋白質的OPCA模體。在aPKC未激活狀態(tài)下，PB1與自身激酶結構域結合。六PKC的激活機制PKC的激活機制是通過兩個過程完成的，即PS從底物結合位置脫落和激酶結構域的磷酸化ADDINNE.Ref.{2EACF9C7-3A5C-4E71-BA73-4A10A60D7A8A}[24]。1、在PS從底物位點脫落過程中一些脂類發(fā)揮了重要作用。這些脂類代謝產(chǎn)物如二酰甘油，導致PS從激活位點脫落，PKC處于活化狀態(tài)。從而使其它蛋白結合到底物結合區(qū)，繼而發(fā)生磷酸化。PKCζ還可以被另一些脂類激活，如磷脂酰肌醇類ADDINNE.Ref.{961AB426-37B9-4E6D-BEED-57698CE1036D}[25]、磷脂酸ADDINNE.Ref.{4ACC38AE-17D3-4B36-9C7F-66439F2435ED}[26]、花生四烯酸以及神經(jīng)酰胺ADDINNE.Ref.{ADCAEF67-1862-4719-A6FA-6D58F6FF4B4B}[27]。在這些脂類中，PIP3（三羧甲基氨基甲烷磷酸肌醇）是調(diào)節(jié)PKCζ的中心環(huán)節(jié)。NaKanishi研究發(fā)現(xiàn)PIP3的合成刺激PKCζ的自我磷酸化，PKCζ的磷酸化是aPKC活化的所必需的。進一步說明aPKC同時也受PI3K（磷脂酰肌醇3-激酶）的調(diào)節(jié)，因為在生長因子介導下，PI3K通過磷脂酰肌醇4、5-二磷酸產(chǎn)生PIP3ADDINNE.Ref.{7AC0D4BD-A69D-4512-9015-0AB317FCB100}[25]。另外，在大鼠的3Y1細胞，在表皮生長因子、血小板來源的生長因子刺激下，誘導P110（P110為PI3K的催化亞基）的過度表達，可以增強PKCλ/ι的活性ADDINNE.Ref.{A9585C70-7340-42E7-8D46-AAE79EB38341}[28]。在活細胞里，如脂細胞、單核細胞，PKCζ和PKCλ/ι的活性也受PI3K的調(diào)節(jié)ADDINNE.Ref.{A046FE02-C150-44F7-8633-9CBCDED421C0}[29]。PIP3與aPKC的相互作用：PIP3直接與含有PH（普列克底物蛋白同源物）的結構域的分子結合，如：PKB、PDK1。其中PDK1的PH結構域與PIP3有更高的親和力ADDINNE.Ref.{A4637851-6C82-4435-8FBF-12125F98DB56}[30]。PDK1與PIP3結合后被激活，粘附在AGC激酶（包括蛋白激酶A、C、G）的疏水區(qū)，以至于在每個激活回路上的蘇氨酸殘基被磷酸化ADDINNE.Ref.{87C6D509-5AB1-492C-8B3C-B63712CEDE1E}[31]。aPKC疏水區(qū)包括一小段序列，苯丙氨酸-谷氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-谷氨酸-酪氨酸，這段小序列與PDK1和PKC相關蛋白激酶連接位點相似ADDINNE.Ref.{9C0E8E84-2780-48F3-AFBB-C633856C4A4F}[32]，在PKCζ的激活回路上，蘇氨酸-410位點被PDK1磷酸化ADDINNE.Ref.{636682DA-C57D-4570-997F-9390B1678320}[33]。在胚胎干細胞基因水平上使PDK1缺乏，PKCζ的蘇氨酸-410并沒有被磷酸化，顯著的說明PKCζ是PDK1的生理性底物。若PKCζ的蘇氨酸-410突變成丙氨酸，則失去酶活性，若突變成谷氨酸，模仿蘇氨酸被磷酸化，使酶保持活性ADDINNE.Ref.{40F6E10E-DF5F-44C1-B5D5-ABE2CE717FB5}[34]，這些表明蘇氨酸-410磷酸化對維持PKCζ的活性是至關重要的。所以，PIP3作用于PKCζ的活化有2種方式：1、對PS存在的自我抑制的調(diào)節(jié)；2、通過PDK1磷酸化激酶位點的間接調(diào)節(jié)，這二種方式對活化PKCζ都是必須的。2、激酶位點的磷酸化：蘇氨酸-560是PKCζ活化開關基序的一個關鍵殘基。研究證明，PKCζ的蘇氨酸-410突變后PKCζ可以進行自我磷酸化，而蘇氨酸-560突變后不能進行自我磷酸化，說明蘇氨酸-560是PKCζ進行自我磷酸化的唯一位點ADDINNE.Ref.{D17A7DC3-0DF7-4F6A-B3E1-1408E922AF53}[35]。具體PKCζ的蘇氨酸-560是自己自我調(diào)節(jié)進行磷酸化還是與其他蛋白分子相互作用進行的磷酸化尚不明了。七aPKC的功能1、參與分裂原活化的蛋白激酶級聯(lián)反應（MAPK）一些研究表明，在各種細胞中，PKCζ參與MAPK級聯(lián)反應ADDINNE.Ref.{35830F80-A163-4AEC-9A6D-38B2937F5300}[36-39]。在被腫瘤壞死因子及血清刺激過的猴COS細胞，一個活性突變的PKCζ活化MAPK激酶MEK1和ERK1（細胞外相關酶），但是PKCζ-kn突變型不會產(chǎn)生上述結果。在甲狀腺細胞，野生型PKCζ的過度表達激活ERK1和ERK2，增加EIK1的轉錄活性，EIK1是ERK1和ERK2的靶分子，而甲狀腺刺激素不會發(fā)揮這種效應。在人肺泡巨噬細胞，脂多糖激活MEK1、ERK1和ERK2但不激活Raf1，在這個基礎上，內(nèi)源性PKCζ被激活從而與MEK1發(fā)生聯(lián)系。PKCζ-PS多肽抑制PKCζ阻斷脂多糖的效應，這些說明PKCζ的功能主要是作為MEK1的激酶，但是在Raf1通道中是獨立的。另外，PKCζ在MEK5-ERK5通路中發(fā)揮了一個連接器的功能。它連接EGF和MEK5結合，從而增加MEK5的活性。2、參與受體信號復合物到NFκB轉錄因子的活化從細胞生長及存活的信號中，細胞外配體如TNF-α、IL-1、NGF，來自受體復合物的信號通道的調(diào)節(jié)到轉錄因子介導的目的基因的表達如NFκB，NFκB對這些因子起到了非常重要的作用。NFκB在細胞的生存和分化中起到了關鍵性的作用，特別是在細胞免疫和炎癥方面ADDINNE.Ref.{A021C8D0-80C8-42A9-AA20-437D1FB03F10}[40]。PKCζ-kn阻止NFκB對這些因子的刺激，顯示PKCζ在TNF-α、IL-1信號轉導中參與NFκB的活化ADDINNE.Ref.{6B44A02D-7BAF-45BB-AD19-974F101404ED}[41,42]。而PKCζ對這些因子的相互機制是通過ZIP/P62來實現(xiàn)的ADDINNE.Ref.{EE83B046-D76A-427F-90DC-2B60BFA463E1}[43]，ZIP/P62作為一個連接器將PKCζ連接到這些因子受體復合物表面，從而讓這些因子發(fā)揮它們的相應的作用。PKCζ還可以通過構象改變導致NFκB的活化。另外，Par4（凋亡前體蛋白前列腺雄激素敏感因子-4）作為一個可以結合aPKC所有亞型的分子，抑制aPKC的活性ADDINNE.Ref.{3AD18E77-7E8F-48FC-BB1C-24FAD3B883CB}[44]。研究表明，Par4參與到細胞凋亡中ADDINNE.Ref.{B75E30B8-8DC6-48BE-BEDE-903953917AFC}[45]，而且，Par4的過度表達抑制NFκB的激活從而促進細胞的凋亡ADDINNE.Ref.{3814C1AD-82C4-4EA0-873C-3124D3A991EA}[46]，由此可見，Par-4/PKCz/NF-kB軸是控制腫瘤的發(fā)生發(fā)展的關鍵因素?？傊?，aPKC把信號從TNF-a受體，IL-1，NGF轉到NFκB的激活位點，它們參與到一系列的信號通道中，從受體復合物到轉錄因子激活后目的基因的表達ADDINNE.Ref.{2FF8C137-2A7B-441A-AA80-A41B14C8EDB5}[47]。3、P70S6激酶信號及級聯(lián)反應P70核糖體S6蛋白激酶（P70S6K），在有絲分裂素作用下被磷酸化和激活。對編碼核糖體蛋白和翻譯延長因子的一整套mRNAs的翻譯進行調(diào)節(jié)。研究表明，PKCλ/ι與P70S6K有直接的關系，在活細胞，PKCλ/ι的顯性失活抑制P70S6K血清誘導的活性ADDINNE.Ref.{26BB7000-4874-4F26-B318-EC286427E708}[48]。PKCζ-kn拮抗由EGF、PDK1、PI3K對P70S6K的激活。在生長因子不存在的情況下，體內(nèi)P70S6K與PDK1、PKCζ有關聯(lián)，P70S6K是AGC激酶中的一個成員，在激活回路的蘇氨酸-229和疏水端蘇氨酸-389分別被磷酸化而激活。有活性的PKCζ協(xié)調(diào)增強這些殘基的磷酸化，從而誘導P70S6K的活化時間的延長ADDINNE.Ref.{B6FD444B-42AF-4663-9EFF-6DC083E780EE}[49]。因此aPKCs對P70S6K的活化發(fā)揮了重要的作用，但是在活性的PKCζ作用下，僅僅增強蘇氨酸-389殘基的磷酸化，不足以完全激活P70S6KADDINNE.Ref.{DC79630B-D153-4357-891E-FB26866CAF08}[49]，它需要與多種信號分子如PKB一起作用才可以完全活化P70S6K。4、細胞極性細胞極性是所有正常細胞所擁有的一種基本特性，覺得細胞形態(tài)的胞質分子的不對稱分布，細胞極性的建立是組織發(fā)育至關重要的一步，細胞極性的喪失可導致腫瘤的發(fā)生。研究表明PAR-3、PAR-6、PKCζ或PKCλ形成三元復合物對細胞極性的建立非常重要ADDINNE.Ref.{C25CA642-BA95-4920-88A1-9461CBC82C29}[50,51]，它們控制細胞間緊密連接的形成。而PKCζ-kn與PKCλ-kn擾亂ZO-1的定位ADDINNE.Ref.{FEEF6A57-4360-4D2F-B100-A28BAE41E9FF}[52]（ZO-1是緊密連接的成分），更為重要的是，PKCζ中的PB1結構中的Asp殘基對緊密連接結構完整性是關鍵性的，除了內(nèi)皮細胞外，PKCζ還控制遷移中的星形細胞的極性。三元復合體PAR-3/ASIP-PAR6-aPKC在其他類型細胞的極化中起到了基礎作用。在神經(jīng)細胞中，F(xiàn)EZ1對軸突發(fā)育的延長是很重要的，在一定的條件下，F(xiàn)EZ1和PKCζ共同刺激樹突的延長ADDINNE.Ref.{27AD357F-C72C-4CD3-85D8-CB25A3A41548}[53]，但是FEZ1單獨存在時不能產(chǎn)生這種作用。FEZ1被PKCζ磷酸化后從細胞膜轉移到細胞質里ADDINNE.Ref.{574C7826-ED3E-4332-886E-9B59905CCF4C}[53]。PSD-ZIP70，位于突觸后密度和樹突棘中，與FEZ1有很大的同源性ADDINNE.Ref.{9CAE4CE2-539F-47E2-92C3-11951A794145}[54]。PKCζ與FEZ1/PSD-ZIP70在神經(jīng)突觸的延長及突觸后結構的維持中發(fā)揮了重要作用，而且，腫瘤抑制基因8p22，在食道癌，前列腺癌，乳腺癌中編碼FEZ1ADDINNE.Ref.{D65E9330-5C66-4AC3-8CF1-A879CB347782}[55]，在內(nèi)皮細胞中FEZ1與微觀