11.220

41DB22 22/T

3366—2022牛中華泰勒蟲病檢測(cè)PCR

吉林省市場監(jiān)督管理廳

DB22/T

2022前 言本文件按照

GB/T

1.1-2020

定起草。DB22/T

2022牛中華泰勒蟲病檢測(cè) PCR

法

本文件規(guī)定了牛中華泰勒蟲病PCR檢測(cè)方法的試劑或材料、儀器設(shè)備、樣品、試驗(yàn)步驟、結(jié)果判定

GB

19489實(shí)驗(yàn)室

theileria

中華泰勒蟲(Theileria

sinensis)寄生于牛的紅細(xì)胞和白細(xì)胞中，以發(fā)熱、貧血、黃疸及體表淋巴結(jié)

dNTP（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）。

DNA

Marker

分子量標(biāo)準(zhǔn)。

50

加樣緩沖液見附錄

A.2。

10

mg/mL

A.3。

1%瓊脂凝膠見附錄

A.4。

陽性對(duì)照見附錄

A.5。DB22/T

20224.1.10

陰性對(duì)照見附錄

A.6。4.1.11

質(zhì)粒

DNA

B。4.1.12

4.1.13

4.2

PCR反應(yīng)引物序列與濃度見表

1。

PCR

PCR

℃～100

低溫高速離心機(jī)，12

000

r/min

高壓滅菌器，120

電泳儀，電壓

V～300

V；電流

mA～400

mA。

微量移液器，單道

L、20

L。

6.1

6.2

Taq

DB22/T

2022

反應(yīng)體系見表

2。

PCR

在試樣

PCR

反應(yīng)的同時(shí)，以無菌雙蒸水作為空白對(duì)照，并設(shè)置陰性對(duì)照和陽性對(duì)照，各對(duì)照

PCR

95

變性

延伸

60

30

7.3

將所有樣品、陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照的PCR產(chǎn)物按編號(hào)加入到1%瓊脂糖凝膠板的各孔中，將凝膠的邊孔中加入DNA

Marker

分子量標(biāo)準(zhǔn)（4.1.4），將凝膠在

150

恒定電壓下電泳30

min后，

空白對(duì)照、陰性對(duì)照無擴(kuò)增條帶，陽性對(duì)照出現(xiàn)

887

bp的特異性條帶，試驗(yàn)成立，否則應(yīng)重新檢

若被檢樣品出現(xiàn)

887

DB22/T

2022

0.5

TAE緩沖液（50

TAE緩沖液（50

A.2。

10

10

DB22/T

2022

10

冷卻到

50

左右，加入

10

mg/mL

溴化乙錠

10

μL，搖勻，倒入電泳板上，凝固后，4

備用。1%瓊脂糖凝膠的制備見表

A.5。

以未感染中華泰勒蟲牛血液提取的

DNA

DB22/T

2022

a) 按血液基因組

DNA

DNA；b) 應(yīng)用牛中華泰勒蟲

MPSP

PCR

887

bpc)

d)

Solution

PCR

管中，充分混勻，

16

h；e)

10

50

DH5

30

min，42

70

s，冰浴冷刺激

200

無抗性

LB

37

后，涂布于含有

Amp

LB

培養(yǎng)

12

h；f)

質(zhì)粒

DNA

DNA；g)