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文檔簡介
11.220
41DB22 22/T
3366—2022牛中華泰勒蟲病檢測PCR
吉林省市場監(jiān)督管理廳
DB22/T
2022前 言本文件按照
GB/T
1.1-2020
定起草。DB22/T
2022牛中華泰勒蟲病檢測 PCR
法
本文件規(guī)定了牛中華泰勒蟲病PCR檢測方法的試劑或材料、儀器設(shè)備、樣品、試驗步驟、結(jié)果判定
GB
19489實驗室
theileria
中華泰勒蟲(Theileria
sinensis)寄生于牛的紅細胞和白細胞中，以發(fā)熱、貧血、黃疸及體表淋巴結(jié)
dNTP（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）。
DNA
Marker
分子量標(biāo)準。
50
加樣緩沖液見附錄
A.2。
10
mg/mL
A.3。
1%瓊脂凝膠見附錄
A.4。
陽性對照見附錄
A.5。DB22/T
20224.1.10
陰性對照見附錄
A.6。4.1.11
質(zhì)粒
DNA
B。4.1.12
4.1.13
4.2
PCR反應(yīng)引物序列與濃度見表
1。
PCR
PCR
℃～100
低溫高速離心機，12
000
r/min
高壓滅菌器，120
電泳儀，電壓
V～300
V；電流
mA～400
mA。
微量移液器，單道
L、20
L。
6.1
6.2
Taq
DB22/T
2022
反應(yīng)體系見表
2。
PCR
在試樣
PCR
反應(yīng)的同時，以無菌雙蒸水作為空白對照，并設(shè)置陰性對照和陽性對照，各對照
PCR
95
變性
延伸
60
30
7.3
將所有樣品、陽性對照、陰性對照和空白對照的PCR產(chǎn)物按編號加入到1%瓊脂糖凝膠板的各孔中，將凝膠的邊孔中加入DNA
Marker
分子量標(biāo)準（4.1.4），將凝膠在
150
恒定電壓下電泳30
min后，
空白對照、陰性對照無擴增條帶，陽性對照出現(xiàn)
887
bp的特異性條帶，試驗成立，否則應(yīng)重新檢
若被檢樣品出現(xiàn)
887
DB22/T
2022
0.5
TAE緩沖液（50
TAE緩沖液（50
A.2。
10
10
DB22/T
2022
10
冷卻到
50
左右，加入
10
mg/mL
溴化乙錠
10
μL，搖勻，倒入電泳板上，凝固后，4
備用。1%瓊脂糖凝膠的制備見表
A.5。
以未感染中華泰勒蟲牛血液提取的
DNA
DB22/T
2022
a) 按血液基因組
DNA
DNA；b) 應(yīng)用牛中華泰勒蟲
MPSP
PCR
887
bpc)
d)
Solution
PCR
管中，充分混勻，
16
h；e)
10
50
DH5
30
min，42
70
s，冰浴冷刺激
200
無抗性
LB
37
后，涂布于含有
Amp
LB
培養(yǎng)
12
h；f)
質(zhì)粒
DNA
DNA；g)
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