第二章谷氨酸發(fā)酵機制第一節(jié)谷氨酸的生物合成途徑谷氨酸的生物合成包括酵解途徑(EMP)、磷酸戊糖途徑(HMP途徑)、三羧酸循環(huán)(TCA循環(huán))、乙醛酸循環(huán)、伍德－沃克曼反應(CO2固定反應等)。一、生成谷氨酸的主要酶促反應（1）谷氨酸脫氫酶(GHD)所催化的還原氨基化反應α-酮戊二酸＋NH4+＋NADPH2谷氨酸＋H2O+NADPGHD這一反應是利用已存在的其他氨基酸，經(jīng)過轉氨酶的作用，將其它氨基酸與

-酮戊二酸生成L－谷氨酸。(2)轉氨酶(AT)催化的轉氨反應COOHC=OCH2CH2COOH+COOHCHNH2R轉氨酶COOHCHNH2CH2CH2COOH+COOHRC=Oα酮戊二酸氨基酸谷氨酸α-酮酸(3)谷氨酸合成酶(Gs)催化的反應NADPα-酮戊二酸+谷氨酰胺GSNADPH22谷氨酸二、谷氨酸生物合成的理想途徑由葡萄糖發(fā)酵谷氨酸的理想途徑※第二節(jié)谷氨酸生物合成的調節(jié)機制1、優(yōu)先合成2、反饋調節(jié)一、優(yōu)先合成與反饋調節(jié)二、糖代謝的調節(jié)三、氮代謝的調節(jié)四、其它調節(jié)

④

-酮戊二酸脫氫酶在谷氨酸產生菌中先天性地喪失或微弱。

⑤磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的調節(jié)。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶受天冬氨酸的反饋抑制，受谷氨酸和天冬氨酸的反饋阻遏。乙酰CoA檸檬酸草酰乙酸琥珀酸α-酮戊二酸異檸檬酸蘋果酸乙醛酸

①①檸檬酸合成酶②磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶③丙酮酸羧化酶④丙酮酸激酶延胡索酸②磷酸烯醇式丙酮酸

丙酮酸

乙酰CoA葡萄糖

CO2③④⑥Asp谷氨酸??谷氨酸生產菌的育種思路

在菌體的代謝中，谷氨酸比天冬氨酸優(yōu)先合成。谷氨酸合成過量后，谷氨酸抑制谷氨酸脫氫酶的活力和阻遏檸檬合成酶的合成。使代謝轉向天冬氨酸的合成；天冬氨酸合成過量后，反饋抑制磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的活力，停止草酰乙酸的合成。所以在正常情況下，谷氨酸并不積累。二、糖代謝的調節(jié)1、能荷控制(細胞內的能量水平)能量生成代謝系的調節(jié)2．生物素對糖代謝的調節(jié)(1)生物素對糖代謝速度的影響生物素對糖代謝的影響主要是影響糖解速度。

在生物素充足條件下，由于糖降解速度顯著提高，打破了糖降解速度與丙酮酸氧化速度之間的平衡，丙酮酸趨于生成乳酸，因而會引起乳酸的溢出。(2)生物素對CO2固定反應的影響①由磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶催化的反應②由丙酮酸羧化酶催化的反應③先由蘋果酸酶所催化，進行還原羧化作用，生成蘋果酸。然后再生成草酰乙酸：生物素是丙酮酸羧化酶的輔酶，參與CO2的固定反應。據(jù)有關資樹報道，生物素大過量(100

g／L以上)，CO2固定反應可提高30％。(3)生物素對乙醛酸循環(huán)的影響乙醛酸循環(huán)中關鍵酶是異檸檬酸裂解酶和蘋果酸合成酶。①異檸檬酸裂解酶催化的反應②蘋果酸合成酶催化的反應乙醛酸循環(huán)的關鍵酶異檸檬酸裂解酶受葡萄糖、琥珀酸阻遏，為醋酸所誘導。以葡萄糖為原料發(fā)酵生產谷氨酸時，通過控制生物素亞適量，幾乎看不到異檸檬酸裂解酶的活性。

原因：①丙酮酸氧化能力下降，醋酸的生成速度慢，所以為醋酸所誘導形成的異檸檬酸裂解酶就很少。②由于該酶受琥珀酸阻遏，在生物素亞適量條件下，因琥珀酸氧化能力降低而積累的琥珀酸就會反饋抑制該酶的活性，并阻遏該酶的生成，乙醛酸循環(huán)基本上是封閉的。這樣就使代謝流向異檸檬酸

－酮戊二酸

谷氨酸的方向高效率地移動。三、氮代謝的調節(jié)控制谷氨酸發(fā)酵的另外一個關鍵因素就是降低蛋白質的合成能力，使合成的谷氨酸不去轉化成其它氨基酸和參與蛋白質的合成。①生物素亞適量時，幾乎沒有異檸檬酸裂解酶，琥珀酸氧化力弱，蘋果酸和草酰乙酸脫羧反應停滯，同時又由于完全氧化降低的結果，使ATP形成量減少，導致蛋白質合成活動停滯，在銨離子適量存在下，積累谷氨酸。生成的谷氨酸也不通過轉氨作用生成其它氨基酸和合成蛋白質。②生物素充足時，異檸檬酸裂解酶的活性增強，琥珀酸氧化力增強，丙酮酸氧化力加強，乙醛酸循環(huán)的比例增加。草酰乙酸、蘋果酸脫羧反應增強，蛋白質合成增強，谷氨酸減少，合成的谷氨酸通過轉氨作用生成的其它氨基酸量增加。在生物素充足與缺乏條件下異檸檬酸代謝途徑生物素充足條件下生物素缺乏條件下?四、其它調節(jié)除了上述調節(jié)機制外，發(fā)現(xiàn)在以醋酸或石蠟為碳源時，銅離子對谷氨酸的生物合成具有調節(jié)作用。在以醋酸為碳源，利用一種短桿菌D248進行谷氨酸發(fā)酵時，添加低濃度的銅離子，可以促進谷氨酸的積累。利用石蠟節(jié)桿菌KY4303菌株以石蠟為碳源，在青霉素存在下培養(yǎng)，則銅離子可促進海藻糖和谷氨酸的生物合成。1、谷氨酸發(fā)酵中的生物素問題

……發(fā)酵通訊科技第32卷第1期2003年2月2、谷氨酸發(fā)酵中生物素含量的測定

……發(fā)酵通訊科技第32卷第2期2003年2月3、谷氨酸的代謝控制發(fā)酵育種……發(fā)酵通訊科技第32卷第2期2003年2月

張克旭(天津科技大學食品科學與生物工程學院)谷氨酸發(fā)酵中的生物素問題生物素用量多少，將影響到谷氨酸的產量。它的影響大體可歸納為三方面：一、影響糖降解的速度。二、改變發(fā)酵代謝方向。三、控制脂肪酸生物合成當培養(yǎng)基中生物素處于過量時，①糖降解速度加快，糖至丙酮酸一段增加速度大于丙酮酸向下氧化速度，動態(tài)生物平衡被破壞。②異檸酸裂解酶加強，反應沿著乙醛酸循環(huán)進行，代謝處于完全氧化型。完全氧化型代謝③過量生物素催化脂肪酸合成，進而生成足夠量磷脂，使細胞形成比較完善的細胞膜，細胞膜滲透性差，使細胞內合成谷氨酸不能及時滲透到細胞外，引起谷氨酸合成過程中的產物反饋抑制?！蘖可锼貢r，有利于谷氨酸生產并在體外積累大量的谷氨酸。利用微生物法，通過生物素的梯度濃度，找出其與谷氨酸菌的生長量(即OD值)，在一定范圍內的線性關系，可繪制出生物素的標準曲線，待測樣經(jīng)稀釋后，培養(yǎng)12h，從已知OD值曲線中找出對應的谷氨酸含量。第三節(jié)在谷氨酸發(fā)酵中怎樣控制細胞膜的滲透性

在谷氨酸發(fā)酵的過程中，關鍵之一在于發(fā)酵培養(yǎng)期間谷氨酸生產菌的細胞膜的結構與功能上的特異性變化，使細胞膜轉變成有利于谷氨酸向膜外滲透的式樣，即完成谷氨酸非積累型細胞向谷氨酸積累型細胞的轉變。這樣，由于終產物谷氨酸不斷的排出細胞外，使細胞內的谷氨酸不能積累到引起反饋調節(jié)的濃度。引言第一、控制細胞膜的滲透性的方法通過控制發(fā)酵培養(yǎng)基中的化學成分，達到控制磷脂、細胞膜的形成、或者阻礙細胞壁的正常的生物合成，使谷氨酸生產菌處于異常的生理狀態(tài)，以解除細胞對谷氨酸向胞漏出的滲透屏障。

※一、控制磷脂的合成，導致形成磷脂合成不足的不完全的細胞膜※a、生物素缺陷型（使用生物素缺陷型菌種進行生產的時候，必須控制生物素的用量）1．作用機制生物素作為催化脂肪酸生物合成最初反應的關鍵酶乙酰輔酶A羧化酶的輔酶，參與了脂肪酸的合成，進而影響磷脂的合成。當磷脂合成減少到正常量的1/2左右時，細胞變形，谷氨酸向膜外漏出，積累于發(fā)酵液中。2．控制的關鍵為了形成有利于谷氨酸向外滲透的磷脂合成不足的細胞膜，必須亞適量控制生物素（5－10微克/升）發(fā)酵初期（0－8小時），菌體正常生長，菌體形態(tài)為單個、成對、八字形、棒狀、橢圓，短桿形。當生物素耗盡后，在菌體的再次倍增期間，開始出現(xiàn)異常形態(tài)的細胞，菌體伸長、膨大乃至不規(guī)則形，邊緣有褶皺。完成谷氨酸非積累型細胞向谷氨酸積累型細胞的轉變。如果生物素過剩，就會出現(xiàn)只是長菌而不產酸的現(xiàn)象或者長菌好而產酸低?！鵥．添加表面活性劑（吐溫60）或者飽和脂肪酸使用生物素過量的糖蜜原料發(fā)酵生產谷氨酸時，通過添加表面活性劑或者高級飽和脂肪酸（C16-18）及其親水聚醇酯類，同樣能清除滲透屏障物，積累谷氨酸。1．作用機制表面活性劑和飽和脂肪酸的作用，并不是在于他的表面效果，而是在不飽和脂肪酸的合成過程中，作為抗代謝物具有抑制作用，對生物素有拮抗作用。通過拮抗生物素的生物合成，導致磷脂合成不足，結果形成磷脂不足的細胞膜。提高了細胞膜對脂肪酸的滲透性。

2．影響產酸的關鍵必須控制好添加表面活性劑、不飽和脂肪酸的時間與濃度，必須在藥劑添加之后，在這些藥劑存在下，再次進行菌的分裂增值。形成處于異常生理狀態(tài)的產酸型細胞，即完成谷氨酸非積累型細胞向谷氨酸積累型細胞的轉變。例如：以甜菜糖蜜為原料，采用高生物素、高吐溫的工藝，一般發(fā)酵對數(shù)生長期的早期（4－6小時），添加0.2％吐溫60后OD值與菌體重約凈增一倍。剩余生長太多，意味著谷氨酸生產菌的細胞不能完成有效的進行生理學變化；剩余生長不足，意味著谷氨酸生產菌沒有機會完成這種轉變。

※C.油酸缺陷型

使用油酸缺陷型菌株進行谷氨酸發(fā)酵時，必須限制發(fā)酵培養(yǎng)基中油酸的濃度1、作用機制由于油酸缺陷型突變株切斷了油酸的后期合成，喪失了自身合成油酸的能力；即喪失了脂肪酸生物合成的能力，必須由外界供給油酸，才能生長。故油酸的多少，直接影響到磷脂合成量的多少和細胞膜的滲透性。通過控制油酸，使磷脂合成量減少到正常量的1/2左右時，細胞變形，谷氨酸分泌積累于培養(yǎng)液中。2．控制的關鍵對油酸缺陷型突變株的谷氨酸生產力來說，最重要的因子是細胞內的油酸含量，必須控制油酸亞適量，而細胞內生物素、棕櫚酸等飽和脂肪酸的含量多少卻影響甚微。若油酸過量時，只長菌不產酸，或者長菌好而產酸低，只有在油酸亞適量的情況下，當油酸耗盡之后，谷氨酸菌經(jīng)再度倍增，發(fā)生細胞膜結構與功能上的特異性變化，除去谷氨酸向膜外滲透的障礙物，谷氨酸才能高產?！鵧．甘油缺陷型

使用甘油缺陷型菌株進行谷氨酸發(fā)酵時，必須限制發(fā)酵培養(yǎng)基終甘油的濃度1．作用機制甘油缺陷型的菌株喪失

-磷酸甘油脫氫酶，即喪失L-甘油3磷酸NADP氧化還原酶。所以必能合成

-磷酸甘油和磷脂，必須由外界供給甘油才能生長。在甘油限量供應下，由于控制了細胞膜中與滲透性直接關系的磷脂含量，使谷氨酸得以積累。

2．控制的關鍵使用甘油缺陷型菌株進行谷氨酸發(fā)酵的生產時，為了高產谷氨酸，必須控制添加亞適量的甘油或甘油衍生物。這樣，不管是用醋酸,還是糖質原料，不管添加還是不添加生物素、油酸、硫氨素等物質，都能高產谷氨酸。這是由甘油缺陷型所控制的位置決定的。細胞內的磷脂可以由添加甘油的數(shù)量來調節(jié)，添加甘油過少，菌株生長不好，數(shù)量不夠，周期長。甘油過量，磷脂合成正常，只長菌不產酸，或者長菌好產酸低；只有亞適量的控制甘油的時候，開始菌體正常生長，當甘油耗盡后，通過再度增殖，細胞變形。細胞磷脂的含量變?yōu)橛H株的一半。壓榨細胞的體積變小，從而破壞了細胞膜對谷氨酸的滲透屏障，使谷氨酸向膜外滲漏。

※二、阻礙谷氨酸菌細胞壁的合成，形成不完全的細胞壁，進而導致形成不完全的細胞膜

例如，在發(fā)酵對數(shù)生長期的早期，添加青霉素或者頭胞霉素C等抗生素1、作用機制添加青霉素是抑制谷氨酸生產菌細胞壁的后期合成，主要是抑制糖肽轉移酶，影響細胞壁糖肽的合成。2、影響產酸的關鍵在生長的什么階段添加青霉素是影響產酸的關鍵。必須要在增殖過程的適當時期添加，開始進入對數(shù)生長期的早期（3-6小時）添加，添加青霉素的時間與濃度，因菌種、接種量、培養(yǎng)基的組成以及發(fā)酵條件的不同而不同。加入青霉素后，在菌體倍增期間，使新增殖的細胞沒有充足的細胞壁合成，菌體形態(tài)急劇變化。多呈現(xiàn)伸張，膨潤的菌型。完成由非積累型谷氨酸向積累型谷氨酸的轉變。

※第二、物理控制方法

利用溫度敏感型細胞進行谷氨酸發(fā)酵時，由于僅僅控制溫度就能實現(xiàn)谷氨酸的生產，所以我們把這種新工藝稱為物理控制方法。

1、突變位置

這些突變株的突變位置是發(fā)生在決定與谷氨酸分泌有密切聯(lián)系的細胞膜的結構基因上，發(fā)生堿基的轉換或顛換，一個堿基為另一個堿基所置換，這樣為堿基所指導譯出的酶，在高溫時失活，導致細胞膜某些結構的改變。

（2）影響產酸的關鍵

利用溫度敏感型突變株進行谷氨酸發(fā)酵時，在生長的什么階段轉化溫度是影響產酸的關鍵。必須要控制好溫度轉換的時間。（由30度提高到40度的時間),并且要在溫度轉換之后，進行適度的剩余生長，溫度轉換的最適時間，因菌株、接種量、培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件而異。

以甘蔗糖蜜或甜菜糖蜜為原料生產時，一般在A562為0.3-0.5范圍內轉換溫度為宜。轉換時間不同，產酸顯著變化。在溫度轉移之后，必須要進行適度的剩余生長，完成從谷氨酸非積累型細胞向谷氨酸積累型細胞轉變。剩余生長太多，意味著細胞未能進行有效的生理學變化，剩余生長太少，意味著細胞沒有機會完成這種轉變。第三、強制控制工藝的要點和實例

為了穩(wěn)定產酸，克服因發(fā)酵培養(yǎng)基中某些營養(yǎng)不易控制（如生物素的含量）所造成的影響