紙片擴(kuò)散法藥敏試驗各位同學(xué)，大家好，今天我們來學(xué)習(xí)《微生物檢驗技術(shù)》中的紙片擴(kuò)散法藥敏實(shí)驗。首先，藥敏實(shí)驗是指通過模擬體內(nèi)環(huán)境條件，測試分離自病人體內(nèi)感染部位的病原菌對常規(guī)抗生素的敏感性，即抗生素對目標(biāo)細(xì)菌的抑制能力，從而預(yù)測抗生素治療效果的一種體外實(shí)驗方法。世界衛(wèi)生組織推薦的定性抗菌藥物敏感性實(shí)驗是紙片擴(kuò)散法，又稱為KB法，具有操作簡便、選藥靈活、費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)。一、KB法藥敏實(shí)驗的原理是將含有定量抗菌藥物的紙片貼在已接種測試菌的瓊脂平板上，紙片中所含的藥物吸收瓊脂中的水分，溶解后向紙片周圍擴(kuò)散。形成遞減的梯度濃度，在紙片周圍抑菌濃度范圍內(nèi)，測試菌的生長受抑制，從而形成無菌生長的透明圈，即抑菌圈。抑菌圈的大小反映了測氏菌對測定藥物的敏感程度，并與該藥物對測氏菌的最低抑菌濃度呈負(fù)相關(guān)。二、實(shí)驗所需的物品有1、培養(yǎng)基：為水解酪蛋白MH瓊脂，用于多數(shù)非苛養(yǎng)菌藥敏實(shí)驗。PH為7.2至7.4，瓊脂厚度為四毫米四攝氏度保存，使用前應(yīng)將平板置于35攝氏度溫箱孵育15分鐘，使其表面干燥。2、抗菌藥物紙片是直徑為6.35毫米，吸水量為20微升的專用藥敏紙片、藥敏紙片冷凍干燥后儲存于密封瓶內(nèi)，未開封的狀態(tài)可負(fù)20攝氏度儲存于無霜冰箱內(nèi)，已開封的日常工作用的少量紙片可保存于四攝氏度冰箱內(nèi)，一周內(nèi)用完。使用前將儲存藥敏紙片的容器移至室溫平衡一至二小時，避免開啟容器時產(chǎn)生冷凝水，使紙片潮堿。3、菌種，需使用臨床分離的純菌落，本次實(shí)驗我們采用的細(xì)菌是金黃色葡萄球菌。4、其他物品有酒精燈、無菌生理鹽水、0.5麥?zhǔn)媳葷峁?、無菌棉簽、鑷子、毫米直尺或游標(biāo)卡尺等。三、KB法藥敏實(shí)驗操作方法1、配置菌液：點(diǎn)燃酒精燈，用無菌棉簽挑取孵育18至24小時血平板等非選擇性平板上三至四個形態(tài)相同的單個菌落，將菌落置于0.9%無菌生理鹽水中混勻制成菌懸液。使用0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)比濁管校正，菌液濃度為0.5麥?zhǔn)蠁挝?，也可使用比濁儀校正。每毫升菌液中的細(xì)菌數(shù)量約為1.5乘以十的八次方菌落形成單位，注意校正濃度后的菌液應(yīng)在15分鐘內(nèi)接種完畢。2、接種：更換一根嶄新的無菌棉簽，蘸取配置好的細(xì)菌懸液。在試管內(nèi)壁旋轉(zhuǎn)，擠去多余菌液后，在MH瓊脂表面三個方向均勻涂布，接種三次。每次旋轉(zhuǎn)60度。最后沿平板內(nèi)圓涂抹一周。涂抹好菌液的平板至室溫放置三至五分鐘，使表面稍干，但不要超過15分鐘。3、貼抗菌藥物紙片，根據(jù)不同的菌株挑選相應(yīng)的抗菌藥物紙片。裝有紙片的容器應(yīng)與使用前一至二小時移出冰箱平衡室溫后才能使用。無菌鑷子置于火焰上消毒滅菌。夾取一張藥敏紙片，將抗菌藥敏紙片小心粘貼于涂步細(xì)菌的瓊脂表面。沾上后，用鑷尖輕輕按壓，使其與瓊脂表面貼緊。鑷子在使用前后應(yīng)過火焰消毒滅菌，注意各紙片中心距離應(yīng)大于24毫米，紙片距平板內(nèi)緣應(yīng)大于15毫米。紙片貼上后，抗菌藥物會自動擴(kuò)散到培養(yǎng)基內(nèi)，不可再移動，否則會影響抑菌圈的形態(tài)，從而影響實(shí)驗結(jié)果。4、孵育：藥敏紙片貼好后，應(yīng)在15分鐘內(nèi)將MH瓊脂平板倒置放入35攝氏度恒溫培養(yǎng)箱。注意，為了受熱均勻，MH瓊脂平板最好單獨(dú)平放，最多不超過兩個疊放，培養(yǎng)16至18小時后。觀察實(shí)驗結(jié)果。四、KB法藥敏實(shí)驗結(jié)果判定，1、用精確度為一毫米的直尺或游標(biāo)卡尺量取抑菌圈直徑，抑菌圈的邊緣應(yīng)是無明顯細(xì)菌生長的區(qū)域。2、先量取質(zhì)控菌株的抑菌圈直徑，以判斷質(zhì)控是否合格。3、然后量取實(shí)驗菌株的抑菌圈直徑。注意測量時需通過藥敏紙片的圓心。量取非顆氧菌抑菌圈多采用透射光。將平板對準(zhǔn)光源，以肉眼觀察無明顯細(xì)菌生長的區(qū)域為抑菌區(qū)域進(jìn)行量取，記錄結(jié)果時以毫米為單位。4、根據(jù)臨床實(shí)驗室標(biāo)準(zhǔn)