外源基因在大腸桿菌中的表達外源基因在大腸桿菌中的表達大腸桿菌作為表達外源基因受體菌的特徵

大腸桿菌表達外源基因的優(yōu)勢全基因組測序，共有4405個開放型閱讀框架基因克隆表達系統(tǒng)成熟完善繁殖迅速、培養(yǎng)簡單、操作方便、遺傳穩(wěn)定被美國FDA批準為安全的基因工程受體生物外源基因在大腸桿菌中的表達大腸桿菌作為表達外源基因受體菌的特徵

大腸桿菌表達外源基因的劣勢缺乏對真核生物蛋白質(zhì)的複性功能缺乏對真核生物蛋白質(zhì)的修飾加工系統(tǒng)內(nèi)源性蛋白酶降解空間構象不正確的異源蛋白細胞周質(zhì)內(nèi)含有種類繁多的內(nèi)毒素外源基因在大腸桿菌中的表達外源基因在大腸桿菌中高效表達的原理啟動子終止子核糖體結合位點密碼子質(zhì)?？截悢?shù)轉錄翻譯Ptac=3Ptrp=11Plac啟動子-35區(qū)序列-10區(qū)序列PlacTTTACATATAATPtrpTTGACATTAACTPtacTTGACATATAAT

PtraATAGACATAATGT

PlLTTGACA

GATACT

PrecATTGATA

TATAAT啟動子

轉錄調(diào)控機理

具有多順反子結構，基因排列次序為：啟動子（lacP）-操縱基因（lacO）-結構基因（lacZ-lacY-lacA）

正調(diào)節(jié)因數(shù)CAP

負調(diào)節(jié)因數(shù)

lacI啟動子Lac

表達系統(tǒng)以大腸桿菌lac操縱子調(diào)控機理為基礎設計、構建的表達系統(tǒng)

lacI

Plac

lacO

lacZlacYlacA高效轉錄cAMPCAPlacI

Plac

lacO

lacZlacYlacARNA聚合酶基底水準轉錄Lac

表達系統(tǒng)

正調(diào)節(jié)因數(shù)CAPcAMP啟動CAP，CAP–cAMP複合物與

lac

操縱子上專一位點結合後，能促進RNA聚合酶與–35、–10序列的結合，進而促進Plac

介導的轉錄。RNA聚合酶RNA聚合酶基因工程中使用的lac啟動子均為抗葡萄糖代謝阻遏的突變型，即PlacUV5

cAMP葡萄糖代謝cAMP濃度降低cAMPCAPCAPLac

表達系統(tǒng)

lacUV5突變體

PlacUV5突變體能夠在沒有CAP存在的情形下非常有效的起始轉錄，受它控制的基因在轉錄水準上只受

lacI的調(diào)控，因此用它構建的表達載體在使用時比野生型Plac更易操作。Lac

表達系統(tǒng)

負調(diào)節(jié)因數(shù)

lacI

在無誘導物情形下，

lacI

基因產(chǎn)物形成四聚體阻遏蛋白，與啟動子下游的操縱基因緊密結合，阻止轉錄的起始。lacI

Plac

lacO

lacZlacYlacARNA聚合酶基底水準轉錄lacI

Plac

lacO

lacZlacYlacA高效轉錄RNA聚合酶IPTGmRNATac

表達系統(tǒng)

tac啟動子是由

trp的–35序列和

lacUV5的–10序列拼接而成的雜合啟動子。

調(diào)控模式與lacUV5相似，但mRNA轉錄水準更高於

trp和lacUV5

啟動子（Ptac=3Ptrp=11Plac），因此在要求有較高基因表達水準的情況下，選用tac啟動子比用lacUV5啟動子更優(yōu)越。啟動子-35區(qū)序列-10區(qū)序列PlacTTTACATATAATPtrpTTGACATTAACTPtacTTGACATATAAT

lac、tac

啟動子對宿主菌的要求

在普通大腸桿菌中，LacI阻遏蛋白僅能滿足細胞染色體上lac操縱子轉錄調(diào)控的需要。

當多拷貝的

lacO隨著帶有l(wèi)acUV5、tac啟動子的表達質(zhì)粒轉化進入大腸桿菌後，LacI阻遏蛋白與lacO

的比例顯著下降，無法保證每一個lacO都能獲得足夠的LacI阻遏蛋白參與轉錄調(diào)控。表現(xiàn)為在無誘導物存在的情形下，lacUV5、tac啟動子有較高的本底轉錄。lac、tac

啟動子對宿主菌的要求為了使以Lac、Tac表達系統(tǒng)具有嚴緊調(diào)控外源基因轉錄的能力，一種能產(chǎn)生過量的LacI阻遏蛋白的lacI

基因的突變體lacIq

被應用於表達系統(tǒng)。大腸桿菌JM109等菌株的基因型均為lacIq

，常被選用為Lac、Tac

表達系統(tǒng)的宿主菌。

但是這些菌株也只能對低拷貝的表達載體實現(xiàn)嚴緊調(diào)控，在使用高拷貝複製子構建表達載體時，仍能觀察到較高水準的本底轉錄。

需在表達載體中插入lacIq

基因以保證有較多的LacI阻遏蛋白產(chǎn)生。lac、tac

表達系統(tǒng)存在的問題

IPTG用於誘導

lac、tac啟動子的轉錄，但由於IPTG本身具有一定的

毒性。從安全角度，對表達和製備用於醫(yī)療目的的重組蛋白並不適合。

一些國家規(guī)定在生產(chǎn)人用重組蛋白質(zhì)的生產(chǎn)工藝中不能使用IPTG

解決方法

lac

和tac啟動子的轉錄受溫度嚴緊調(diào)控乳糖替代IPTG誘導lac

和tac啟動子的轉錄lac、tac

表達系統(tǒng)存在的問題

lac

和tac啟動子的轉錄受溫度嚴緊調(diào)控

把阻遏蛋白LacI的溫度敏感突變體lacI(ts)、lacIq(ts)插入表達載體或整合到染色體後，均能使lac

和tac啟動子的轉錄受到溫度嚴緊調(diào)控在較低溫度（30℃）時抑制，在較高溫度（42℃）時開放。用乳糖替代IPTG誘導lac

和tac啟動子的轉錄乳糖在b-半乳糖苷酶作用下生成異乳糖，異乳糖具有誘導劑的作用這一過程涉及乳糖的轉運和轉化，其效率受到多種因素的影響和制約因此乳糖誘導的有效劑量大大高於IPTG。乳糖本身作為一種碳源可以被大腸桿菌代謝利用，較多的乳糖存在也會導致菌體生理及生長特性變化。乳糖替代lPTG作為誘導劑的研究要與發(fā)酵工藝結合起來，才能顯示其良好的前景。

轉錄調(diào)控機理色氨酸啟動子Ptrp受色氨酸-阻遏蛋白複合物的阻遏，轉錄呈基底狀態(tài)。在培養(yǎng)系統(tǒng)中去除色氨酸或者加入3-吲哚丙烯酸（IAA），便可有效地解除阻遏抑制作用。在正常的細菌培養(yǎng)體系中，除去色氨酸是困難的，因此基因工程中往往添加IAA誘導Ptrp

介導的目的基因表達啟動子Trp

表達系統(tǒng)以大腸桿菌trp操縱子調(diào)控機理為基礎設計、構建的表達系統(tǒng)

Trp

表達系統(tǒng)

Ptrp

OtrpRNA聚合酶基底水準轉錄高效轉錄mRNA

Ptrp

Otrp去除色氨酸高效轉錄mRNA

Ptrp

Otrp加入IAARNA聚合酶RNA聚合酶PL

和PR

表達系統(tǒng)

以l噬菌體早期轉錄啟動子PL、PR

為核心構建的表達系統(tǒng)

在野生型l噬菌體中，PL

、PR

啟動子轉錄與否決定了l

噬菌體進入裂解迴圈還是溶源迴圈。啟動子PL

和PR

表達系統(tǒng)

轉錄調(diào)控的機理由

l噬菌體PE

啟動子控制的cI基因的產(chǎn)物是PL、PR啟動子轉錄的阻遏物。cI基因的產(chǎn)物在大腸桿菌宿主中的濃度取決於一系列宿主與噬菌體因數(shù)之間的錯綜複雜的平衡關係。由於通過細胞因數(shù)來控制cI

基因產(chǎn)物的產(chǎn)生和消失是相當困難的。

因此PL、PR

表達系統(tǒng)都選用溫度敏感突變體cI857(ts)

的基因產(chǎn)物來調(diào)控PL、PR

啟動子的轉錄。

在較低溫度（30℃）時以活性形式存在在較高溫度（42℃）時失活脫落PL

和PR

表達系統(tǒng)宿主菌中沒有cI基因產(chǎn)物，PL、PR啟動子的高強度直接轉錄，帶有PL

或

PR啟動子的表達載體在普通大腸桿菌中相當不穩(wěn)定。

對宿主菌的要求

用溶源化

l噬菌體的大腸桿菌作PL、PR

啟動子表達載體的宿主菌

N4830-1，POP2136等菌株已經(jīng)溶源化cI857(ts)

l

噬菌體，可用作表達外源基因時的宿主菌。

把cI857(ts)

基因組裝在表達載體上宿主菌選擇範圍更大PL

和PR表達系統(tǒng)存在的問題

由於PL和

PR表達系統(tǒng)誘導時不加化學誘導劑，成本又低廉，最初幾個在大腸桿菌中製備的藥用重組蛋白質(zhì)都採用PL或

PR表達系統(tǒng)。

缺陷在熱脈衝誘導過程中，大腸桿菌熱休克蛋白的表達也會被啟動，其中一些是蛋白水解酶，有可能降解所表達的重組蛋白。在大體積發(fā)酵培養(yǎng)菌體時，通過熱平衡交換方式把培養(yǎng)溫度從30℃

提高到42℃需要較長的時間，這種緩慢的升溫方式影響誘導效果，對重組蛋白表達量有一定的影響。

T7表達系統(tǒng)大腸桿菌T7噬菌體具有一套專一性非常強的轉錄體系，利用這一體系中的元件為基礎構建的表達系統(tǒng)稱為T7表達系統(tǒng)。T7表達系統(tǒng)

T7噬菌體基因1編碼的T7RNA聚合酶選擇性的啟動T7噬菌體啟動子的轉錄。

T7RNA聚合酶活性高，其合成RNA的速度比大腸桿菌RNA聚合酶快5倍左右。並可以轉錄某些不能被大腸桿菌RNA聚合酶有效轉錄的序列。

在細胞中存在T7RNA聚合酶和T7噬茵體啟動子的情形下，大腸桿菌宿主本身基因的轉錄競爭不過T7噬菌體轉錄體系，最終受T7噬菌體啟動子控制的基因的轉錄達到很高的水準。T7表達系統(tǒng)轉錄調(diào)控的機理

T7噬菌體啟動子的轉錄完全依賴於T7RNA聚合酶，因此T7RNA

聚合酶的轉錄調(diào)控模式就決定了表達系統(tǒng)的調(diào)控方式。

化學誘導型溫度誘導型雙質(zhì)粒系統(tǒng)T7RNA

聚合酶T7啟動子目的基因

T7RNA聚合酶基因？啟動子T7表達系統(tǒng)轉錄調(diào)控的機理

化學誘導型噬菌體DE3是

l噬菌體的衍生株，一段含有l(wèi)acI、lacUV5

啟動子和T7RNA聚合酶基因的

DNA片段被插入其

int基因中

用噬菌體DE3的溶源菌作為表達載體的宿主菌，調(diào)控方式為

化學誘導型，類似於Lac表達系統(tǒng)。

T7RNA聚合酶基因

lac

啟動子E.Coli（DE3）T7啟動子

目的基因T7RNA

聚合酶IPTG誘導T7表達系統(tǒng)轉錄調(diào)控的機理

溫度誘導型

PL

啟動子控制T7RNA聚合酶基因，通過熱誘導方式激發(fā)

T7噬菌體啟動子的轉錄。

這種方式可以使本底轉錄降到很低的水準，尤其適用於表達對大腸桿菌宿主有毒性的重組蛋白質(zhì)。

T7RNA聚合酶基因PL

啟動子E.Coli（CE6）T7啟動子

目的基因T7RNA

聚合酶熱誘導cI857T7表達系統(tǒng)轉錄調(diào)控的機理

雙質(zhì)粒系統(tǒng)一個質(zhì)粒帶有T7RNA聚合酶基因，另一個質(zhì)粒帶有T7啟動子和目的基因

兩個質(zhì)粒的複製子和抗性標記不能相同調(diào)控方式為控制T7RNA聚合酶的啟動子調(diào)控類型T7RNA

聚合酶熱誘導T7啟動子

目的基因

T7RNA聚合酶基因

PL

啟動子

cI857

p15Aori

KanRColE1ori

AmpRT7表達系統(tǒng)存在的問題

T7表達系統(tǒng)表達目的基因的水準是目前所有表達系統(tǒng)中最高的，但也不可避免出現(xiàn)在相對較高的本底轉錄，如果目的基因產(chǎn)物對大腸桿菌宿主有毒性，會影響細胞的生長。

解決辦法之一

在表達系統(tǒng)中低水準表達T7溶菌酶基因。因為T7溶菌酶除了作用於大腸桿菌細胞壁上肽聚糖外，還能與

T7RNA聚合酶結合抑制其轉錄的活性。目前T7溶菌酶基因都通過共轉化質(zhì)拉導入表達系統(tǒng)，它能明顯降低本底轉錄，但對誘導後目的基因的表達水準無明顯影響。

營養(yǎng)調(diào)控型採用大腸桿菌鹼性磷酸酯酶基因

phoA啟動子或甘油3’-磷酸轉移系統(tǒng)ugp

啟動子構建表達載體。

這兩個啟動子受在培養(yǎng)基中的無機磷（Pi）濃度調(diào)控（Pi﹥5mmol/L

時抑制，Pi﹤1mmol/L時啟動)，具有較高的轉錄水準。其他表達系統(tǒng)

糖原調(diào)控型採用的有大腸桿菌半乳糖轉移系統(tǒng)（mglBAEC)mgl啟動子或沙門氏菌阿拉伯糖基因araB啟動子構建表達載體。

這兩個啟動子受葡萄糖抑制，巖藻糖和阿拉伯糖是它們的誘導物。其調(diào)控機理類似於Lac表達系統(tǒng).其他表達系統(tǒng)pH調(diào)控型採用大腸桿菌賴氨酸脫羧酶基因cadA

啟動子構建表達載體。

cadA啟動子受培養(yǎng)基中H+濃度，即pH值調(diào)控。（在pH﹥8時抑制，pH﹤6時啟動，pH=6時轉錄活力最高）。

該表達系統(tǒng)要求菌體發(fā)酵溫度控制在27～30℃之間才能使目的基因得到穩(wěn)定的表達.其他表達系統(tǒng)溶氧調(diào)控型採用大腸桿菌丙酮酸甲酸裂解酶基因pfl

啟動子，硝基還原酶基因nirB啟動子或透明顫菌血紅蛋白基因

vgb

啟動子構建表達載體。這些啟動子中都含有對氧回應的調(diào)節(jié)因數(shù)fnr

的作用位點。

在富氧條件下轉錄被抑制，在貧氧或微氧條件下轉錄被啟動。其他表達系統(tǒng)溶氧調(diào)控型大腸桿菌GJ100有透明顫菌血紅蛋白基因（vgb）啟動子控制下的T7RNA聚合酶基因表達質(zhì)粒，vgb基因的轉錄是受環(huán)境溶氧濃度調(diào)控的，在貧氧條件下vgb基因的啟動子被啟動。

因此，用大腸桿菌GJ100作為宿主時，表達系統(tǒng)調(diào)控方式為貧氧誘導型，菌體發(fā)酵時的溶氧濃度可以通過控制攪拌轉速和通氣量加以調(diào)節(jié)，與其他調(diào)控模式相比更適合於產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)過程。其他表達系統(tǒng)生物素調(diào)控型

用大腸桿菌生物素操縱子及其調(diào)控區(qū)構建表達載體，菌體生長過程中生物素會不斷消耗，當濃度到達2ng/ml以下時啟動子被啟動。

能夠在沒有外界的物理，化學信號的介入條件下自動誘導表達目的基因是這類表達載體的特點，其缺陷是不容易精確控制自動誘導的時刻。其他表達系統(tǒng)強化轉錄終止的必要性

外源基因在強啟動子的控制下表達，容易發(fā)生轉錄過頭現(xiàn)象，即RNA聚合酶滑過終止子結構繼續(xù)轉錄質(zhì)粒上鄰近的DNA序列，形成長短不一的mRNA混合物過長轉錄物的產(chǎn)生在很大程度上會影響外源基因的表達，其原因如下：轉錄產(chǎn)物越長，RNA聚合酶轉錄一分子mRNA所需的時間就相應增加，外源基因本身的轉錄效率下降；如果外源基因下游緊接有載體上的其他重要基因或DNA功能區(qū)域，如選擇性標記基因和複製子結構等，則RNA聚合酶在此處的轉錄可能干擾質(zhì)粒的複製及其它生物功能，甚至導致重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性；過長的mRNA往往會產(chǎn)生大量無用的蛋白質(zhì)，增加工程菌無謂的能量消耗；更為嚴重的是，過長的轉錄物往往不能形成理想的二級結構，從而大大降低外源基因編碼產(chǎn)物的翻譯效率終止子強終止子的選擇與使用目前外源基因表達質(zhì)粒中常用的終止子是來自大腸桿菌rRNA操縱子上的rrnT1T2

以及T7噬菌體DNA上的Tf。

對於一些終止作用較弱的終止子，通?？梢話裼枚垠w終止子串聯(lián)的特殊結構，以增強其轉錄終止作用終止子核糖體結合位點外源基因在大腸桿菌細胞中的高效表達不僅取決於轉錄啟動的頻率，而且在很大程度上還與mRNA的翻譯起始效率密切相關。大腸桿菌細胞中結構不同的mRNA分子具有不同的翻譯效率，它們之間的差別有時可高達數(shù)百倍。

mRNA翻譯的起始效率主要由其5‘端的結構序列所決定，稱為核糖體結合位點（RBS）

核糖體結合位點核糖體結合位點大腸桿菌核糖體結合位點包括下列四個特徵結構要素：

位於翻譯起始密碼子上游的6–8個核苷酸序列

5’UAAGGAGG3’

即Shine-Dalgarno（SD）序列，它通過識別大腸桿菌核糖體小亞基中的16SrRNA3’端區(qū)域3’AUUCCUCC5’並與之專一性結合將mRNA定位於核糖體上，從而啟動翻譯；

翻譯起始密碼子，大腸桿菌絕大部分基因以AUG作為閱讀框架的起始位點，有些基因也使用GUG或UUG作為翻譯起始密碼子

SD序列與翻譯起始密碼子之間的距離及堿基組成基因編碼區(qū)5’端若干密碼子的堿基序列核糖體結合位點核糖體結合位點對外源基因表達的影響

SD序列的影響一般來說，mRNA與核糖體的結合程度越強，翻譯的起始效率就越高，而這種結合程度主要取決於SD（UAAGGAGG）序列與

16SrRNA的堿基互補性，其中以GGAG

四個堿基序列尤為重要。對多數(shù)基因而言，上述四個堿基中任何一個換成C或T，均會導致翻譯效率大幅度降低核糖體結合位點核糖體結合位點對外源基因表達的影響

SD序列與起始密碼子之間的序列的影響

SD序列下游的堿基若為AAAA或UUUU，翻譯效率最高；而

CCCC或GGGG的翻譯效率則分別是最高值的50%和25%。

緊鄰AUG的前三個堿基成份對翻譯起始也有影響。對於大腸桿菌b-半乳糖苷酶的mRNA而言，在這個位置上最佳的堿基組合是UAU或CUU，如果用UUC、UCA或AGG取代之，則酶的表達水準低20倍核糖體結合位點核糖體結合位點對外源基因表達的影響

SD序列與起始密碼子之間的距離的影響

SD序列與起始密碼子AUG

之間的精確距離保證了mRNA在核糖體上定位後，翻譯起始密碼子AUG正好處於核糖體複合物結構中的P位，這是翻譯啟動的前提條件。

在很多情況下，SD序列位於AUG之前大約七個堿基處，在此間隔中少一個堿基或多一個堿基，均會導致翻譯起始效率不同程度的降低核糖體結合位點核糖體結合位點對外源基因表達的影響

起始密碼子及其後續(xù)若干密碼子的影響大腸桿菌中的起始tRNA分子可以同時識別AUG、GUG和UUG

三種起始密碼子，但其識別頻率並不相同，通常GUG為AUG的

50%，而UUG只及AUG的25%。

除此之外，從AUG開始的前幾個密碼子堿基序列也至關重要，至少這一序列不能與mRNA的

5’端非編碼區(qū)形成莖環(huán)結構，否則便會嚴重干擾mRNA在核糖體上的準確定位

目前廣泛用於外源基因表達的大腸桿菌表達型質(zhì)粒上，均含有與啟動子來源相同的核糖體結合位點序列，序列和間隔是最佳的。核糖體結合位點

不同的生物，甚至同種生物不同的蛋白質(zhì)編碼基因，對簡並密碼子使用頻率並不相同，具有一定的偏愛性，其決定因素是：生物基因組中的堿基含量在富含AT的生物（如單鏈DNA噬菌體φX174）基因組中，密碼子第三位上的U和A出現(xiàn)的頻率較高；在GC豐富的生物（如鏈黴菌）基因組中，第三位上含有G或C的簡並密碼子占90%以上的絕對優(yōu)勢密碼子與反密碼子相互作用的自由能性中等強度規(guī)律如GGG、CCC、GCG、GGC、AAA、UUU、AUA、UAU等使用少如GUG、CAC、UCG、AGC、ACA、UGU、AUC、UUG等使用多細胞內(nèi)tRNA的含量密碼子生物體對密碼子的偏愛性密碼子密碼子偏愛性對外源基因表達的影響

由於原核生物和真核生物基因組中密碼子的使用頻率具有較大程大的差異性，因此外源基因尤其是高等哺乳動物基因在大腸桿菌中高效翻譯的一個重要因素是密碼子的正確選擇。

一般而言，有兩種策略可以使外源基因上的密碼子在大腸桿菌細胞中獲得最佳表達：

外源基因全合成同步表達相關tRNA編碼基因質(zhì)?？截悢?shù)質(zhì)?？截悢?shù)對細菌生長代謝的影響目前實驗室裏廣泛使用的表達型質(zhì)粒在每個大腸桿菌細胞中可達數(shù)百甚至上千個拷貝，質(zhì)粒的擴增過程通常發(fā)生在受體細胞的對數(shù)生長期內(nèi)，而此時正是細菌生理代謝最旺盛的階段。質(zhì)粒分子的過度增殖以及其後目的基因的高效表達勢必會影響受體細胞的生長代謝，進而導致重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性以及目的基因宏觀表達水準的下降

解決上述難題的一種有效策略是將重組質(zhì)粒的擴增納入可控制的軌道

外源基因在大腸桿菌中的表達蛋白質(zhì)的合成是在細胞之中進行的目標蛋白在細胞質(zhì)中表達的主要優(yōu)點是：表達質(zhì)粒的構建比較簡單；能夠達到很高的目標蛋白表達量，一般可以達到占細胞總蛋白的

20%～40%。目標蛋白在大腸桿菌系統(tǒng)表達的形式有二種：

在細胞內(nèi)表現(xiàn)為不溶性的包涵體顆粒

包涵體存在於大腸桿菌細胞質(zhì)中

在細胞內(nèi)表現(xiàn)為可溶性的蛋白質(zhì)

可溶性的目標蛋白質(zhì)除可存在於細胞質(zhì)中外，還可借助於本身的功能序列和大腸桿菌蛋白質(zhì)加工、運輸體系，最終分泌到周質(zhì)空間，或外泌到培養(yǎng)液中。大腸桿菌基因工程菌的構建策略

包涵體型異源蛋白的表達分泌型異源蛋白的表達融合型異源蛋白的表達寡聚型異源蛋白的表達整合型異源蛋白的表達蛋白酶抗性或缺陷型表達系統(tǒng)的構建外源基因在大腸桿菌中的表達包涵體及其性質(zhì)在某些生長條件下，大腸桿菌能積累某種特殊的生物大分子，它們緻密地集聚在細胞內(nèi)，或被膜包裹或形成無膜裸露結構，這種水不溶性的結構稱為包涵體（InclusionBodies，IB）。富含蛋白質(zhì)的包涵體多見於生長在含有氨基酸類似物培養(yǎng)基的大腸桿菌細胞中，由這些氨基酸類似物所合成的蛋白質(zhì)往往會喪失其理化特性和生物功能，從而集聚形成包涵體。由高效表達質(zhì)粒構建的大腸桿菌工程菌大量合成非天然性的同源或異源蛋白質(zhì)，後者在一般情況下也以包涵體的形式存在於細菌細胞內(nèi)。除此之外，包涵體中還含有少量的DNA、RNA和脂多糖等非蛋白分子包涵體型異源蛋白的表達以包涵體形式表達目的蛋白的優(yōu)缺點

包涵體表達形式的優(yōu)點在一定程度上保持表達產(chǎn)物的結構穩(wěn)定能夠避免細胞內(nèi)蛋白水解酶的作用，有利於目標蛋白的富集

簡化外源基因表達產(chǎn)物的分離操作包涵體的水難溶性及其密度遠大於其他細胞碎片和細胞成分，菌體經(jīng)超聲波裂解後，直接通過高速離心即可將重組異源蛋白從細菌裂解物中分離出來

能夠表達對大腸桿菌宿主有毒或有致死效應的目標蛋白。包涵體型異源蛋白的表達以包涵體形式表達目的蛋白的優(yōu)缺點

包涵體表達形式的缺點以包涵體形式表達的重組蛋白喪失了原有的生物活性，必須通過有效的變性複性操作，才能回收得到具有正確空間構象（因而具有生物活性）的目標蛋白，因此包涵體變複性操作的效率對目標產(chǎn)物的收率至關重要。

經(jīng)過複性處理的目標蛋白不一定能完全恢復原來的生物學活性，有時甚至完全得不到有活性的蛋白蛋，尤其當目標蛋白分子中的

Cys殘基數(shù)目較高時，體外複性蛋白質(zhì)的成功率相當?shù)停话悴怀^30%

複性處理工藝可使目標蛋白的製備成本上升。包涵體型異源蛋白的表達包涵體的變性與複性操作包涵體的溶解與變性包涵體的溶解與變性的主要任務是拆開錯配的二硫鍵和次級鍵。在人工條件下，使包涵體溶解並重新進入複性途徑中。

能有效促進包涵體溶解變性的試劑和條件包括：

清洗劑

SDS、正十二醇肌氨酸，廉價，但影響複性和純化

促溶劑鹽酸胍、尿素，前者昂貴，尿素便宜，但常被自發(fā)形成的氰酸鹽污染，後者能與多肽鏈中的氨基反應

混合溶劑如尿素與醋酸、二甲基碸等聯(lián)合使用，溶解力增強

極端pH

廉價，但許多蛋白質(zhì)在極端pH條件下發(fā)生修飾反應包涵體型異源蛋白的表達包涵體的變性與複性操作

包涵體的複性與重折疊（refolding）包涵體的複性與重折疊的主要任務：將多肽鏈中被拆開的游離巰基重新折疊通過次級鍵的形成使蛋白質(zhì)複性包涵體型異源蛋白的表達在細胞內(nèi)表現(xiàn)為可溶性的蛋白質(zhì)

目標蛋白以可溶性蛋白質(zhì)形式表達雖然可以避免包涵體複性帶來的問題，但是也有一定的缺陷，主要表現(xiàn)為大腸桿菌本身存在於細胞質(zhì)中的蛋白質(zhì)往往只含有少量的，甚至沒有半胱氨酸殘基。富含半胱氨酸殘基，需要形成二硫鍵的蛋白質(zhì)大部份被轉運到細胞的其他部位。

分泌型異源蛋白的表達

這是因為大腸桿菌細胞質(zhì)微環(huán)境的氧化還原態(tài)勢不利於蛋白質(zhì)二硫鍵的形成，而且缺少一種形成二硫鍵所必須的體系。一些需要通過二硫鍵的形成來維持其構象的目標蛋白在大腸桿菌的細胞質(zhì)中往往不能正確折疊。解決這一問題的途徑之一是用大腸桿菌氧硫還蛋白還原酶基因trxB缺陷株作為宿主菌表達目標蛋白。研究表明trxB缺陷株細胞質(zhì)的氧化還原態(tài)勢發(fā)生了變化，蛋白質(zhì)在trxB缺陷株的細胞質(zhì)中能夠形成二硫鍵。這一菌株對於表達結構複雜的蛋白質(zhì)而言是一·個相當重要的工具。分泌型異源蛋白的表達在細胞質(zhì)中直接表達不帶有前導序列的成熟蛋白質(zhì)

在細胞質(zhì)中直接表達不帶有前導序列的成熟蛋白質(zhì)需要起始密碼，通常為編碼甲硫氨酸的ATG。⑴在多數(shù)情況下，N端附加的甲硫氨酸對蛋白質(zhì)的性質(zhì)沒有特別的影響，但是也有附加的甲硫氨酸嚴重影響蛋白質(zhì)生物學活力的報導。⑵另外，附加的甲硫氨酸也可能改變蛋白質(zhì)的免疫性質(zhì)和藥理性質(zhì)。從製備用於醫(yī)療目的的蛋白質(zhì)的角度來看，這是一個需要引起重視的問題。

去除附加的甲硫氨酸有二種方法：

⑴在表達系統(tǒng)中共表達甲硫氨酸氨肽酶基因。⑵在分離純化後在體外用外肽酶處理。但它們都對與甲硫氨酸相鄰的氨萊酸殘基類型有一定要求，因此在使用上有一定的限制。目標蛋白與有親合配基的序列融合表達

與純化包涵體相比，細胞質(zhì)中以可溶性形式表達蛋白質(zhì)的分離純化過程比較複雜，一般要通過親合層析才能達到比較高的純度。目標蛋白與有親合配基的序列融合表達既可以提高分離純化的效率，又能在融合蛋白切離的過程中得到?jīng)]有附加甲硫氨酸目標蛋白。金黃色葡萄球菌蛋白G、A和衍生物Z，日本血吸蟲穀胱甘肽-S-轉移酶，大腸桿菌麥芽糖結合蛋白，His-tag等是目前常用的與目標基因融合表達的序列。目標蛋白在周質(zhì)空間中表達目標蛋白在周質(zhì)空間中表達的優(yōu)點⑴大腸桿菌周質(zhì)空間中自身蛋白質(zhì)的數(shù)量約為100種，只占菌體總蛋白數(shù)量的4%。蛋白水解酶的含最與在細胞質(zhì)中相比也少得多，因此目標蛋白在周質(zhì)空間中表達有利於分離純化和減少蛋白水解酶的降解。⑵目標蛋白從細胞質(zhì)轉運到周質(zhì)空間過程中信號肽被加工切除，有效地避免了N端附加的甲硫氨酸的產(chǎn)生。⑶周質(zhì)空間中呈氧化型的氧化還原態(tài)勢使目標蛋白能夠較好折疊，維持正確的構象。目標蛋白外泌表達

把所表達的目標蛋白外泌到細胞外的培養(yǎng)基中可以進一步減少蛋白水解酶的降解，也有利於分離純化。目前成功的例子主要是採用以下方案:

（1）與大腸桿菌本身的外泌蛋白基因融合表達（2）與一些能提高細胞外膜通透性的因數(shù)融合或共表達（3）改變培養(yǎng)基的成分歸納現(xiàn)有的研究結果顯示這些方法僅對外泌分子量較小的蛋白有效，而且外泌效率一般都比較低。四、高效表達目標基因的戰(zhàn)略和技術表達質(zhì)粒的優(yōu)化和設計共表達大腸桿菌稀有密碼子tRNA基因提高目標基因mRNA和目標基因產(chǎn)物的穩(wěn)定性高密度發(fā)酵和工程化宿主細胞四、高效表達目標基因的戰(zhàn)略和技術表達質(zhì)粒的優(yōu)化和設計在各種表達載體中，啟動子和SD序列的下游都設計了一段含有各種限制性酶切位點的序列，用於目標基因的插入。這一插入位點附近的序列將成為核糖體結合位點的一部分，因此它對於構建高效表達質(zhì)粒是至關重要的。由於每一個基因都具有各自獨特的5’端結構，最終構建成的各種表達質(zhì)粒所具有的核糖體結合位點是一個變數(shù)。四、高效表達目標基因的戰(zhàn)略和技術表達質(zhì)粒的優(yōu)化和設計

構建表達質(zhì)粒時首先要考慮使目標基因的翻譯起始密碼ATG與SD序列之間的距離和堿基組成處於一個適當?shù)墓爣鷥?nèi)。核糖體結合位點序列的變化對mRNA的翻譯效率有顯著影響，具體表現(xiàn)為：

SD序列UAAGGAGG的翻譯效率要比AAGGA高3～6倍翻譯起始密碼ATG與UAAGGAGG的最適距離是6～8個堿基長度，與AAGAA的最適距離是5～7個堿基長度

ATG與UAAGGAGG至少相隔3～4個堿基，與AAGAA至少相隔5

個堿基；mRNA的翻譯才能進行

ATG與SD序列之間的堿基組成為A，T堿基豐富時，mRNA翻譯效率較高。

核糖體結合位點本身和附近的序列決定了目標基因mRNA5’端的二級結構，研究表明討mRNA5’端形成的“莖環(huán)”結構阻礙了mRNA與核糖體30S亞基的結合，從而抑制了翻譯的起始。儘量提高核糖體結合位點本身和附近的序列中A/T堿基的含量，降低mRNA5’端形成的“莖環(huán)”結構的可能性，也是構建表達質(zhì)粒時需要注意的事項。在必要的情況下，還可通過定點突變，PCR等技術改變個別關鍵的堿基來破壞mRNA5’端的“莖環(huán)”結構。把目標基因設計成多順反子結構，在大腸桿菌本身的高效翻譯起始元件後加上第二個SD序列和目標基因，一起插入表達載體。這一方法通常適用於目標基因5’端序列容易形成二級結構，而又不宜改變其序列的情形下表達質(zhì)粒的優(yōu)化和設計

在構建表達質(zhì)粒時，充分利用各個基因的結構特徵和特點，注意引入翻譯增強子序列

能提高mRNA翻譯效率的特殊核苷酸序列，稱為翻譯增強子。

四、高效表達目標基因的戰(zhàn)略和技術共表達大腸桿菌稀有密碼子tRNA基因

表達水準高的基因呈現(xiàn)的密碼子偏愛性高於表達水準低的基因?，F(xiàn)已闡明的在大腸桿菌中的稀有密碼子有：編碼Arg的密碼子AGA、AGG、CGA、CGG

編碼Pro的密碼子CCC、CCU、CCA

編碼Cys的密碼子UGU、UGC;

編碼Gly的密碼子GGA、GGG

編碼Leu的密碼子CUA、CUC

編碼Ile的密碼子AUA

編碼Ser的密碼子UCA、AUG、UCG、UCC

編碼Thr的密碼子ACA四、高效表達目標基因的戰(zhàn)略和技術共表達大腸桿菌稀有密碼子tRNA基因

由於同義密碼子的使用頻率與細胞內(nèi)對應的tRNA的豐度有正比關係稀有密碼子對應的tRNA的豐度很低，有可能在翻譯過程中發(fā)生中止和移碼突變。

解決這一問題的辦法：通過基因突變把稀有密碼子改變?yōu)槠渌褂妙l率高的同義密碼子。在表達系統(tǒng)中共表達稀有密碼子tRNA基因，以提高大腸桿菌細胞內(nèi)稀有密碼子tRNA的豐度四、高效表達目標基因的戰(zhàn)略和技術

在所有的大腸桿菌稀有密碼子tRNA中，tRNAArg(AGG/AGA)含量最少，而AGG和AGA密碼子在真核基因中經(jīng)常出現(xiàn)。人尿激酶原ProUK，新型組織纖溶酶原啟動劑NTA等基因中都含有較多的AGG和AGA密碼子，在大腸桿菌中直接表達的水準很低，但在大腸桿菌中共表達tRNAArg(AGG/AGA)基因argU後，這些基因的表達水準能明顯得到提高?，F(xiàn)在還沒有一個固定規(guī)則來判定稀有密碼子的存在是否確實會對翻譯過程產(chǎn)生明顯的不利影響。因為稀有密碼子存在的位置、分佈的均勻性、mRNA的二級結構的不同決定了它對翻譯過程的影響是有差別的。所有的結論要通過實驗才能得出。四、高效表達目標基因的戰(zhàn)略和技術提高目標基因mRNA和目標基因產(chǎn)物的穩(wěn)定性由於大腸桿菌防禦體系的自身保護作用，大腸桿菌中的核酸酶和蛋白水解酶能夠降解目標基因mRNA和目標基因產(chǎn)物，這種降解作用程度對不同的基因或蛋白質(zhì)而言是不同的，具有一定的專一性和選擇性。四、高效表達目標基因的戰(zhàn)略和技術蛋白水解酶的特點細胞質(zhì)是蛋白水解酶含量最多的區(qū)域，目標蛋白在細胞質(zhì)中最容易受到蛋白水解酶的作用。通過對已知大腸桿菌細胞內(nèi)半衰期的蛋臼質(zhì)的統(tǒng)計學分析，發(fā)現(xiàn)N末端為Arg、Lys、Leu、Phe、Tyr、Trp殘基的蛋白質(zhì)，含有ProGlu、Ser、Thr豐富區(qū)的蛋白質(zhì)容易降解，穩(wěn)定性較差。

在細胞內(nèi)有多肽碎片、突變的異常蛋白和外界物理因素的刺激的條件下，大腸桿菌細胞內(nèi)的蛋白水解酶活力往往能達到比較高的水準。四、高效表達目標基因的戰(zhàn)略和技術提高目標蛋白的穩(wěn)定性的措施主要有：利用蛋白轉運系統(tǒng)把目標蛋白最終累積在周質(zhì)空間，或分泌到培養(yǎng)基中採用缺乏某些蛋白水解酶基因的缺陷株作為宿主菌。對分子量較小的目標基因進行融合表達或串聯(lián)聚合表達。共表達能提高特定目標蛋白穩(wěn)定性的輔助因數(shù)，如分子伴侶基因。對蛋白質(zhì)序列中的蛋白水解酶敏感區(qū)域和識別位點進行改造。在較低的溫度下培養(yǎng)菌體和優(yōu)化發(fā)酵條件。四、高效表達目標基因的戰(zhàn)略和技術

但必須指出的是，由於目標蛋白本身的性質(zhì)和用途的不同，上述幾種方法在使用上是受到一定的限制的。主要表現(xiàn)為：大腸桿菌對分子量較大的目標蛋白的較運和分泌效率一般比較低，不能滿足大規(guī)饃製備的需要。蛋白水解酶含量低的菌株往往代謝不旺盛，生長速率慢，使高密度發(fā)酵比較困難。融合表達使目標蛋白的構象與天然狀態(tài)不一樣，導致生物比活力降低，甚至沒有活性。融合蛋白和串聯(lián)聚合蛋白需要用酶或化學的方法切割出單體目標蛋白。酶法成本比較高且加入的酶蛋白還必須分離去除。化學法比酶法成本低，但不少裂解試劑有毒性。對蛋白質(zhì)序列進行改造需要有基本的蛋白質(zhì)結構數(shù)據(jù)，而目前這方面的資料庫還不完整。四、高效表達目標基因的戰(zhàn)略和技術高密度發(fā)酵和工程化宿主細胞大腸桿菌高密度發(fā)酵是大規(guī)模製備重組蛋白質(zhì)過程中不可缺少的工藝步驟。其目的是在單個菌體對目標基因的表達水準基本不變的前提下，通過單位體積的菌體數(shù)量的成倍增加來實現(xiàn)總表達量的提高。目前常用的發(fā)酵方式有：恒定培養(yǎng)、流加補料培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)三種

構建出產(chǎn)乙酸能力低的工程化宿主菌

高密度發(fā)酵後期由於菌體的生長密度較高，培養(yǎng)基中的溶氧飽和度往往比較低，氧氣的不足導致菌體生長速率降低和乙酸的累積，乙酸的存在對目標基因的高效表達有明顯的阻抑作用。這是高密度發(fā)酵工藝研究中最迫切需要解決的問題。雖然在發(fā)酵過程中可採取通氧氣，提高攪拌速度，控制補料速度等措施來控制溶氧飽和度，減少乙酸的產(chǎn)生。但從實際應用上看，這些措施都有一定的滯後效應，難以做到比較精確的控制。因此構建出產(chǎn)乙酸能力低的工程化宿主菌，是從恨本上解決問題的途徑之一。四、高效表達目標基因的戰(zhàn)略和技術

利用透明顫菌血紅蛋白能提高大腸桿菌在貧氧條件下對氧的利用率的生物學性質(zhì)，把透明顫菌血紅蛋白基因vgb

導入大腸桿菌細胞內(nèi)以增加其對溶氧的寬容度。從而降低菌體產(chǎn)生乙酸所要求的溶氧飽和度閥值。用基因敲除技術缺失大腸桿菌的磷酸轉乙醯酶基因pta1

和乙酸激酶基因ackA，使從丙酮酸到乙酸的合成途徑被阻斷。改變代謝流的方向，通過共轉化把枯草桿菌、釀酒酵母的乙醯乳酸合成酶基因alsS，單胞菌的丙酮酸脫羧酶基因pdc1和乙醇脫氫酶基因adh2導入大腸桿菌，使丙酮酸的代謝有選擇地向生成3‘-羥基丁酮或乙醇的方向進行。四、高效表達目標基因的戰(zhàn)略和技術構建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌對於以可溶性或分泌形式表達的目標蛋日而言，隨著發(fā)酵後期各種蛋白水解酶的累積，目標蛋白會遭到蛋白水解酶的作用而被降解。為了使對蛋白水解酶比較敏感的目標蛋白也能獲得較高水準的表達，需要構建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌。

rpoH基因編碼大腸桿菌RNA聚合酶的r32亞基，r32亞基對大腸桿菌中多種蛋白水解酶的活力有正調(diào)控作用。rpoH基因缺陷的突變株己經(jīng)被構建，研究結果表明它能明顯提高目標基因的表達水準。到目前為止，已知的大腸桿菌蛋白水解酶基因缺陷的突變株都巳被獲得，其中一部分具有實際應用的潛力。四、高效表達目標基因的戰(zhàn)略和技術五、大腸桿菌表達系統(tǒng)研究的發(fā)展趨勢構建各種表達載體

建立新的表達系統(tǒng)

目前研究的重點完善現(xiàn)有的表達系統(tǒng)，解決表達系統(tǒng)中還存在的缺陷等方面。這些研究工作主要包括:

重組蛋白質(zhì)的正確折疊、構象形成和分泌菌體表面表達技術及其應用重組蛋白質(zhì)修飾加工研究共表達與蛋白質(zhì)折疊過程密切相關的分子伴侶包涵體是由於在新合成的大量目標蛋白質(zhì)的折疊過程中，大腸桿菌細胞內(nèi)參與折疊的蛋白因數(shù)的量不能滿足需要，無法形成正確的構象而產(chǎn)生的，因此在大腸桿菌內(nèi)共表達與蛋白質(zhì)折疊過程密切相關的分子伴侶，折疊酶或硫氧還蛋白基因可以使目標基因可溶性表達的比例明顯上升。

研究表明這種作用是具有專一性的，不同的目標蛋白需要不同類型的蛋白因數(shù)共表達。在有些情況下需要有多個蛋白因數(shù)共表達才能達到預期的目標。五、大腸桿菌表達系統(tǒng)研究的發(fā)展趨勢共表達人或小鼠的二硫鍵異構酶、促進二硫鍵形成和正確折疊大腸桿菌周質(zhì)空間通過二硫鍵形成酶

DsbA和DsbB二個蛋白維持適當?shù)难趸€原態(tài)勢使蛋白質(zhì)的二硫鍵形成。

共表達人或小鼠的蛋白質(zhì)二硫鍵異構酶（PDl）

PDl能互補dsbA缺陷株，但在dsbB缺陷株中PDl失去原有的功能;PDl對目標蛋白的二硫鍵形成和正確折疊的促進作用可以受到穀胱甘肽的調(diào)節(jié)。

PDI具有的二硫鍵異構，交換功能有效地彌補了DsbA和DsbB

功能上的不足，從而提高了目標蛋白正確折疊的比例。五、大腸桿菌表達系統(tǒng)研究的發(fā)展趨勢降低蛋白質(zhì)合成的速率，從而增加正確折疊重組蛋白質(zhì)從

phoA基因合成速率低的突變株中發(fā)現(xiàn)其分泌在周質(zhì)空間的phoA基因的產(chǎn)物------鹼性磷酸酯酶比野生型菌株有顯著增加，由於只有構象正確的酶原才能被大腸桿菌蛋白轉運系統(tǒng)識別和分泌，這一結果表明了目標蛋白合成的速率能對其構象形成正確與否產(chǎn)生影響。

採用較弱的啟動子或部分誘導強啟動子的方法可降低蛋白質(zhì)合成的速率，從而達到增加正確折疊重組蛋白質(zhì)的目的。五、大腸桿菌表達系統(tǒng)研究的發(fā)展趨勢改造信號肽的序列和結構，提高分泌效率

改造信號肽的序列和結構，提高分泌效率比較成功的例子是發(fā)現(xiàn)了把鹼性磷酸酯酶基因phoA信號肽的疏水區(qū)置換為多聚Leu殘基能明顯提高分泌效率。表明信號肽核心部位疏水性的增強有利於它與細胞膜的相互作用。這一結果為天然信號肽優(yōu)化改造的設計提供了很好的參考依據(jù)。五、大腸桿菌表達系統(tǒng)研究的發(fā)展趨勢大腸桿菌表面表達技術的建立膜蛋白基因在大腸桿菌中表達的技術逐漸成為研究的熱點領域，膜蛋白表達技術的發(fā)展促進了大腸桿菌表面表達技術的建立。

外源蛋白質(zhì)在菌體表面表達的優(yōu)點是大腸桿菌可直接用於製備疫苗，進行生物催化和作為探針篩選藥物。在一定程度上能與噬菌體展示系統(tǒng)相媲美。五、大腸桿菌表達系統(tǒng)研究的發(fā)展趨勢大腸桿菌表面表達技術的建立主要通過三條途徑使目標蛋白呈現(xiàn)在菌體表面:

把外源序列插入LamB、OmpA、PhoE等外膜蛋白的膜外區(qū)

把外源蛋白導入大腸桿菌鞭毛或傘毛的結構中

這二種方法適合表達一段長度小於100個氨基酸殘基的外源序列，因為較大的外源序列的插入往往會使外膜蛋白不能形成原來的三維結構，影響它轉運過程和在膜上的定位。

在脂蛋白、IgA蛋白酶、ompA基因的N端或C端融合外源基因這種融合表達的方法對外源基因的限制條件就比較小，其序列可在

50到500氨基酸殘基長度的範圍內(nèi)。五、大腸桿菌表達系統(tǒng)研究的發(fā)展趨勢一、培養(yǎng)基的基本要求

營養(yǎng)成分促生長因數(shù)激素滲透壓

pH

無毒、無污染1.

營養(yǎng)成分

氨基酸氨基酸是細胞合成蛋白質(zhì)的原料。所有細胞都需要12種必須氨基酸：

纈、亮、異亮、蘇、賴、色、苯丙、蛋、組、酪、精、胱。此外還需要穀氨醯胺，它在細胞代謝過程中有重要作用，所含的氮是核酸中嘌呤和嘧啶合成的來源，同樣也是合成三、二、一磷酸醯苷所需要的基本物質(zhì)。

單糖

培養(yǎng)中的細胞可以進行有氧與無氧酵解，六碳糖是主要能源。此外六碳糖也是合成某些氨基酸、脂肪、核酸的原料。細胞對葡萄糖的吸收能力最高，半乳糖最低。一、培養(yǎng)基的基本要求1.

營養(yǎng)成分

維生素：

主要是輔酶、輔基，必不可少。生物素、葉酸、煙醯胺、泛酸、吡哆醇、核黃素、硫胺素、維生素B12都是培養(yǎng)基常有的成分。

無機離子與微量元素

細胞生長除需要鈉、鉀、鈣、鎂、氮、磷等基本元素，還需要微量元素，如鐵、鋅、硒、銅、錳、鉬、釩等。一、培養(yǎng)基的基本要求2.

促生長因數(shù)及激素

各種激素、生長因數(shù)的功能維持細胞的功能保持細胞的狀態(tài)（分化或未分化）

有些激素對許多細胞生長有促生長作用，如胰島素，它能促進細胞利用葡萄糖和氨基酸。

有些激素對某一類細胞有明顯促進作用，如氫化可的松可促進表皮細胞的生長，泌乳素有促進乳腺上皮細胞生長作用等。一、培養(yǎng)基的基本要求3.

滲透壓

細胞必須生活在等滲環(huán)境中，大多數(shù)培養(yǎng)細胞對滲透壓有一定耐受性人血漿滲透壓290mOsm/kg，可視為培養(yǎng)人體細胞的理想滲透壓鼠細胞滲透壓在320mOsm/kg左右。大多數(shù)哺乳動物細胞，滲透壓在260～320mOsm/kg的範圍都適宜一、培養(yǎng)基的基本要求4.

pH

大多數(shù)細胞適宜pH為7.2～7.4

培養(yǎng)基應具一定的緩衝能力

造成pH波動主要是代謝產(chǎn)生的

CO2，在封閉式培養(yǎng)過程中CO2

與水結合產(chǎn)生碳酸，培養(yǎng)基pH很快下降。

為解決這一問題，合成培養(yǎng)基中使用了NaHCO3-CO2

緩衝系統(tǒng)，通過穩(wěn)定調(diào)節(jié)溫箱中CO2

濃度（5％），使之與培養(yǎng)基中的NaHCO3

處於平衡狀態(tài)一、培養(yǎng)基的基本要求5.

無毒、無污染體外生長的細胞對微生物及一些有害有毒物質(zhì)沒有任何抵抗能力，因此培養(yǎng)基應達到

無化學物質(zhì)污染無微生物污染（如細菌、真菌、支原體、病毒等）無對細胞產(chǎn)生損傷作用的生物活性物質(zhì)污染（如抗體、補體）對於天然培養(yǎng)基，污染主要來源於取材過程及生物材料本身，應當嚴格選材，嚴格操作。對於合成培養(yǎng)基，污染主要來源於配製過程，配製所用的水，器皿應十分潔淨，配製後應嚴格過濾除菌。一、培養(yǎng)基的基本要求天然培養(yǎng)基血清的種類血清的主要成分和作用血清的品質(zhì)標準血清的外觀血清的使用與儲存使用血清的優(yōu)缺點二、天然培養(yǎng)基

天然培養(yǎng)基

天然培養(yǎng)基是指來自動物體液或利用組織分離提取的一類培養(yǎng)基，如血漿、血清、淋巴液、雞胚浸出液等。

但是由於天然培養(yǎng)基製作過程複雜、批間差異大，因此逐漸為合成培養(yǎng)基所替代。

目前廣泛使用的培養(yǎng)基是血清，另外各種組織提取液、促進細胞貼壁的膠原類物質(zhì)在培養(yǎng)某些特殊細胞也是必不可少。二、天然培養(yǎng)基

血清的種類

小牛血清

取自出生10～30天的小牛新牛血清

取自出生24小時之內(nèi)的新生牛胎牛血清

取自剖腹產(chǎn)的胎牛，血清中所含的抗體、補體等對細胞有害的成分最少二、天然培養(yǎng)基

二、天然培養(yǎng)基

血清的主要成分和作用

主要成分血清是由血漿去除纖維蛋白而形成的，血清中含有各種血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生長因數(shù)、激素、無機物等

主要作用

提供基本營養(yǎng)物質(zhì)

提供激素和各種生長因數(shù)

提供結合蛋白

對培養(yǎng)中的細胞起到某些保護作用

血清的品質(zhì)標準

血清品質(zhì)高低取決於兩方面因素：一是取材對象，二是取材過程。

理化性質(zhì)

滲透壓、pH值、蛋白電泳圖譜、蛋白含量、激素水準、內(nèi)毒素等。

蛋白含量包括血清總蛋白含量（不低於35-45g/L）、球蛋白含量（應小於20g/L)、血紅蛋白含量等。其中球蛋白含量是一項非常重要的指標，血清中球蛋白主要是抗體，球蛋白含量越低血清品質(zhì)越高。血紅蛋白也是越低越好。二、天然培養(yǎng)基

血清的品質(zhì)標準

微生物檢測包括細菌、真菌、支原體、病毒等。特別是對支原體、病毒的檢測支原體是一種很小的微生物，可通過孔徑22mm的濾膜。支原體、病毒污染在光學顯微鏡下難於察覺，細胞也能生長繁殖，但會影響實驗結果。檢測支原體的方法很多，如培養(yǎng)法、PCR法、螢光染色法、電鏡觀察法等。二、天然培養(yǎng)基血清的品質(zhì)標準

促生長效果

這是血清重要的特性之一，應以培養(yǎng)的細胞來檢測

克隆形成率懸浮生長的細胞，有限稀釋法，統(tǒng)計克隆生長百分比

貼瓶率測定

貼壁細胞，集落數(shù)占接種細胞數(shù)的百分比續(xù)傳代培養(yǎng)

細胞培養(yǎng)七天收集細胞，計數(shù)，取平均值。連續(xù)測試三個週期以上，觀察細胞生長狀況。二、天然培養(yǎng)基血清的外觀好的血清應該是透明清亮，土黃色或棕黃色，無沉澱或極少沉澱，比較粘稠。如血清渾濁、不透明、含許多沉澱物，說明血清污染或血清中的蛋白質(zhì)變性。若血清呈棕紅色，說明血清中的血紅蛋白含量太高，取材時有溶血現(xiàn)象搖晃時感覺液體稀薄，說明血清中摻入的生理鹽水太多。二、天然培養(yǎng)基血清的使用與儲存

使用前處理

滅活處理，即56℃30分鐘。滅活的目的使去除血清中的補體成分。

儲存條件血清一般儲存在-20℃，同時應避免反復凍融。購買大包裝的血清後首先要滅活處理，然後分裝成小包裝，儲存於-20℃，使用前融化。融化時最好現(xiàn)置於4℃。融化後的血清在4℃不宜長時間存放，應盡快使用。

使用濃度自從有了合成培養(yǎng)基，血清就是作為一種添加成分與合成培養(yǎng)基混合使用，使用濃度一般為5～20％，最常用是10％。二、天然培養(yǎng)基二、天然培養(yǎng)基使用血清的優(yōu)缺點牛血清的優(yōu)點

來源充足製備技術成熟經(jīng)過長時間的應用考驗人們對其有比較深入的理解細胞培養(yǎng)中使用血清的缺點改變某種細胞在體內(nèi)的正常狀態(tài)

含有一些對細胞會產(chǎn)生毒性的物質(zhì)

每批血清都有差別，其成分不能保持一致取材過程有可能帶入支原體、病毒三、合成培養(yǎng)基

基本培養(yǎng)基如何選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)基的配製無血清培養(yǎng)基無蛋白培養(yǎng)基限定化學成分培養(yǎng)基三、合成培養(yǎng)基

合成培養(yǎng)基是人工設計、配製的培養(yǎng)基。早期組織培養(yǎng)是利用天然培養(yǎng)基，目前合成培養(yǎng)基已經(jīng)成為一種標準化的商品，從最初的基本培養(yǎng)基發(fā)展到無血清培養(yǎng)基、無蛋白培養(yǎng)基，並且還在不斷發(fā)展。合成培養(yǎng)基的出現(xiàn)極大的促進了組織培養(yǎng)技術的普及發(fā)展?；九囵B(yǎng)基

基本組分

無機鹽

CaCl2、KCl、MgSO4、NaCl、NaHCO3、NaH2PO4

氨基酸

纈、亮、異亮、蘇、賴、色、苯丙、蛋、組、酪、精、胱(L型)

維生素

偏多酸鈣、氯化膽鹼、葉酸、肌醇、煙醯胺、吡哆醛、核黃素

硫胺素