豬Toll樣受體9基因胞外區(qū)的克隆及其原核表達(dá)

摘要：Toll樣受體9（TLR9）是一種重要的免疫感應(yīng)受體，參與了機(jī)體對DNA病原體免疫應(yīng)答的調(diào)控。為了進(jìn)一步研究豬TLR9的分子結(jié)構(gòu)與功能，本研究通過基因克隆技術(shù)成功獲得了豬TLR9基因的胞外區(qū)序列，并進(jìn)行了原核表達(dá)實(shí)驗(yàn)。研究結(jié)果表明，克隆所得的豬TLR9基因的胞外區(qū)序列長度為791bp，編碼了263個(gè)氨基酸。原核表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，豬TLR9胞外區(qū)蛋白能夠成功表達(dá)并形成可溶性蛋白。本研究的結(jié)果為進(jìn)一步研究豬TLR9的功能提供了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：Toll樣受體9；基因克?。话鈪^(qū)；原核表達(dá)

引言

免疫系統(tǒng)是機(jī)體對抗外來病原體入侵的重要防線，其中Toll樣受體9(TLR9)在機(jī)體免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要的作用。TLR9是一種類型I跨膜受體，在內(nèi)源性DNA被釋放出來時(shí)，能夠啟動免疫應(yīng)答，進(jìn)而調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。豬作為重要的經(jīng)濟(jì)動物，其免疫系統(tǒng)的研究對于動物養(yǎng)殖和人類健康具有重要的意義。然而，關(guān)于豬TLR9的研究仍然相對有限。為了進(jìn)一步了解豬TLR9的分子結(jié)構(gòu)和功能，本研究通過基因克隆技術(shù)成功獲得了豬TLR9基因的胞外區(qū)序列，并進(jìn)行了原核表達(dá)實(shí)驗(yàn)。

材料與方法

1.材料

本研究使用3個(gè)月大的健康豬作為實(shí)驗(yàn)材料，其血液和組織樣品用于提取RNA。pMD19-T載體和大腸桿菌DH5α菌株分別用于基因克隆和質(zhì)粒擴(kuò)增。大腸桿菌BL21（DE3）菌株用于原核表達(dá)。

2.基因克隆

從豬血液中提取總RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)合成cDNA?；谝延械呢iTLR9基因序列設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物通過電泳分離后回收并進(jìn)行純化。將純化的PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T載體上，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α菌株中，通過PCR檢測鑒定陽性克隆。最后，經(jīng)測序驗(yàn)證正常序列并獲取豬TLR9基因胞外區(qū)序列。

3.原核表達(dá)

將克隆所得的豬TLR9基因胞外區(qū)序列插入到原核表達(dá)載體pET28a(+)中，獲得重組質(zhì)粒。質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21（DE3）菌株中，通過IPTG誘導(dǎo)蛋白的表達(dá)。菌液經(jīng)離心收集，蛋白在SDS凝膠中進(jìn)行電泳分離，并進(jìn)行Westernblot檢測。

結(jié)果

通過基因克隆技術(shù)成功獲得了豬TLR9基因的胞外區(qū)序列，該序列長度為791bp，編碼了263個(gè)氨基酸。原核表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，豬TLR9胞外區(qū)蛋白所形成的蛋白帶與預(yù)期大小相符，并且能夠成功表達(dá)并形成可溶性蛋白。

討論

本研究成功克隆了豬TLR9基因的胞外區(qū)序列，并在原核表達(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá)了豬TLR9胞外區(qū)蛋白。研究結(jié)果表明，在大腸桿菌中，豬TLR9胞外區(qū)蛋白能夠形成可溶性蛋白。這為進(jìn)一步研究豬TLR9的功能提供了基礎(chǔ)。

結(jié)論

通過基因克隆技術(shù)，本研究成功獲得了豬TLR9基因的胞外區(qū)序列，并在原核表達(dá)系統(tǒng)中獲得豬TLR9胞外區(qū)蛋白的表達(dá)。該研究結(jié)果為進(jìn)一步研究豬TLR9的結(jié)構(gòu)與功能提供了基礎(chǔ)，對于研究豬免疫系統(tǒng)和提高豬生產(chǎn)性能具有重要意義。但是，研究中的結(jié)果尚未進(jìn)一步驗(yàn)證豬TLR9胞外區(qū)蛋白的免疫活性，需要進(jìn)一步研究以揭示其在免疫應(yīng)答中的具體作用機(jī)制綜上所述，本研究成功克隆并表達(dá)了豬TLR9基因的胞外區(qū)蛋白，該蛋白在大腸桿菌中形成可溶性蛋白。這為深入研究豬TLR9的功能提供了基礎(chǔ)，有助于進(jìn)一步了解豬免疫系